Haploidní genetický screening závislosti na glukóze

Mnohé imortalizované buněčné linie vykazují omezenou nutriční flexibilitu a jsou vysoce závislé na glukóze jako primárním zdroji uhlíku. Zjistili jsme, že přežití lidské haploidní buněčné linie Hap1 vyžaduje glukózu v kultivačním médiu. Abychom identifikovali faktory podílející se na této „závislosti na glukóze“, provedli jsme genetický screening haploidních buněk15 s cílem izolovat mutanty, které přežívají při úplné absenci glukózy. Náhodně jsme mutagenizovali 1 × 108 buněk Hap1 s nízkou multiplicitou infekce pomocí retrovirového vektoru genové pasti16 a mutagenizovanou populaci jsme kultivovali v médiu s nedostatkem glukózy po dobu 12 dnů. Poté, co většina (>99 %) buněk odumřela, byly obnoveny buňky odolné vůči depleci glukózy a expandovány v médiu bohatém na živiny. Místa inzerce genových pastí z rezistentní populace byla identifikována pomocí sekvenování Illumina založeného na inverzní PCR17. Ve vybrané populaci byly retrovirální integrací s vysokou frekvencí narušeny geny SLC3A2/4F2hc (399 různých inzercí) a xCT/SLC7A11 (39 inzercí) (obr. 1a). Je pozoruhodné, že proteinové produkty těchto genů spolu fyzicky interagují, přičemž podjednotka SLC3A2 se označuje jako těžký řetězec a podjednotka SLC7A11 jako lehký řetězec, a tvoří aminokyselinový antiporter známý jako systém xc- nebo antiporter xCT18. Antiporter xCT je povrchový buněčný aminokyselinový transportér, který exportuje glutamát výměnou za cystin. Tato výměna je důležitá pro obranu proti reaktivním formám kyslíku (ROS) v buňce, protože cystin je oxidovaný dimer cysteinu, kritického prekurzoru pro syntézu glutathionu (GSH), hlavního antioxidantu19. Pro přehlednost označujeme funkční transportér jako „systém xc-“ nebo „xCT antiporter“ a podjednotku lehkého řetězce jako SLC7A11.

(a) Zobrazení vložených genových pastí nalezených v genech SLC3A2 a SLC7A11, v buňkách Hap1 přežívajících depleci glukózy. Černé obdélníky představují exony a modré značky představují události vložení. Počet genových inzercí z neselektované a selektované populace byl analyzován jednostranným Fisherovým přesným testem pro výpočet hodnot P. (b) Western blot analýza hladin SLC3A2 a SLC7A11 v buňkách WT Hap1 (WT), AC6 (klon genové pasti SLC7A11) a AC24 (klon genové pasti SLC3A2). (c) Kvantifikace uvolňování glutamátu do média. Hodnoty byly normalizovány na WT. Data představují průměry±s.d. (n=3); **P<0,01; nepárový Studentův t-test. (d,e) Reprezentativní snímky (d) a kvantifikace (e) životaschopnosti buněk 24 h po vysazení glukózy s vehikulem (DMSO) nebo 500 μM sulfasalazinu (SASP). Měřítko 200 μm. Data představují průměry±s.d. (n=3).

Pro charakterizaci buněčných důsledků přerušení těchto genů jsme izolovali klony Hap1 s vloženými genovými pastmi SLC3A2 a SLC7A11. Mutant SLC3A2, označovaný jako AC24, má gen-trap inserci v druhém intronu SLC3A2 v očekávané orientaci pro narušení genu a nevykazuje žádnou expresi SLC3A2. Kromě toho má podstatně nižší expresi SLC7A11, což se očekává, protože SLC3A2 se musí spojit se SLC7A11, aby vytvořil stabilní komplex (obr. 1b). Mutant SLC7A11, označovaný jako AC6, má genovou inzertní past v 5′ nepřekládané oblasti prvního exonu SLC7A11 a vykazuje výrazně sníženou expresi SLC7A11 na úrovni proteinu (obr. 1b) a mRNA (doplňkový obr. 1). Hladiny SLC3A2 nejsou u AC6 z velké části ovlivněny, pravděpodobně proto, že podjednotka SLC3A2 je společná pro několik transportérů aminokyselin18. Oba klony vykazují nižší uvolňování glutamátu do média (obr. 1c), což potvrzuje, že systém xc- je funkčně narušen. Důležité je, že oba klony vykazují vysoce zlepšenou životaschopnost za podmínek s nedostatkem glukózy (obr. 1d,e). Po 24 hodinách deprivace glukózy zůstává >70 % buněk obou klonů životaschopných, zatímco u rodičovského klonu Hap1 přežívá pouze 10 % buněk. V souladu s tímto výsledkem zlepšilo ošetření buněk Hap1 sulfasalazinem (SASP)20 , inhibitorem systému xc-, životaschopnost buněk WT Hap1 po vysazení glukózy (obr. 1d,e).

Systém xc- reguluje životaschopnost buněk při vysazení glukózy

Pro nezávislé potvrzení výsledků genetického screeningu jsme použili krátké vlásenkové RNA (shRNA) ke stabilnímu vyřazení systému xc- v buňkách Hap1 (obr. 2a). Protože SLC3A2 má pleiotropní funkce jako společný těžký řetězec pro několik transportérů aminokyselin18 , zaměřili jsme naše úsilí o knockdown na podjednotku SLC7A11. Buňky obsahující jednu ze dvou nezávislých shRNA SLC7A11 uvolňovaly do média podstatně méně glutamátu (obr. 2b). Vykazovaly výrazně lepší životaschopnost po vysazení glukózy (obr. 2c). V médiích obsahujících glukózu však nedošlo k žádné změně v míře proliferace (doplňkový obr. 2a).

(a) Western blot analýza hladin proteinu SLC7A11 v buňkách Hap1 s knockdownem SLC7A11 a HeLa s overexpresí SLC7A11. (b) Kvantifikace uvolňování glutamátu do média. Data představují průměry±s.d. (n=4); **P<0,01; nepárový Studentův t-test; scr, scrambled shRNA. (c,d) Životaschopnost buněk 24 h po vysazení glukózy. Buňky Hap1 s knockdownem SLC7A11 (c) a buňky HeLa s overexpresí SLC7A11 (d) byly kultivovány v médiu s nedostatkem glukózy s vehikulem (DMSO), 500 μM SASP nebo 4 mM dm-αKG po dobu 24 h. Data představují střední hodnoty ± s.d. (n=3); vektor: prázdný vektor.

Naopak nás zajímalo, zda zvýšení hladiny systému xc- u buněčné linie s nízkým endogenním SLC7A11 zvýší citlivost buněk na vysazení glukózy. Ve srovnání s buňkami Hap1 exprimovaly buňky HeLa téměř nedetekovatelné hladiny podjednotky SLC7A11 (obr. 2a) a vykazovaly nízké uvolňování glutamátu do média (obr. 2b). Zajímavé je, že kontrolní buňky HeLa vykazovaly vysokou životaschopnost při odstranění glukózy (obr. 2d). Nadměrná exprese podjednotky SLC7A11 způsobila velký nárůst uvolňování glutamátu (obr. 2a,b) a výrazně zvýšila smrt buněk při vyčerpání glukózy (obr. 2d). V médiích obsahujících glukózu však nedošlo ke změně míry proliferace buněk HeLa s nadměrnou expresí SLC7A11 ve srovnání s kontrolou (doplňkový obr. 2a). Nadměrná exprese SLC7A11 je tedy dostatečná k vyvolání závislosti na glukóze. Podobných výsledků bylo dosaženo při použití kultivačních podmínek s nízkým obsahem glukózy (oproti absenci glukózy ve výše uvedených experimentech) (doplňkový obr. 2b). Kromě toho knockdown ani overexprese SLC7A11 významně nezměnily životaschopnost buněk při depleci glutaminu (doplňkový obr. 2c). Souhrnně tyto výsledky naznačují, že úroveň aktivity systému xc- řídí citlivost buněk na vysazení glukózy.

Výhody deplece xCT vyžadují metabolismus glutaminu

Po vysazení glukózy se glutamin stává primárním zdrojem uhlíku a jeho metabolismus je kritický pro přežití buněk6,7,8 . Po importu je intracelulární glutamin přeměněn na glutamát a dále na α-ketoglutarát, meziprodukt TCA cyklu. Proto jsme předpokládali, že buňky s nízkou aktivitou systému xc- mohou být lépe schopny udržovat intracelulární hladinu glutamátu a jeho metabolismus do TCA cyklu. Abychom tuto myšlenku ověřili, měřili jsme přímo intracelulární hladiny glutamátu 1 h po vysazení glukózy. Buňky s vyřazeným genem SLC7A11 (obr. 3a) a mutanty s genovou pastí SLC3A2 nebo SLC7A11 (doplňkový obr. 3a) udržovaly intracelulární hladinu glutamátu po vyřazení glukózy mnohem lépe než kontrolní buňky. Naopak buňky HeLa s nadměrnou expresí SLC7A11 měly nižší hladinu intracelulárního glutamátu než kontrolní buňky (obr. 3b). V souladu se známou úlohou systému xc- pro syntézu GSH snížilo vyřazení SLC7A11 hladinu intracelulárního GSH v buňkách Hap1, zatímco buňky HeLa s nadměrnou expresí SLC7A11 vykazovaly vyšší hladinu GSH než kontrolní buňky (doplňkový obr. 3b).

(a,b) Kvantifikace intracelulárního glutamátu u buněk Hap1 s knockdownem SLC7A11 (a) a buněk HeLa s overexpresí SLC7A11 (b) před a 1 h po odstranění glukózy. Data představují průměry±s.d. (n=3); **P<0,01; nepárový Studentův t-test. (c) Enzymy a inhibitory zapojené do metabolismu glutaminu/glutamátu. (d,e) Životaschopnost buněk Hap1 po 24 h od vysazení glukózy. Následující léčiva byla přidána podle pokynů: 0,5 mM AOA, 50 μM EGCG, 10 μM BPTES nebo 4 mM dm-αKG. Údaje představují průměry±s.d. (n=3). (f) Spotřeba kyslíku za podmínek vyčerpání glukózy. Buňky byly inkubovány 3 h v médiu s nedostatkem glukózy (1 mM glutamin) a byla měřena OCR. Údaje představují průměry±s.d. (n=4); *P<0,05. **P<0,01; nepárový Studentův t-test. (g) Vzorce izotopového značení meziproduktů TCA. Buňky byly před extrakcí metabolitů inkubovány 8 h v médiu bez glukózy obsahujícím U-13C5-glutamin. Data představují průměry±s.d. (n=3).

Další otázkou bylo, zda je metabolismus glutaminu/glutamátu důležitý pro zvýšené přežívání buněk systému xc–deficientních buněk během vysazení glukózy. Testovali jsme tři sloučeniny , aminooxyacetát (AOA, inhibitor aminotransferázy) a epigalokatechin galát (EGCG, inhibitor glutamát dehydrogenázy)21 , které inhibují enzymy podílející se na přeměně glutaminu na glutamát a poté na α-ketoglutarát (obr. 3c). Po ošetření EGCG buňky Hap1 s narušenou funkcí SLC7A11 (obr. 3d; doplňkový obr. 3c) nebo SLC3A2 (doplňkový obr. 3c) již nevykazují zvýšenou životaschopnost při deprivaci glukózy, což naznačuje, že pro tento účinek je rozhodující glutamátdehydrogenáza (GDH). Protože GDH přeměňuje glutamát na α-ketoglutarát, položili jsme si otázku, zda by α-ketoglutarát mohl zvrátit inhibiční účinek EGCG. Inhibiční účinek EGCG byl skutečně plně zachráněn doplněním dimethyl α-ketoglutarátu (dm-αKG), buněčně propustné formy α-ketoglutarátu, (obr. 3e; doplňkový obr. 3d). Navíc doplnění dm-αKG během vysazení glukózy výrazně zlepšilo životaschopnost buněk divokého typu (WT) a kontrolních shRNA buněk Hap1 (obr. 3e; doplňkový obr. 3d) a buněk HeLa s nadměrnou expresí SLC7A11 (obr. 2d), zatímco dodatečné doplnění glutaminu do média životaschopnost buněk výrazně nezlepšilo (doplňkový obr. 3e). Tyto výsledky tedy naznačují, že přeměna glutamátu na α-ketoglutarát je základem ochranného účinku narušení systému xc- za podmínek nedostatku glukózy. Absence účinku BPTES nebo AOA naznačuje, že GLS1 není primární glutaminázou v buňkách Hap1 a že pro přeměnu glutamátu na α-ketoglutarát je důležitá spíše GDH než aminotransferáza.

Při nedostatku glukózy se mitochondriální OXPHOS (jako hlavní zdroj syntézy ATP) stává nezbytnou pro přežití. Prostřednictvím anaplerózy doplňuje α-ketoglutarát získaný glutaminem meziprodukty TCA cyklu, který vytváří substráty pro pohon OXPHOS21. Proto jsme testovali, zda hladiny systému xc- mohou regulovat mitochondriální dýchání. V přítomnosti glukózy je rychlost spotřeby kyslíku (OCR) u buněk HeLa s knockdownem SLC7A11 nebo s overexpresí Hap1 srovnatelná s kontrolní buňkou (doplňkový obr. 3f). Nicméně buňky s knockdownem SLC7A11 vykazují vyšší mitochondriální respiraci po 3 hodinách odnětí glukózy, zatímco OCR buněk HeLa s overexpresí SLC7A11 je při odnětí glukózy nižší než u kontrolních buněk (obr. 3f).

Nedávné práce zjistily, že α-ketoglutarát vzniklý ze spotřebovaného glutaminu může podléhat oxidačnímu metabolismu prostřednictvím „dopředného“, pravotočivého cyklu TCA nebo reduktivní karboxylaci prostřednictvím „zpětné“, pravotočivé reakce TCA22,23,24 . Relativní tok přes přímý a zpětný TCA cyklus lze stanovit pomocí značení extracelulárního glutaminu stabilním 13C izotopem (C5) a měřením inkorporace značení do meziproduktů TCA cyklu22,23,25. Za účelem zjištění, zda modulace systému xc- mění tok TCA cyklu vpřed a vzad, byly buňky HeLa s knockdownem SLC7A11 Hap1 nebo s overexpresí kultivovány v nepřítomnosti glukózy a s U-13C5-glutaminem (viz Metody). Expozice extracelulárnímu U-13C5-glutaminu vedla k téměř úplnému značení (M+5) intracelulárního glutaminu a glutamátu (doplňkový obr. 3g). Značený glutamát vstoupil do TCA anaplerotickou reakcí na α-ketoglutarát s M+4 značením předních meziproduktů TCA sukcinátu, fumarátu, malátu a citrátu (obr. 3g). Značení M+5 citrátu (reduktivní produkt TCA) bylo pozorováno v mnohem menší míře (∼8:1 M+4:M+5 citrát), což svědčí o nízkém zpětném toku TCA. Důležité je, že relativní míra přímého a zpětného toku se nezměnila ani při knockdownu, ani při nadměrné expresi SLC7A11.

xCT reguluje závislost buněk karcinomu prsu na glukóze

Pro rozšíření našich pozorování o negativním vlivu systému xc- na metabolismus glutaminu a respiraci jsme analyzovali údaje o genové expresi 947 nádorových buněčných linií z projektu Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)26 . Pro každý typ rakoviny jsme 15-20 nádorových buněčných linií rozdělili do kategorií s vysokou a nízkou expresí SLC7A11 a provedli jsme analýzu obohacení genových sad mezi těmito dvěma skupinami. Zjistili jsme, že geny související s OXPHOS byly obohaceny ve skupinách s nízkou expresí SLC7A11, zejména u buněčných linií rakoviny plic (hodnota P=0,018) a prsu (hodnota P=0,039). Analýza 59 buněk karcinomu prsu navíc ukázala výraznou a selektivní negativní korelaci mezi expresí SLC7A11 a mitochondriálními geny OXPHOS (doplňkový obr. 4a,b). Toto pozorování naznačuje, že většina buněk karcinomu prsu s nízkou expresí SLC7A11 má expresní profil odpovídající zvýšené regulaci mechanismu OXPHOS a naopak.

Zvolili jsme dvě buněčné linie karcinomu prsu, Hs578T a SK-BR-3, jako zástupce buněčných linií s vysokou, resp. nízkou expresí SLC7A11 (doplňkový obr. 4a). V souladu s údaji o expresi CCLE vykazovaly buňky Hs578T vysokou úroveň exprese SLC7A11 a aktivní uvolňování glutamátu do média, zatímco buňky SK-BR-3 vykazovaly nízkou expresi SLC7A11 a žádné detekovatelné uvolňování glutamátu (obr. 4a; doplňkový obr. 5a). Stanovili jsme také metabolický stav buněk Hs578T a SK-BR-3 měřením aktivity OCR a glykolýzy (rychlost extracelulární acidifikace (ECAR)). Buňky Hs578T vykazovaly nižší OCR a nižší poměr OCR/ECAR než SK-BR-3 (obr. 4b,c), což naznačuje, že buňky Hs578T jsou více závislé na glykolýze než SK-BR-3. Většina buněk Hs578T, stejně jako buněk Hap1, odumřela po vysazení glukózy (obr. 4d), zatímco buňky SK-BR-3 byly odolné (obr. 4e). Buňky Hs578T ochuzené o SLC7A11 vykazovaly snížené uvolňování glutamátu do média (doplňkový obr. 5a) a účinněji udržovaly intracelulární hladinu glutamátu při depleci glukózy (doplňkový obr. 5b). Důležité je, že vyřazení SLC7A11 výrazně zlepšilo životaschopnost buněk Hs578T během vysazení glukózy (obr. 4d). Nicméně buňky Hs578T bez SLC7A11 měly vyšší hladiny buněčných ROS než kontrolní buňky, což odpovídá jeho úloze v antioxidační obraně (doplňkový obr. 5c). Naopak buňky s nadměrnou expresí SLC7A11 měly nižší hladiny ROS (doplňkový obr. 5c). Přežívání buněk Hs578T s knockdownem SLC7A11 během vysazení glukózy bylo zrušeno EGCG a BPTES, což opět naznačuje, že produkce α-ketoglutarátu z glutamátu je rozhodující (obr. 4d). Podle očekávání byly škodlivé účinky léčby EGCG nebo BPTES plně zvráceny suplementací dm-αKG (obr. 4d). Rozdílný účinek BPTES (srovnej obr. 4d s obr. 3d) naznačuje, že GLS1 je primární glutaminázou v buňkách Hs578T, ale ne v buňkách Hap1.

(a) Hladiny proteinu SLC7A11 v buňkách Hs578T s deplecí SLC7A11 a SK-BR-3 s nadměrnou expresí SLC7A11. (b,c) Metabolický stav za podmínek plných glukózy. OCR (b) a poměr OCR/ECAR (c) byly měřeny v přítomnosti 10 mM glukózy+2 mM glutaminu. Údaje představují průměry±s.d. (n=3). (d,e) Životaschopnost buněk 24 hodin po vysazení glukózy. SLC7A11 knockdown Hs578T (d) a SLC7A11-overexpressing SK-BR-3 buňky (e) byly kultivovány v médiu s nedostatkem glukózy po dobu 24 h. Následující léčiva byla přidána podle indikace: 500 μM SASP, 0,5 mM AOA, 50 μM EGCG, 10 μM BPTES nebo 4 mM dm-αKG. Data představují průměry±s.d. (n=3).

Overexprese SLC7A11 v buňkách SK-BR-3 zvýšila uvolňování glutamátu (doplňkový obr. 5a) a současně snížila schopnost udržet intracelulární glutamát za podmínek nedostatku glukózy (doplňkový obr. 5b). Nadměrná exprese SLC7A11 způsobila podstatnou smrt buněk SK-BR-3 po vysazení glukózy. Smrt buněk byla zachráněna přidáním dm-αKG, což naznačuje, že nadměrná exprese SLC7A11 vede k nedostatku α-ketoglutarátu za podmínek nedostatku glukózy (obr. 4e).

Buňky Hs578T s vyřazeným SLC7A11 byly schopny udržet si respirační aktivitu po delší dobu po vysazení glukózy (doplňkový obr. 5d). Naopak buňky SK-BR-3 s nadměrnou expresí SLC7A11 vykazovaly při stejném režimu prudký pokles OCR. Celkově tyto výsledky naznačují, že systém xc- v buňkách karcinomu prsu reguluje intracelulární tok glutamátu do TCA cyklu a zvyšuje citlivost na vysazení glukózy.

Nrf2 působí před SLC7A11

Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-like 2, NFE2L2) je klíčový transkripční faktor, který reguluje mnoho cytoprotektivních genů zapojených do oxidačního stresu27. Protože SLC7A11 je známým cílovým genem Nrf2 (ref. 27), zkoumali jsme korelaci exprese Nrf2 a SLC7A11 v nádorových buňkách. Exprese Nrf2 pozitivně koreluje s expresí SLC7A11 u 59 buněčných linií karcinomu prsu (R=0,5688), stejně jako u všech 947 buněčných linií karcinomu (R=0,4306) v údajích o expresi CCLE. Exprese cílového genu Nrf2 navíc vykazuje vysokou korelaci s expresí SLC7A11 ve všech 947 nádorových buněčných liniích. Korelační koeficient (R) mezi SLC7A11 a cílovými geny NRF2 je následující: NQO1 (+0,4179), GCLC (+0,3283), GCLM (+0,3944) a TXNRD1 (+0,4321).

Tyto korelace naznačují, že Nrf2 podporuje expresi SLC7A11 v podskupině nádorových buněk. Abychom tuto myšlenku ověřili, vyřadili jsme Nrf2 u buněk karcinomu prsu Hs578T a MDA-MB-231, dvou buněk s vysokou expresí SLC7A11. Vyřazení Nrf2 způsobilo výrazné snížení exprese SLC7A11 (obr. 5a,b,e) a snížilo uvolňování glutamátu (obr. 5c,f). Důležité je, že buňky s deplecí Nrf2 vykazovaly výrazně lepší životaschopnost při vysazení glukózy (obr. 5d,g). Tato změna životaschopnosti opět závisí na metabolismu glutamátu, protože léčba EGCG zrušila proživotní účinek vyřazení Nrf2 (obr. 5d). Navíc doplnění α-ketoglutarátu stačilo k podpoře přežití buněk i v přítomnosti EGCG.

(a) Western blot hladin proteinu SLC7A11 u buněk Hs578T s Nrf2 a SLC7A11 knockdown. (b) Analýza hladin mRNA Nrf2 a SLC7A11 pomocí RT-PCR v reálném čase u buněk MDA-MB-231 s knockdownem Nrf2 a SLC7A11. Měření byla normalizována na hladiny 18 s rRNA. Data představují průměry±s.d. (n=3); **P<0,01, nepárový Studentův t-test. (c,d) Analýza buněk Hs578T s knockdownem Nrf2 a SLC7A11. (c) Uvolňování glutamátu do média. Data představují průměry±s.d. (n=3); **P<0,01; nepárový Studentův t-test. (d) Životaschopnost buněk 24 hodin po vysazení glukózy. EGCG (50 μM) a dm-αKG (4 mM) byly přidány podle pokynů. Údaje představují průměry±s.d. (n=4). (e-g) Buňky MDA-MB-231 byly ošetřeny vehikulem (DMSO) nebo 15 μM DMF po dobu 24 h v médiu s vysokým obsahem glukózy. Další manipulace zahrnovaly knockdown SLC7A11 nebo Nrf2 a overexpresi SLC7A11. (e) Western blot hladin SLC7A11 po ošetření DMF. (f) Uvolňování glutamátu do média. Po ošetření DMF byly buňky inkubovány v čerstvém médiu s nedostatkem glukózy bez DMF a glutamát uvolněný do média byl měřen po 2 h. Data představují průměry±s.d. (n=4). (g) Životaschopnost buněk 24 h po depleci glukózy. Po předchozím ošetření DMF byly buňky inkubovány v čerstvém médiu s nedostatkem glukózy bez DMF dalších 24 h před měřením životaschopnosti buněk. Data představují průměry±s.d. (n=4); NT, bez ošetření.

Pro zkoumání účinku upregulace Nrf2 jsme buňky ošetřili dimethylfumarátem (DMF), aktivátorem Nrf2 propustným pro buňky28. Ošetření DMF způsobilo u buněk MDA-MB-231 vysokou indukci exprese SLC7A11 a uvolňování glutamátu (obr. 5e,f). Buňky předem ošetřené DMF navíc vykazovaly podstatně sníženou životaschopnost během deplece glukózy ve srovnání s kontrolními buňkami (obr. 5g). Vyloučili jsme účinky mimo cíl tím, že jsme prokázali, že tyto výsledky působení DMF jsou závislé jak na SLC7A11, tak na Nrf2 (obr. 5f,g). Souhrnně tyto výsledky naznačují, že osa Nrf2-SLC7A11 reguluje metabolismus glutamátu, závislost nádorových buněk na glukóze a jejich schopnost využívat glutamin jako alternativní zdroj uhlíku. Důležité je, že to naznačuje, že adaptace na oxidační stres u nádorových buněk může ohrozit flexibilitu živin, zejména prostřednictvím posílení fenotypu závislosti na glukóze.

xCT reguluje mitochondriální funkci v mtDNA-mutantních buňkách

Naše výše uvedená zjištění naznačují, že buňky se zvýšenou regulací systému xc- v důsledku oxidačního stresu mohou mít omezenou flexibilitu živin v důsledku zhoršeného metabolismu glutaminu. Inhibice mitochondriálního dýchacího řetězce může zvýšit reaktivní formy kyslíku29,30. Zjistili jsme, že exprese SLC7A11 byla indukována léky, které blokují mitochondriální funkci, zejména rotenonem a oligomycinem, které inhibují komplex I (NADH dehydrogenáza), respektive V (ATP syntáza) mechanismu OXPHOS (doplňkový obr. 6a). V souladu s těmito farmakologickými výsledky byla SLC7A11 zvýšena v kybridních buňkách obsahujících homoplazmatické mutace mtDNA v podjednotce ND1 komplexu I nebo v podjednotce ATP6 komplexu V (NARP) (obr. 6a)30,31 . Indukce SLC7A11 byla zvláště výrazná u buněčné linie NARP, u které byla zjištěna vysoká hladina ROS a indukce mitochondriálního enzymu MnSOD zachraňujícího ROS30. Indukce SLC7A11 v kybridních buňkách NARP byla vysoce závislá na transkripčních faktorech Nrf2 a Atf4 (doplňkový obr. 6b) a mohla být potlačena léčbou antioxidantem N-acetylcysteinem (doplňkový obr. 6c).

(a) Western blot hladin SLC7A11 u buněk 143B a izogenních buněk ND1 a NARP s mutací mtDNA. (b-e) Analýza buněk ND1 a NARP ošetřených knockdownem SLC7A11 nebo erastinem (Era) (5 μM) kultivovaných v přítomnosti 10 mM galaktózy a 2 mM glutaminu. (b) Kvantifikace intracelulárního glutamátu po 24 h po kultivaci s galaktózou. Údaje představují průměry±s.d. (n=4); ** P<0,01; nepárový Studentův t-test. (c) Životaschopnost buněk v galaktózovém médiu po dobu 3 dnů. Údaje představují průměry±s.d. (n=4). (d) Reprezentativní snímky a kvantifikace morfologie mitochondrií po 24 hodinách po kultivaci s galaktózou. Údaje představují průměry±s.d. (n=3). Měřítko 10 μm. (e) Spotřeba kyslíku byla stanovena 24 h po kultivaci s galaktózou. Údaje představují průměry±s.d. (n=5); **P<0,01; nepárový Studentův t-test. (f) Model pro duální účinky antiporteru xCT. Antiportér xCT odvádí metabolismus glutaminu z TCA cyklu do syntézy GSH, která je důležitá pro antioxidační funkci. Za určitých buněčných podmínek je nadměrný odklon glutaminu z TCA cyklu škodlivý (prostřední panel), a proto inhibice antiporteru zlepšuje přežití (pravý panel).

Zkoumali jsme, zda tyto kompenzační změny v expresi systému xc- ovlivňují buněčný metabolismus v kybridních buňkách. V souladu s jejich vyšší expresí SLC7A11 měly kybridy ND1 a NARP nižší intracelulární hladiny glutamátu (obr. 6b). Inhibice systému xc- vyřazením SLC7A11 nebo silným inhibitorem, erastinem, zvýšila intracelulární glutamát v buňkách ND1 a NARP. Podobně se inhibicí SLC7A11 zvýšil i intracelulární α-ketoglutarát, produkt metabolismu glutamátu (doplňkový obr. 6d). Již dlouho je známo, že buňky s defektem OXPHOS špatně přežívají na médiu obsahujícím galaktózu, což si vynucuje vyšší nároky na OXPHOS jako zdroj tvorby ATP32. Kybridy s mutací ND1 a NARP na rozdíl od izogenních buněk WT 143B nebyly schopny přežívat na médiu obsahujícím galaktózu (obr. 6c; doplňkový obr. 6e). Vyřazení SLC7A11 nebo léčba erastinem však silně zachránily životaschopnost ND1 a NARP kybridů v médiu obsahujícím galaktózu. Tento účinek byl nejvýraznější u kybridů NARP, které vykazovaly mnohem větší indukci SLC7A11 (obr. 6c).

Toto zvýšení životaschopnosti buněk souviselo s nápadnou normalizací morfologie mitochondrií. Naše skupina již dříve uvedla, že buňky WT prodlužují své mitochondrie za podmínek prostředí, které vyžadují zvýšenou aktivitu OXPHOS, zatímco buňky s mutací mtDNA naopak své mitochondrie fragmentují33. V souladu s tímto výsledkem vykazovaly kybridy ND1 a NARP po 24hodinové kultivaci s galaktózou výraznou fragmentaci mitochondrií. Naproti tomu kybridy s knockdownem SLC7A11 nebo ošetřené erastinem vykazovaly značné prodloužení mitochondrií, když byl zdroj uhlíku v médiu změněn z glukózy na galaktózu (obr. 6d; doplňkový obr. 6f). Vyřazení SLC7A11 nezměnilo hladiny několika proteinů mitochondriální dynamiky, včetně Opa1, Mfn1 a Drp1 (doplňkový obr. 6g). Navíc buňky s knockdownem SLC7A11 vykazovaly vyšší respirační aktivitu než buňky s kontrolním mutantem (obr. 6e). Souhrnně tyto výsledky naznačují, že inhibice systému xc- v mtDNA-mutantních kybridech zlepšuje mitochondriální morfologii a respiraci, což vede k výrazně lepšímu přežívání v galaktózovém prostředí.

.