Articles

The glutamate/cystine xCT antagonizuje metabolizm glutaminy i zmniejsza elastyczność składników odżywczych

29 kwietnia, 2021 by admin

A haploidalny genetyczny screen dla zależności od glukozy

Wiele immortalizowanych linii komórkowych wykazuje ograniczoną elastyczność odżywczą i jest wysoce zależnych od glukozy jako podstawowego źródła węgla. Stwierdziliśmy, że przeżycie ludzkiej haploidalnej linii komórkowej Hap1 wymaga glukozy w medium hodowlanym. Aby zidentyfikować czynniki zaangażowane w takie „uzależnienie od glukozy”, przeprowadziliśmy genetyczny screen15 haploidów w celu wyizolowania mutantów, które przeżywają w całkowitym braku glukozy. Losowo zmutowaliśmy 1 × 108 komórek Hap1 z niską mnogością infekcji za pomocą retrowirusowego wektora pułapki genowej16 i hodowaliśmy zmutowaną populację w pożywce z niedoborem glukozy przez 12 dni. Po śmierci większości (>99%) komórek, komórki odporne na pozbawienie glukozy zostały odzyskane i rozszerzone w pożywce bogatej w składniki odżywcze. Miejsca insercji genów z opornej populacji zidentyfikowano za pomocą sekwencjonowania Illumina opartego na odwrotnej reakcji PCR17. W wybranej populacji, geny SLC3A2/4F2hc (399 różnych insercji) i xCT/SLC7A11 (39 insercji) zostały uszkodzone z dużą częstotliwością przez retrowirusową integrację (Rys. 1a). Co niezwykłe, wiadomo, że produkty białkowe tych genów fizycznie oddziałują ze sobą, z podjednostką SLC3A2 określaną jako łańcuch ciężki i podjednostką SLC7A11 określaną jako łańcuch lekki, tworząc antyporter aminokwasów znany jako system xc- lub antyporter xCT18. Antyporter xCT jest transporterem aminokwasów na powierzchni komórki, który eksportuje glutaminian w zamian za cystynę. Wymiana ta jest ważna dla obrony przed komórkowymi reaktywnymi formami tlenu (ROS), ponieważ cystyna jest utlenionym dimerem cysteiny, krytycznym prekursorem syntezy glutationu (GSH), głównego antyoksydantu19. Dla jasności, odnosimy się do funkcjonalnego transportera jako „system xc-” lub „antyporter xCT”, a do podjednostki łańcucha lekkiego jako SLC7A11.

Rysunek 1: Identyfikacja SLC3A2 lub SLC7A11 jako czynników ograniczających żywotność komórek w warunkach niedoboru glukozy.

Aby scharakteryzować komórkowe konsekwencje tych zaburzeń genowych, wyizolowaliśmy klony Hap1 z insercjami pułapek genowych SLC3A2 i SLC7A11. Mutant SLC3A2, nazwany AC24, ma wstawkę genową w drugim intronie SLC3A2 w oczekiwanej orientacji dla zakłócenia genu i nie wykazuje ekspresji SLC3A2. Ponadto, wykazuje on znacznie niższą ekspresję SLC7A11, co jest oczekiwane, ponieważ SLC3A2 musi łączyć się z SLC7A11, aby utworzyć stabilny kompleks (Rys. 1b). Mutant SLC7A11, określany jako AC6, posiada insercję genową w 5′ nieulegającym translacji regionie pierwszego eksonu SLC7A11 i wykazuje znacznie obniżoną ekspresję SLC7A11 na poziomie białka (Fig. 1b) i mRNA (Uzupełniająca Fig. 1). Poziom SLC3A2 jest w dużym stopniu niezmieniony w AC6, prawdopodobnie dlatego, że podjednostka SLC3A2 jest wspólna dla kilku transporterów aminokwasów18. Oba klony wykazują niższe uwalnianie glutaminianu do mediów (ryc. 1c), potwierdzając, że system xc- jest funkcjonalnie zaburzony. Co ważne, oba klony wykazują znacznie lepszą żywotność w warunkach niedoboru glukozy (Rys. 1d,e). Po 24 h pozbawienia glukozy, >70% komórek w obu klonach pozostaje żywotnych, podczas gdy tylko 10% komórek rodzicielskiego Hap1 przeżywa. Zgodnie z tym wynikiem, traktowanie komórek Hap1 sulfasalazyną (SASP)20, inhibitorem systemu xc-, poprawiło żywotność komórek WT Hap1 po wycofaniu glukozy (Fig. 1d,e).

System xc- reguluje żywotność komórek podczas wycofywania glukozy

Aby niezależnie potwierdzić wyniki przesiewu genetycznego, użyliśmy krótkich spinek RNA (shRNA), aby stabilnie znokautować system xc- w komórkach Hap1 (Fig. 2a). Ponieważ SLC3A2 ma plejotropowe funkcje jako wspólny łańcuch ciężki dla kilku transporterów aminokwasów18, skoncentrowaliśmy nasze wysiłki związane z knockdownem na podjednostce SLC7A11. Komórki zawierające jeden z dwóch niezależnych shRNA SLC7A11 uwalniały znacząco mniej glutaminianu do medium (Rys. 2b). Wykazały one znacznie lepszą żywotność po odstawieniu glukozy (ryc. 2c). Nie było jednak zmian w tempie proliferacji w mediach zawierających glukozę (Supplementary Fig. 2a).

Rysunek 2: System xc- negatywnie wpływa na żywotność komórek Hap1 i HeLa po odstawieniu glukozy.

Odwrotnie, zastanawialiśmy się, czy zwiększenie poziomu systemu xc- w linii komórkowej z niskim endogennym SLC7A11 uwrażliwiłoby komórki na wycofanie glukozy. W porównaniu z komórkami Hap1, komórki HeLa wyrażały prawie niewykrywalne poziomy podjednostki SLC7A11 (Fig. 2a) i wykazywały niskie uwalnianie glutaminianu do medium (Fig. 2b). Co ciekawe, kontrolne komórki HeLa wykazywały wysoką żywotność w obliczu usunięcia glukozy (Rys. 2d). Nadekspresja podjednostki SLC7A11 spowodowała duży wzrost uwalniania glutaminianu (Rys. 2a,b) i znacznie zwiększyła śmierć komórek podczas wyczerpania glukozy (Rys. 2d). Jednakże, w mediach zawierających glukozę, nie było zmian w tempie proliferacji komórek HeLa z nadekspresją SLC7A11 w porównaniu do kontroli (Supplementary Fig. 2a). Tak więc, nadekspresja SLC7A11 jest wystarczająca do wywołania uzależnienia od glukozy. Podobne wyniki uzyskano stosując warunki hodowli z niską zawartością glukozy (versus brak glukozy w powyższych eksperymentach) (Supplementary Fig. 2b). Ponadto, ani knockdown, ani nadekspresja SLC7A11 nie zmieniły znacząco żywotności komórek po pozbawieniu ich glutaminy (Supplementary Fig. 2c). Łącznie, wyniki te wskazują, że poziom aktywności systemu xc- kontroluje wrażliwość komórek na odstawienie glukozy.

Korzyści z odstawienia xCT wymagają metabolizmu glutaminy

Po odstawieniu glukozy, glutamina staje się podstawowym źródłem węgla, a jej metabolizm jest krytyczny dla przeżycia komórek6,7,8. Po zaimportowaniu, wewnątrzkomórkowa glutamina jest przekształcana w glutaminian, a następnie w α-ketoglutaran, pośredni element cyklu TCA. Dlatego spekulowaliśmy, że komórki z niską aktywnością systemu xc- mogą być lepiej zdolne do utrzymania wewnątrzkomórkowego poziomu glutaminianu i jego metabolizmu w cyklu TCA. Aby przetestować ten pomysł, bezpośrednio zmierzyliśmy wewnątrzkomórkowe poziomy glutaminianu 1 h po odstawieniu glukozy. Komórki pozbawione SLC7A11 (Rys. 3a) oraz mutanty SLC3A2 lub SLC7A11 gene-trap (Supplementary Fig. 3a) utrzymywały wewnątrzkomórkowy poziom glutaminianu po odstawieniu glukozy znacznie lepiej niż komórki kontrolne. I odwrotnie, komórki HeLa z nadekspresją SLC7A11 miały niższy poziom wewnątrzkomórkowego glutaminianu niż komórki kontrolne (Rys. 3b). Zgodnie ze znaną rolą systemu xc- dla syntezy GSH, SLC7A11 knockdown zmniejszył poziom wewnątrzkomórkowego GSH w komórkach Hap1, podczas gdy SLC7A11-overexpressing HeLa komórki wykazywały wyższe poziomy GSH niż komórki kontrolne (Supplementary Fig. 3b).

Rysunek 3: Efekty pro-życiowe deplecji SLC7A11 wymagają metabolizmu glutaminy.

Następnie zapytaliśmy, czy metabolizm glutaminy/glutaminianu jest ważny dla zwiększonego przeżycia komórek systemu xc–deficient podczas wycofywania glukozy. Przetestowaliśmy trzy związki, aminooxyacetate (AOA, inhibitor aminotransferaz) i galusan epigallokatechiny (EGCG, inhibitor dehydrogenazy glutaminianowej)21 , które hamują enzymy zaangażowane w konwersję glutaminy do glutaminianu, a następnie α-ketoglutaranu (ryc. 3c). Po leczeniu EGCG, komórki Hap1 pozbawione SLC7A11 (Fig. 3d; Uzupełniająca Fig. 3c) lub SLC3A2 (Uzupełniająca Fig. 3c) nie wykazują już zwiększonej żywotności w warunkach pozbawienia glukozy, co sugeruje, że dehydrogenaza glutaminianowa (GDH) jest krytyczna dla tego efektu. Ponieważ GDH przekształca glutaminian do α-ketoglutaranu, zapytaliśmy, czy α-ketoglutaran może odwrócić hamujący efekt EGCG. Rzeczywiście, hamujący efekt EGCG został całkowicie zniwelowany przez suplementację α-ketoglutaranem dimetylu (dm-αKG), przepuszczalną dla komórek formą α-ketoglutaranu (Fig. 3e; Uzupełniająca Fig. 3d). Co więcej, suplementacja dm-αKG podczas odstawienia glukozy znacznie poprawiła żywotność komórek w komórkach typu dzikiego (WT) i kontrolnych shRNA Hap1 (Fig. 3e; Supplementary Fig. 3d) oraz w komórkach HeLa ulegających nadekspresji SLC7A11 (Fig. 2d), podczas gdy dodatkowe dodanie glutaminy do medium nie poprawiło znacząco żywotności komórek (Supplementary Fig. 3e). Wyniki te sugerują zatem, że konwersja glutaminianu do α-ketoglutaranu leży u podstaw ochronnego działania zaburzeń układu xc- w warunkach niedoboru glukozy. Brak efektu BPTES lub AOA sugeruje, że GLS1 nie jest główną glutaminazą w komórkach Hap1, i że GDH, a nie aminotransferaza, jest ważna dla konwersji glutaminianu do α-ketoglutaranu.

W przypadku braku glukozy, mitochondrialna OXPHOS (jako główne źródło syntezy ATP) staje się niezbędna do przeżycia. Poprzez anaplerozę, pochodzący z glutaminy α-ketoglutaran uzupełnia intermediaty cyklu TCA, który generuje substraty do napędzania OXPHOS21. Dlatego sprawdziliśmy, czy poziomy systemu xc- mogą regulować oddychanie mitochondrialne. W obecności glukozy wskaźnik konsumpcji tlenu (OCR) komórek HeLa z knockdownem SLC7A11 Hap1 lub komórek HeLa z nadekspresją jest porównywalny z komórkami kontrolnymi (Supplementary Fig. 3f). Jednak komórki SLC7A11 knockdown wykazują wyższą respirację mitochondrialną po 3 h pozbawienia glukozy, podczas gdy OCR komórek HeLa z nadekspresją SLC7A11 jest niższy niż komórki kontrolne pod wpływem wycofania glukozy (ryc. 3f).

Ostatnia praca wykazała, że α-ketoglutaran generowany ze zużytej glutaminy może być poddawany metabolizmowi oksydacyjnemu poprzez „forward”, zgodny z ruchem wskazówek zegara cykl TCA lub redukcyjną karboksylację poprzez „reverse”, przeciwną do ruchu wskazówek zegara reakcję TCA22,23,24. Względny przepływ przez cykl TCA w przód i w tył może być określony przy użyciu stabilnego znakowania izotopem 13C (C5) zewnątrzkomórkowej glutaminy i pomiaru wbudowywania etykiety do produktów pośrednich cyklu TCA22,23,25. W celu określenia, czy modulacja systemu xc- zmienia przepływ w przód i w tył cyklu TCA, komórki Hap1 z wyłączonym SLC7A11 lub komórki HeLa ulegające nadekspresji hodowano w nieobecności glukozy i z U-13C5-glutaminą (patrz Metody). Ekspozycja na zewnątrzkomórkową U-13C5-glutaminę powodowała prawie całkowite znakowanie (M+5) wewnątrzkomórkowej glutaminy i glutaminianu (Supplementary Fig. 3g). Znakowany glutaminian wchodził do TCA poprzez reakcję anaplerotyczną do α-ketoglutaranu z M+4 znakowaniem dalszych pośrednich produktów TCA: bursztynianu, fumaranu, jabłczanu i cytrynianu (Rys. 3g). Znakowanie M+5 cytrynianu (produkt redukcyjnego TCA) było obserwowane w znacznie mniejszym stopniu (∼8:1 M+4:M+5 cytrynian), co wskazuje na niski wsteczny strumień TCA. Co ważne, względny stopień przepływu w przód w stosunku do przepływu w tył nie zmieniał się ani przy wyłączeniu, ani przy nadekspresji SLC7A11.

xCT reguluje zależność komórek raka piersi od glukozy

Aby rozszerzyć nasze obserwacje dotyczące negatywnego wpływu systemu xc- na metabolizm glutaminy i oddychanie, przeanalizowaliśmy dane dotyczące ekspresji genów dla 947 nowotworowych linii komórkowych z projektu Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)26. Dla każdego typu nowotworu, skategoryzowaliśmy 15-20 nowotworowych linii komórkowych jako linie o wysokiej i niskiej ekspresji SLC7A11 i przeprowadziliśmy analizę wzbogacenia zestawu genów pomiędzy tymi dwiema grupami. Stwierdziliśmy, że geny związane z OXPHOS były wzbogacone w grupach o niskiej ekspresji SLC7A11, szczególnie w liniach komórkowych raka płuc (wartość P=0,018) i raka piersi (wartość P=0,039). Co więcej, analiza 59 komórek raka piersi wykazała wyraźną i selektywną ujemną korelację pomiędzy ekspresją SLC7A11 a genami mitochondrialnej OXPHOS (Supplementary Fig. 4a,b). Obserwacja ta sugeruje, że większość komórek raka piersi z niską ekspresją SLC7A11 ma profil ekspresji zgodny z upregulation of the OXPHOS machinery, and vice versa.

Wybraliśmy dwie linie komórkowe raka piersi, Hs578T i SK-BR-3, jako reprezentatywne dla linii komórkowych o wysokiej i niskiej ekspresji SLC7A11, odpowiednio (Supplementary Fig. 4a). Zgodnie z danymi dotyczącymi ekspresji CCLE, komórki Hs578T wykazywały wysoki poziom ekspresji SLC7A11 i aktywne uwalnianie glutaminianu do medium, podczas gdy komórki SK-BR-3 wykazywały niską ekspresję SLC7A11 i niewykrywalne uwalnianie glutaminianu (Fig. 4a; Supplementary Fig. 5a). Określiliśmy również status metaboliczny komórek Hs578T i SK-BR-3 poprzez pomiar aktywności OCR i glikolizy (extracellular acidification rate (ECAR)). Komórki Hs578T wykazywały niższy OCR i niższy stosunek OCR/ECAR niż komórki SK-BR-3 (ryc. 4b,c), co sugeruje, że komórki Hs578T są bardziej zależne od glikolizy niż SK-BR-3. Większość komórek Hs578T, podobnie jak komórki Hap1, umierało po odstawieniu glukozy (ryc. 4d), podczas gdy komórki SK-BR-3 były odporne (ryc. 4e). Komórki Hs578T pozbawione SLC7A11 wykazywały zmniejszone uwalnianie glutaminianu do medium (Supplementary Fig. 5a) i skuteczniej utrzymywały wewnątrzkomórkowy poziom glutaminianu pod wpływem wyczerpania glukozy (Supplementary Fig. 5b). Co ważne, knockdown SLC7A11 znacznie poprawił żywotność komórek Hs578T podczas odstawienia glukozy (Rys. 4d). Jednakże, komórki Hs578T pozbawione SLC7A11 miały wyższy poziom komórkowych ROS niż komórki kontrolne, co jest zgodne z jego rolą w obronie antyoksydacyjnej (Supplementary Fig. 5c). I odwrotnie, komórki z nadekspresją SLC7A11 miały niższy poziom ROS (Supplementary Fig. 5c). Przeżywalność komórek Hs578T pozbawionych SLC7A11 podczas odstawienia glukozy została zniesiona przez EGCG i BPTES, co ponownie sugeruje, że produkcja α-ketoglutaranu z glutaminianu jest krytyczna (ryc. 4d). Zgodnie z oczekiwaniami, szkodliwe efekty leczenia EGCG lub BPTES zostały całkowicie odwrócone przez suplementację dm-αKG (ryc. 4d). Zróżnicowany efekt BPTES (porównaj Fig. 4d z Fig. 3d) sugeruje, że GLS1 jest podstawową glutaminazą w komórkach Hs578T, ale nie w komórkach Hap1.

Rycina 4: Deplecja SLC7A11 promuje przeżycie komórek raka piersi po pozbawieniu glukozy.

Nadekspresja SLC7A11 w komórkach SK-BR-3 zwiększała uwalnianie glutaminianu (Supplementary Fig. 5a) i jednocześnie zmniejszała zdolność do utrzymywania wewnątrzkomórkowego glutaminianu w warunkach niedoboru glukozy (Supplementary Fig. 5b). Nadekspresja SLC7A11 powodowała znaczną śmierć komórek SK-BR-3 po odstawieniu glukozy. Śmierć komórek została uratowana przez dodanie dm-αKG, sugerując, że nadekspresja SLC7A11 prowadzi do niedoboru α-ketoglutaranu w warunkach niedoboru glukozy (Fig. 4e).

Komórki Hs578T z knockdownem SLC7A11 były w stanie utrzymać aktywność oddechową przez dłuższy czas po odstawieniu glukozy (Supplementary Fig. 5d). I odwrotnie, komórki SK-BR-3 z nadekspresją SLC7A11 wykazywały gwałtowny spadek OCR pod wpływem tego samego reżimu. Łącznie wyniki te wskazują, że system xc- w komórkach raka piersi reguluje wewnątrzkomórkowy przepływ glutaminianu do cyklu TCA i zwiększa wrażliwość na odstawienie glukozy.

Nrf2 działa upstream of SLC7A11

Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-like 2, NFE2L2) jest kluczowym czynnikiem transkrypcyjnym, który reguluje wiele genów cytoprotekcyjnych zaangażowanych w stres oksydacyjny27. Ponieważ SLC7A11 jest znanym genem docelowym Nrf2 (ref. 27), zbadaliśmy korelację ekspresji Nrf2 i SLC7A11 w komórkach nowotworowych. Ekspresja Nrf2 jest pozytywnie skorelowana z ekspresją SLC7A11 w 59 liniach komórkowych raka piersi (R=0,5688), jak również we wszystkich 947 liniach komórkowych raka (R=0,4306) w danych ekspresji CCLE. Co więcej, ekspresja genów docelowych Nrf2 wykazuje wysoką korelację z ekspresją SLC7A11 we wszystkich 947 liniach komórkowych raka. Współczynnik korelacji (R) pomiędzy SLC7A11 a genami docelowymi NRF2 wynosi: NQO1 (+0,4179), GCLC (+0,3283), GCLM (+0,3944) i TXNRD1 (+0,4321).

Te korelacje sugerują, że Nrf2 wspiera ekspresję SLC7A11 w podzbiorze komórek nowotworowych. Aby przetestować ten pomysł, znokautowaliśmy Nrf2 w komórkach raka piersi Hs578T i MDA-MB-231, dwóch wysokich ekspresorów SLC7A11. Znokautowanie Nrf2 spowodowało wyraźny spadek ekspresji SLC7A11 (ryc. 5a,b,e) i zmniejszenie uwalniania glutaminianu (ryc. 5c,f). Co ważne, komórki pozbawione Nrf2 wykazywały znacznie lepszą żywotność podczas odstawienia glukozy (Rys. 5d,g). Ponownie, ta zmiana w żywotności jest zależna od metabolizmu glutaminianu, ponieważ traktowanie EGCG zniosło efekt pro-survival knockdown Nrf2 (Fig. 5d). Ponadto, suplementacja α-ketoglutaranu była wystarczająca do promowania przeżycia komórek, nawet w obecności EGCG.

Figura 5: Nrf2 reguluje ekspresję SLC7A11 i przeżycie komórek raka piersi po wycofaniu glukozy.

Aby zbadać efekt upregulacji Nrf2, potraktowaliśmy komórki fumaranem dimetylu (DMF), przepuszczalnym dla komórek aktywatorem Nrf228. Podanie DMF spowodowało w komórkach MDA-MB-231 silną indukcję ekspresji SLC7A11 i uwalniania glutaminianu (ryc. 5e,f). Co więcej, komórki poddane działaniu DMF wykazywały istotnie zmniejszoną żywotność podczas pozbawienia glukozy w porównaniu z komórkami kontrolnymi (ryc. 5g). Wykluczyliśmy efekty off-target, wykazując, że te wyniki leczenia DMF były zależne zarówno od SLC7A11, jak i Nrf2 (Fig. 5f,g). Łącznie, wyniki te wskazują, że oś Nrf2-SLC7A11 reguluje metabolizm glutaminianu, zależność komórek nowotworowych od glukozy i ich zdolność do wykorzystania glutaminy jako alternatywnego źródła węgla. Co ważne, sugeruje to, że adaptacja do stresu oksydacyjnego w komórkach nowotworowych może zagrozić elastyczności składników odżywczych, szczególnie poprzez wzmocnienie fenotypu uzależnienia od glukozy.

xCT reguluje funkcję mitochondrialną w komórkach z mutacją mtDNA

Nasze powyższe ustalenia wskazują, że komórki z upregulacją systemu xc- z powodu stresu oksydacyjnego mogą mieć ograniczoną elastyczność składników odżywczych z powodu upośledzonego metabolizmu glutaminy. Inhibicja mitochondrialnego łańcucha oddechowego może zwiększać ilość reaktywnych form tlenu29,30. Stwierdziliśmy, że ekspresja SLC7A11 była indukowana przez leki blokujące funkcje mitochondrialne, zwłaszcza rotenon i oligomycynę, które hamują kompleks I (dehydrogenazę NADH) i V (syntazę ATP) maszynerii OXPHOS, odpowiednio (Supplementary Fig. 6a). Zgodnie z tymi farmakologicznymi wynikami, SLC7A11 ulegała indukcji w komórkach cybrydowych zawierających homoplazmatyczne mutacje mtDNA w podjednostce ND1 kompleksu I lub podjednostce ATP6 kompleksu V (NARP) (ryc. 6a)30,31. Indukcja SLC7A11 była szczególnie wyraźna w linii komórkowej NARP, w której odnotowano wysoki poziom ROS i indukcję mitochondrialnego enzymu niszczącego ROS – MnSOD30. Indukcja SLC7A11 w komórkach cybrydowych NARP była wysoce zależna od czynników transkrypcyjnych Nrf2 i Atf4 (Dodatkowa ryc. 6b) i mogła być stłumiona przez leczenie przeciwutleniaczem N-acetylocysteiną (Dodatkowa ryc. 6c).

Ryc. 6: System inhibicji xc- zwiększa żywotność i funkcje mitochondrialne komórek cybrydowych zawierających mutacje mtDNA.

Zbadaliśmy, czy te kompensacyjne zmiany w ekspresji systemu xc- wpływają na metabolizm komórkowy w komórkach cybrydowych. Zgodnie z ich wyższą ekspresją SLC7A11, cybrydy ND1 i NARP miały niższe wewnątrzkomórkowe poziomy glutaminianu (Fig. 6b). Zahamowanie systemu xc- przez wyłączenie SLC7A11 lub silny inhibitor, erastynę, zwiększyło wewnątrzkomórkowy glutaminian w komórkach ND1 i NARP. Podobnie, wewnątrzkomórkowy α-ketoglutaran, produkt metabolizmu glutaminianu, był również zwiększony przez inhibicję SLC7A11 (Supplementary Fig. 6d). Od dawna wiadomo, że komórki z defektami OXPHOS słabo przeżywają na podłożu zawierającym galaktozę, co wymusza większe zapotrzebowanie na OXPHOS jako źródło generacji ATP32. Zmutowane cybrydy ND1 i NARP, w przeciwieństwie do izogenicznych komórek WT 143B, nie były w stanie przeżyć w pożywce zawierającej galaktozę (Fig. 6c; Supplementary Fig. 6e). Jednakże, knockdown SLC7A11 lub leczenie erastyną silnie ratowało żywotność cybryd ND1 i NARP w pożywce galaktozowej. Efekt ten był najbardziej wyraźny w cybrydach NARP, które wykazały znacznie większą indukcję SLC7A11 (Fig. 6c).

Ten wzrost żywotności komórek był skorelowany z uderzającą normalizacją morfologii mitochondriów. Nasza grupa wcześniej donosiła, że komórki WT wydłużają swoje mitochondria w warunkach pożywki, które wymagają zwiększonej aktywności OXPHOS, podczas gdy komórki z mutacjami mtDNA zamiast tego fragmentują swoje mitochondria33. Zgodnie z tym wynikiem, cybrydy ND1 i NARP wykazały wyraźną fragmentację mitochondriów po 24 h hodowli galaktozy. W przeciwieństwie do tego, cybrydy z knockdownem SLC7A11 lub traktowane erastyną wykazywały znaczne wydłużenie mitochondriów, gdy źródło węgla w medium zostało zmienione z glukozy na galaktozę (Fig. 6d; Supplementary Fig. 6f). Znokautowanie SLC7A11 nie zmieniło poziomu kilku białek dynamiki mitochondrialnej, w tym Opa1, Mfn1 i Drp1 (Supplementary Fig. 6g). Ponadto, komórki pozbawione SLC7A11 wykazywały wyższą aktywność oddechową niż komórki zmutowane kontrolnie (Rys. 6e). Łącznie, wyniki te sugerują, że hamowanie systemu xc- w cybrydach zmutowanych w mtDNA poprawia morfologię mitochondriów i oddychanie, co skutkuje znacznie zwiększonym przeżyciem w pożywce galaktozowej.

Digital Travel