Struktura apiksabanu, edoksabanu i rywaroksabanu. Obecnie istniejące bezpośrednie inhibitory czynnika Xa

Wiązanie inhibitorów czynnika Xa z czynnikiem XaEdit

Inhibitory czynnika Xa wszystkie wiążą się w tzw. sposób L-shape w obrębie miejsca aktywnego czynnika Xa. Kluczowymi składnikami czynnika Xa są miejsca wiążące S1 i S4. Po raz pierwszy zauważono, że naturalne związki, antistasin i TAP, które posiadają wysoce polarne, a więc naładowane składniki, wiążą się z celem z pewną specyficznością. Dlatego zaprojektowano nowsze leki z dodatnio naładowanymi grupami, ale skutkowały one słabą biodostępnością. Obecnie dostępne na rynku inhibitory czynnika Xa zawierają zatem pierścień aromatyczny z różnymi cząsteczkami przyłączonymi w celu uzyskania różnych interakcji z miejscami wiązania S1 i S4. Zapewnia to również dobrą biodostępność, jak również utrzymanie siły wiązania. Inhibitory czynnika Xa dostępne obecnie na rynku opierają się zatem na wiązaniach hydrofobowych i wodorowych zamiast na wysoce polarnych interakcjach.

Antystasyna wiążąca się z czynnikiem XaEdit

Antystasyna zawiera domenę N- i C-końcową, które są podobne w swoich sekwencjach aminokwasowych z ~40% identycznością i ~56% homologią. Każda z nich zawiera krótką strukturę arkusza β i 5 wiązań disulfidowych. Tylko domena N-końcowa jest niezbędna do hamowania Xa, podczas gdy domena C-końcowa nie przyczynia się do właściwości inhibicyjnych ze względu na różnice w strukturze trójwymiarowej, mimo że domena C-końcowa ma silnie analogiczny wzór do rzeczywistego miejsca aktywnego.

Interakcja antystazyny z FXa obejmuje zarówno miejsce aktywne, jak i nieaktywną powierzchnię FXa. Miejsce reaktywne antystaszyny utworzone przez Arg-34 i Val-35 w N-końcowej domenie odpowiada miejscu wiązania FXa, najprawdopodobniej kieszeni S1. Jednocześnie, Glu-15 znajdujący się poza miejscem reaktywnym antystaszyny pasuje do dodatnio naładowanych reszt na powierzchni FXa. Wiązanie wielokrotne jest termodynamicznie korzystne i prowadzi do sub-nanomolarnej inhibicji (Ki = 0,3-0,6 nM).

Wiązanie DX-9065a z czynnikiem XaEdit

DX-9065a, pierwszy małocząsteczkowy bezpośredni inhibitor Xa, jest pochodną amidinoarylową o masie cząsteczkowej 571,07g/mol. Jego dodatnio naładowana grupa amidinonaftalenowa tworzy mostek solny do reszty Asp-189 w kieszeni S1 FXa. Pierścień pirrolidynowy mieści się pomiędzy Tyr-99, Phe-174 i Trp-215 w kieszeni S4 FXa.

W przeciwieństwie do starszych leków, np. heparyny, DX-9065a jest selektywny dla FXa w porównaniu z trombiną, mimo że FXa i trombina mają podobną budowę. Jest to spowodowane różnicą w resztach aminokwasowych w pozycji homologicznej 192. Podczas gdy FXa ma w tej pozycji resztę glutaminową, trombina ma kwas glutaminowy, który powoduje odpychanie elektrostatyczne z grupą karboksylową DX-9065a. Ponadto mostek solny pomiędzy Glu-97 trombiny a grupą amidynową umocowaną w pierścieniu pirolidynowym DX-9065a zmniejsza elastyczność cząsteczki DX-9065a, która nie może teraz obrócić się na tyle, aby uniknąć zderzenia elektrostatycznego. Dlatego wartość IC50 dla trombiny wynosi >1000µM, podczas gdy wartość IC50 dla FXa wynosi 0,16µM.

Wiązanie rywaroksabanu z kieszeniami S1 i S4 czynnika Xa. Tworzą się dwa wiązania wodorowe, które odgrywają ważną rolę w kierowaniu rywaroksabanu do podłoży S1 i S4. Dzięki tym wiązaniom wodorowym riwaroksaban tworzy kształt litery L i mieści się w tych kieszeniach. Podstawnik chlorowy leku oddziałuje z Tyr-228 w kieszeni S1, co umożliwia uzyskanie przez rywaroksaban dobrej doustnej dostępności biologicznej i siły działania.

Wiązanie rywaroksabanu z czynnikiem XaEdit

Wiązanie rywaroksabanu z FXa odbywa się za pośrednictwem dwóch wiązań wodorowych z aminokwasem Gly-219. Te dwa wiązania wodorowe pełnią ważną rolę w kierowaniu leku do miejsc S1 i S4 FXa. Pierwsze wiązanie wodorowe jest silnym oddziaływaniem, które pochodzi od tlenu karbonylowego rdzenia oksazolidynonowego rywaroksabanu. Drugie wiązanie wodorowe jest słabszą interakcją i pochodzi od grupy aminowej karboksyamidowej cząsteczki klorotiofenowej.

Te dwa wiązania wodorowe powodują, że lek tworzy kształt litery L i mieści się w kieszeniach S1 i S4. Reszty aminokwasowe Phe-174, Tyr-99 i Trp-215 tworzą wąski kanał hydrofobowy, który jest kieszenią wiążącą S4. Część morfolinonowa rywaroksabanu jest „wciśnięta” pomiędzy aminokwasy Tyr-99 i Phe-174, a pierścień arylowy rywaroksabanu jest zorientowany prostopadle do Trp-215. Grupa karbonylowa morfolinonu nie ma bezpośredniej interakcji ze szkieletem FXa, zamiast tego przyczynia się do planaryzacji pierścienia morfolinonu i dlatego wspiera riwaroksaban w umieszczeniu między dwoma aminokwasami.

Interakcja między podstawnikiem chlorowym cząsteczki tiofenowej a pierścieniem aromatycznym Tyr-228, który znajduje się na dole S1, jest bardzo ważna ze względu na fakt, że eliminuje potrzebę silnie zasadowych grup dla wysokiego powinowactwa do FXa. Dzięki temu rywaroksaban, który jest niebazowy, może osiągnąć dobrą doustną biodostępność i siłę działania.

Wiązanie apiksabanu z kieszeniami S1 i S4 czynnika Xa. Atom azotu pirazolu N-2 apiksabanu oddziałuje z aminokwasem Gln-192 w kieszeni S4. Tlen karbonylowy oddziałuje z Gly-216 w kieszeni S1, jak również oddziałuje z cząsteczką wody.

Wiązanie apiksabanu z czynnikiem XaEdit

Apiksaban wykazuje podobny sposób wiązania jak rywaroksaban i tworzy ścisły kompleks inhibitor-enzym po przyłączeniu do FXa. Grupa p-metoksy apiksabanu łączy się z kieszenią S1 FXa, ale nie wydaje się mieć żadnych interakcji z żadnymi resztami w tym regionie FXa. Atom azotu pirazolu N-2 apiksabanu oddziałuje z Gln-192, a tlen karbonylowy oddziałuje z Gly-216. Grupa fenylo-laktamowa apiksabanu znajduje się pomiędzy Tyr-99 a Phe-174 i dzięki swojej orientacji może oddziaływać z Trp-215 kieszeni S4. Karbonylowa grupa tlenowa cząsteczki laktamowej oddziałuje z cząsteczką wody i nie wydaje się oddziaływać z żadnymi resztami w kieszeni S4.

SAR rywaroksabanu z uwzględnieniem końcowych cząsteczek. Podczas badań SAR zdefiniowano R1 jako grupę najważniejszą dla siły działania. Pirolidynon był pierwszą grupą funkcyjną R1, która znacząco zwiększyła siłę działania, ale dalsze badania wykazały jeszcze większą siłę działania z grupą morfolinonową. Grupy R2 i R3 miały dołączony wodór lub fluor i szybko oceniono, że posiadanie wodoru skutkowało najwyższą siłą działania

Zależność struktura-aktywność-relacja (SAR)Edycja

Ważną częścią projektowania związku, który jest idealnym inhibitorem określonego celu, jest zrozumienie sekwencji aminokwasowej miejsca docelowego, do którego związek ma się wiązać. Modelowanie zarówno protrombiny jak i FXa pozwala na odjęcie różnic i zidentyfikowanie aminokwasów w każdym miejscu wiązania. Na dnie kieszeni S1 w FXa aminokwasem wiążącym jest Asp-189, z którym mogą wiązać się cząsteczki amidynowe. Po prześwietleniu miejsca wiązania FXa okazało się, że kieszeń S1 ma planarny kształt, co oznacza, że płaska grupa amidinoarylowa powinna się do niej wiązać bez przeszkód sterycznych.

Nowoczesne bezpośrednie inhibitory Xa to cząsteczki w kształcie litery L, których końce idealnie pasują do kieszeni S1 i S4. Długa strona kształtu L musi być zgodna z wysoce specyficznym tunelem w miejscu aktywnym celu. Aby to osiągnąć, ta część cząsteczki została zaprojektowana tak, aby miała niewiele formalnych interakcji z FXa w tym regionie. Ponieważ nie ma tam specyficznego wiązania, dopasowanie tych czynników pomiędzy kieszeniami FXa zwiększa całkowitą specyficzność leków w stosunku do cząsteczki FXa. Interakcja między kieszenią S1 FXa a inhibitorem może być zarówno jonowa, jak i niejonowa, co jest ważne, ponieważ pozwala na dostosowanie konstrukcji cząsteczki w celu zwiększenia doustnej biodostępności. Wcześniej zaprojektowane związki były cząsteczkami naładowanymi, które nie wchłaniają się dobrze w przewodzie pokarmowym i dlatego nie osiągały wysokich stężeń w surowicy. Nowsze leki mają lepszą biodostępność, ponieważ nie są naładowane i mają niejonową interakcję z kieszenią S1.

Rivaroxaban

Podczas opracowywania SAR dla rivaroxabanu badacze zdali sobie sprawę, że dodanie grupy 5-chlorotiofen-2-karboksyamidowej do rdzenia oksazolidoniny może zwiększyć siłę działania o 200 razy, która wcześniej była zbyt słaba do zastosowań medycznych. Oprócz tego odkrycia potwierdzono wyraźną preferencję dla konfiguracji (S)-. Związek ten miał obiecujący profil farmakokinetyczny i nie zawierał wysoce zasadowej grupy amidynowej, która wcześniej była uważana za istotną dla interakcji z kieszenią S1. Wyniki te doprowadziły do szeroko zakrojonych badań SAR (structure-activity relationship). Podczas badań SAR, R1 została zdefiniowana jako najważniejsza grupa dla siły działania. Pierwszą grupą funkcyjną R1, która znacząco zwiększyła siłę działania był pirolidynon, ale dalsze badania wykazały jeszcze większą siłę działania z grupą morfolinonową. Grupy R2 i R3 miały dołączony wodór lub fluor i szybko oceniono, że posiadanie wodoru spowodowało najwyższą siłę działania. Grupy R2 i R3 zostały następnie zastąpione różnymi grupami, z których wszystkie były mniej silne niż wodór, więc wodór był ostatecznym wynikiem. Ponieważ część cząsteczki chlorotiofenowej miała nieodpowiednią rozpuszczalność w wodzie, próbowano zastąpić ją inną grupą, ale nie powiodło się. Cząsteczka chlorotiofenowa wiąże się z Tyr-228 w dolnej części kieszeni S1, co czyni ją kluczowym czynnikiem w wiązaniu z FXa. Rivaroxaban ma zarówno wysokie powinowactwo, jak i dobrą biodostępność.

Struktura apiksabanu, przed dostosowaniem cząsteczek w celu uzyskania maksymalnej siły działania

Apiksaban

Pośrednia cząsteczka 13F przed pełnym opracowaniem apiksabanu

Podczas opracowywania SAR apiksabanu istniały trzy grupy, które należało przetestować w celu uzyskania maksymalnej siły działania i biodostępności. Pierwszą grupą do zbadania było miejsce nieaktywne, ponieważ musi być ono ustabilizowane przed badaniem SAR na grupie p-metoksyfenylowej (cząsteczka wiążąca S1). Istnieje kilka grup, które zwiększają siłę działania związku, głównie amidy, aminy i tetrazole, ale także grupy metylosulfonylowe i trifluorometylowe. Z tych grup karboksyamid ma największe wiązanie i miał podobną aktywność krzepnięcia jak związki.

W badaniach na psach, ten związek z grupą karboksyamidową o nazwie 13F, wykazywał świetny profil farmakokinetyczny, niski klirens i odpowiedni okres półtrwania i objętość dystrybucji. Ze względu na sukces w znalezieniu grupy stabilizującej zaprzestano badań SAR dla grupy wiążącej S1 (p-metoksyfenylu). W grupie wiążącej S4 analogi N-metyloacetylowe i laktamowe wykazały bardzo wysokie powinowactwo wiązania do FXa, dużą krzepliwość i selektywność w stosunku do innych proteaz. Istotna okazała się orientacja, gdyż N-metyloacetyl, w porównaniu z acetamidem, miał 300-krotnie mniejszą zdolność wiązania z FXa ze względu na niekorzystną planaryzację w pobliżu miejsca wiązania regionu S4.

SynthesisEdit

RivaroxabanEdit

Rivaroxaban chemicznie należy do grupy n-aryloxazolidinonów. Inne leki z tej grupy to linezolid i tedizolid, z których oba są antybiotykami. Synteza n-aryloksazolidynonów rozpoczynająca się od chronionego O-silylem karbaminianu etylu(2,3-dihydroksypropylu)została opublikowana w 2016 roku. W reakcji typu one-pot karbaminian ulega cyklizacji do pierścienia 2-oksazolidonowego w warunkach lekko zasadowych, podczas gdy jednocześnie azot oksazolidonowy ulega aryzacji w wyniku katalizy miedziowej. Szczególnie w przypadku rywaroksabanu, 3-morfolinon zastępuje jod w pozycji p pierścienia benzenowego w procesie katalizy miedziowej. Następnie usuwa się sililową grupę ochronną, a powstały alkohol zastępuje się grupą aminową, która w ostatnim etapie jest acylowana.

Przemysłowy preparat rivaroxabanu został zarejestrowany jako patent przez Bayer Healthcare w 2005 roku. Rozpoczyna się on od N-(4-aminofenol)-morfolinonu, który jest alkilowany przez pochodną tlenku propylenu, zawierającą również aminę pierwszorzędową związaną z ftalimidową grupą ochronną. Następnie dodaje się odpowiednik fosgenu w celu utworzenia pierścienia 2-oksazolidonowego i usuwa się ftalimid. Wolna amina może być teraz acylowana, co prowadzi do powstania rywaroksabanu.

Jednakże według patentu synteza ta ma „różne wady w zarządzaniu reakcją, co ma szczególnie niekorzystne skutki dla preparatu”. Patent wyjaśnia również inną syntezę rozpoczynającą się od pochodnej chlorotiofenu, która byłaby bardziej odpowiednia dla procesu przemysłowego, ale zwraca uwagę, że toksyczne rozpuszczalniki lub odczynniki muszą być usunięte z produktu końcowego. Dlatego sposób ten nie stanowi alternatywy.

Opisano różne inne ścieżki syntezy rywaroksabanu.

Synteza rywaroksabanu opatentowana przez firmę Bayer Healthcare w 2005 r.
1. etap: Alkilowanie pierwszorzędowej aminy aromatycznej
2. krok: Tworzenie pierścienia 2-oksazolinidonu, przy użyciu odpowiednika fosgenu
3. krok: Usunięcie ftalimidowej grupy ochronnej
4. krok: Acylowanie pierwszorzędowej aminy

ApiksabanEdit

Pierwsza pełna synteza apiksabanu została opublikowana w 2007 roku. Kluczowym etapem tej reakcji jest (3+2)cykloaddycja pochodnej p-metoksyfenylochlorohydrazonu i pochodnej p-jodofenylo-morfoliny-dihydropirydyny. Po następującej eliminacji HCl i morfoliny, jod podstawia się 2-piperydynonem na drodze katalizy miedziowej, a ester etylowy przekształca się w amid (aminoliza). Reakcja ta została zarejestrowana jako patent w 2009 roku.

Synteza apiksabanu, opublikowana przez Pinto, et al. w 2007 roku. Godnym uwagi kluczowym etapem jest (3+2)cykloaddycja pochodnej p-metoksyfenylochlorohydrazonu i pochodnej p-jodofenylo-morfoliny-dihydropirydyny w pierwszej reakcji.

.