Upptäckt och utveckling av direkta Xa-hämmare
Factor Xa: Struktur och bindningsställenEdit
Faktorerna IIa, Xa, VIIa, IXa och XIa är alla proteolytiska enzymer som har en specifik roll i koagulationskaskaden. Faktor Xa (FXa) är den mest lovande på grund av sin position i skärningspunkten mellan den intrinsiska och extrinsiska vägen samt att den genererar omkring 1 000 trombinmolekyler för varje Xa-molekyl, vilket resulterar i en potent antikoagulerande effekt. FXa genereras från FX genom klyvning av en aktiveringspeptid med 52 aminosyror, eftersom ”a” i faktor Xa betyder aktiverad. FXa består av en katalytisk domän med 254 aminosyror och är också kopplad till en lätt kedja med 142 aminosyror. Kedjan innehåller både GLA-domän och två epidermala tillväxtfaktordomäner (EGF-liknande domäner).
Den aktiva platsen för FXa är strukturerad för att katalysera klyvningen av fysiologiska substrat och klyver PhePheAsnAsnProArg-ThrPhe och TyrIleAspGlyArg-IleVal i protrombin. FXa har fyra så kallade fickor som är mål för substrat som ska binda till faktor Xa. Dessa fickor är uppradade av olika aminosyror och Xa-hämmare riktar in sig på dessa fickor när de binder till faktor Xa. De två mest relevanta fickorna när det gäller affinitet och selektivitet för Xa-hämmare är S1 och S4.
S1: S1-fickan är en hydrofob ficka och innehåller en asparaginsyrarest (Asp-189) som kan fungera som en igenkänningsplats för en basisk grupp. FXa har ett restutrymme i S1-fickan som kantas av resterna Tyr-228, Asp-189 och Ser-195.
S2: S2-fickan är en liten och ytlig ficka. Den går samman med S4-fickan och har plats för små aminosyror. Tyr-99 verkar blockera tillgången till denna ficka, så denna ficka är inte lika viktig som S1 och S4.
S3: S3-fickan ligger på kanten av S1-fickan och är platt och exponerad mot lösningsmedlet. Denna ficka är inte lika viktig som S1 och S4.
S4: S4-fickan är hydrofob till sin natur och fickans golv utgörs av Trp-215-rester. Resterna Phe-174 och Tyr-99 i FXa förenas med Trp-215 för att bilda en aromatisk låda som kan binda alifatiska, aromatiska och positivt laddade fragment. På grund av bindningen till positivt laddade enheter kan den beskrivas som ett katthål.
Kemisk struktur och egenskaper hos direkta Xa-hämmareEdit
| Rivaroxaban | Apixaban | Edoxaban | ||
|---|---|---|---|---|
| MW (g/mol) | 436 | 460 | 548 | |
| Molekylär formel | C19H18ClN3O5S | C25H25N5O4 | C24H30ClN7O4S | |
| Form | L | L | L | L |
| Ki | 0.4 nM | 0,08 nM | 0.561 nM | |
| IC50 | 0.7 nM | N/A | N/A | |
| Oral biotillgänglighet (%) | 66-100 (dos-beroende) | 50 | 62 |
Bindning av Xa-hämmare till faktor XaEdit
Xa-hämmarna binder alla på ett s.k. L-formigt sätt inom den aktiva platsen för faktor Xa. De viktigaste beståndsdelarna i faktor Xa är S1- och S4-bindningsställena. Det noterades först att de naturliga föreningarna, antistasin och TAP, som har mycket polära och därför laddade komponenter binder till målet med viss specificitet. Därför utformades nyare läkemedel med positivt laddade grupper, men dessa resulterade i dålig biotillgänglighet. Numera marknadsförda Xa-hämmare innehåller därför en aromatisk ring med olika delar som är knutna för olika interaktioner med S1- och S4-bindningsställena. Detta säkerställer också god biotillgänglighet och bibehåller en fast bindningsstyrka. De Xa-hämmare som idag finns på marknaden förlitar sig därför på hydrofoba och vätebindningar istället för starkt polära interaktioner.
Antistasins bindning till faktor XaEdit
Antistasin innehåller en N- och en C-terminal domän som är likartade i sina aminosyresekvenser med ~40% identitet och ~56% homologi. Var och en av dem innehåller en kort β-bladstruktur och 5 disulfidbindningar. Endast den N-terminala domänen är nödvändig för att hämma Xa medan den C-terminala domänen inte bidrar till de hämmande egenskaperna på grund av skillnader i den tredimensionella strukturen, även om den C-terminala domänen har ett starkt analogt mönster till den faktiska aktiva platsen.
Antistasins interaktion med FXa involverar både den aktiva platsen och den inaktiva ytan av FXa. Den reaktiva platsen för antistasin som bildas av Arg-34 och Val-35 i den N-terminala domänen passar till bindningsstället för FXa, troligen S1-fickan. Samtidigt passar Glu-15 som ligger utanför den reaktiva platsen för antistasin till positivt laddade rester på FXas yta. Den multipla bindningen är termodynamiskt fördelaktig och leder till subnanomolär hämning (Ki = 0,3-0,6 nM).
DX-9065a-bindning till faktor XaEdit
DX-9065a, den första småmolekylära direkta Xa-hämmaren, är ett amidinoarylderivat med en molekylvikt på 571,07 g/mol. Dess positivt laddade amidinonaphtalengrupp bildar en saltbrygga till Asp-189-restigen i S1-fickan hos FXa. Pyrrolidinringen passar mellan Tyr-99, Phe-174 och Trp-215 i S4-fickan hos FXa.
Till skillnad från äldre läkemedel, t.ex. heparin, är DX-9065a selektivt för FXa jämfört med trombin, trots att FXa och trombin är likartade i sin struktur. Detta orsakas av en skillnad i aminosyraresten i homologens position 192. Medan FXa har en glutaminrest i den positionen har trombin en glutaminsyra som orsakar elektrostatisk repulsion med DX-9065as karboxylgrupp. Dessutom minskar en saltbrygga mellan Glu-97 i trombin och amidin-gruppen i DX-9065as pyrrolidinring flexibiliteten hos DX-9065a-molekylen, som nu inte kan rotera tillräckligt för att undvika den elektrostatiska kollisionen. Därför är IC50-värdet för trombin >1000µM medan IC50-värdet för FXa är 0,16µM.
Rivaroxabans bindning till faktor XaEdit
Rivaroxabans bindning till FXa förmedlas genom två vätebindningar till aminosyran Gly-219. Dessa två vätebindningar har en viktig roll för att styra läkemedlet till S1- och S4-subsiterna hos FXa. Den första vätebindningen är en stark interaktion som kommer från karbonylsyre i rivaroxabans oxazolidinonkärna. Den andra vätebindningen är en svagare interaktion och kommer från aminogruppen i klorothiofenkarboxamiddelen.
Dessa två vätebindningar leder till att läkemedlet bildar en L-form och passar in i S1- och S4-fickorna. Aminosyraresterna Phe-174, Tyr-99 och Trp-215 bildar en smal hydrofob kanal som är S4-bindningsfickan. Morpholinondelen av rivaroxaban är ”inbäddad” mellan aminosyrorna Tyr-99 och Phe-174 och rivaroxabans arylring är orienterad vinkelrätt över Trp-215. Morfolinonets karbonylgrupp har ingen direkt interaktion med FXa-ryggen, i stället bidrar den till en planarisering av morfolinonringen och stödjer därför att rivaroxaban är insprängt mellan de två aminosyrorna.
Interaktionen mellan klorsubstituenten i tiofenpartiet och den aromatiska ringen av Tyr-228, som är belägen längst ner i S1, är mycket viktig på grund av att den undviker behovet av starkt basiska grupper för hög affinitet för FXa. Detta gör det möjligt för rivaroxaban, som inte är basiskt, att uppnå god oral biotillgänglighet och potens.
Apixabans bindning till faktor XaEdit
Apixaban uppvisar ett liknande bindningssätt som rivaroxaban och bildar ett tätt inhibitor-enzymkomplex när det är kopplat till FXa. Apixabans p-metoxygrupp ansluter till S1-fickan av FXa men verkar inte ha någon interaktion med några rester i denna region av FXa. Pyrazols N-2 kväveatom i apixaban interagerar med Gln-192 och karbonylsyre interagerar med Gly-216. Fenyllaktamgruppen i apixaban är placerad mellan Tyr-99 och Phe-174 och på grund av sin orientering kan den interagera med Trp-215 i S4-fickan. Lactamgruppens karbonylsyragrupp interagerar med en vattenmolekyl och verkar inte interagera med några rester i S4-fickan.
Structure-activity-relationship (SAR)Edit
En viktig del av utformningen av en förening, som är en idealisk hämmare av ett visst mål, är att förstå aminosyrasekvensen av målplatsen för föreningen att binda till. Modellering av både protrombin och FXa gör det möjligt att avleda skillnaden och identifiera aminosyrorna vid varje bindningsställe. I botten av S1-fickan på FXa är den bindande aminosyran Asp-189 som amidinmolekyler kan binda till. Efter röntgen av bindningsstället för FXa visade det sig att S1-fickan hade en plan form, vilket innebär att en plan amidinoarylgrupp borde binda till den utan steriskt hinder.
Moderna direkta Xa-hämmare är L-formade molekyler vars ändar passar perfekt i S1- och S4-fickorna. Den långa sidan av L-formen måste anpassa sig till en mycket specifik tunnel i målets aktiva plats. För att åstadkomma detta är denna del av molekylerna utformad så att den har små formella interaktioner med FXa i den regionen. Eftersom det inte finns någon specifik bindning ökar dessa medels inpassning mellan FXas fickor den totala specificiteten hos läkemedlen i förhållande till FXa-molekylen. Interaktionen mellan S1-fickan i FXa och inhibitorn kan vara både jonisk och icke-jonisk, vilket är viktigt eftersom det gör det möjligt att anpassa utformningen av delen för att öka den orala biotillgängligheten. Tidigare utformade föreningar var laddade molekyler som inte absorberas väl i mag-tarmkanalen och därför inte nådde höga serumkoncentrationer. De nyare läkemedlen har en bättre biotillgänglighet eftersom de inte är laddade och har en icke-jonisk interaktion med S1-fickan.
Rivaroxaban
Under SAR-utvecklingen av rivaroxaban insåg forskarna att om man lade till en 5-chlorothiopen-2-carboxamidgrupp till oxazolidoninkärnan skulle man kunna öka styrkan med 200 gånger, vilket tidigare hade varit för svagt för medicinsk användning. Förutom denna upptäckt bekräftades en tydlig preferens för (S)-konfigurationen. Denna förening hade en lovande farmakokinetisk profil och innehöll inte en mycket basisk amidingrupp, men som tidigare hade ansetts viktig för interaktionen med S1-fickan. Dessa resultat ledde till omfattande SAR-undersökningar (struktur-aktivitetsförhållande). Under SAR-testningen definierades R1 som den viktigaste gruppen för potensen. Pyrrolidinon var den första R1-funktionella gruppen som signifikant ökade potensen, men ytterligare undersökningar visade på ännu högre potens med en morfolinongrupp i stället. Grupperna R2 och R3 hade väte eller fluor som bindemedel och det bedömdes snabbt att väte gav den högsta potensen. Grupperna R2 och R3 byttes sedan ut mot olika grupper, som alla var mindre potenta än väte, så väte blev slutresultatet. Eftersom klorothiofen-gruppen hade en otillräcklig vattenlöslighet försökte man ersätta den med en annan grupp, men detta misslyckades. Klorothiofen-gruppen binder till Tyr-228 i botten av S1-fickan, vilket gör den till en nyckelfaktor när det gäller bindning till FXa. Rivaroxaban har både hög affinitet och god biotillgänglighet.
Apixaban
Under SAR-utvecklingen av apixaban fanns det tre grupper som behövde testas för att uppnå maximal potens och biotillgänglighet. Den första gruppen som testades var den icke-aktiva platsen eftersom den måste stabiliseras före SAR-testning av p-metoxifenylgruppen (S1-bindningsdelen). Det finns flera grupper som ökar föreningens styrka, främst amider, aminer och tetrazoler, men även metylsulfonyl- och trifluormetylgrupper. Av dessa grupper har karboxamid den största bindningen och hade liknande koagulationsaktivitet som föreningarna.
I hundförsök visade denna förening med en karboxamidgrupp, kallad 13F, en utmärkt farmakokinetisk profil, ett lågt clearance och adekvat halveringstid och distributionsvolym. På grund av att man lyckades hitta en stabiliserande grupp, avbröts SAR-forskningen för S1-bindningsdelen (p-metoxifenyl). I den S4-bindande gruppen visade sig N-metylacetyl- och lactamanaloger ha en mycket hög bindningsaffinitet för FXa, visade stor koagulation och selektivitet gentemot andra proteaser. Orienteringen visade sig vara viktig eftersom N-metylacetyl, jämfört med acetamid, hade en 300 gånger lägre bindningsförmåga till FXa på grund av ogynnsam planaritet nära S4-regionens bindningsställe.
SynthesisEdit
RivaroxabanEdit
Rivaroxaban hör kemiskt till gruppen n-aryloxazolidinoner. Andra läkemedel i den gruppen är linezolid och tedizolid, som båda är antibiotika. En syntes av n-aryloxazolidinoner med utgångspunkt i en O-silylskyddad etyl(2,3-dihydroxypropyl)-karbamat publicerades 2016. I en enstegsreaktion cykliserar karbamaten till en 2-oxazolidonring under svagt basiska förhållanden samtidigt som oxazolidonkvävet aryliseras genom kopparkatalisering. För rivaroxaban i synnerhet ersätter 3-morfolinon jodet i p-positionen i bensenringen genom kopparkatalisering. Därefter avlägsnas silylskyddsgruppen och den resulterande alkoholen ersätts av en aminogrupp som sedan acyleras i det sista steget.
En industriell beredning av rivaroxaban registrerades som patent av Bayer Healthcare 2005. Det utgår från N-(4-aminofenol)-morfolinon som alkyleras av ett propylenoxidderivat som också innehåller en primär amin involverad i en ftalimidskyddsgrupp. Därefter tillsätts en fosgenekvivalent för att bilda 2-oxazolidonringen och ftalimiden avlägsnas. Den fria aminen kan nu acyleras vilket leder till rivaroxaban.
Enligt patentet har syntesen dock ”olika nackdelar i reaktionshanteringen som har särskilt ogynnsamma effekter för beredningen”. Patentet förklarar också en annan syntes som utgår från ett klorothiofenderivat och som skulle vara mer lämplig för den industriella processen, men påpekar att giftiga lösningsmedel eller reagenser måste avlägsnas från slutprodukten. Därför är detta sätt inte ett alternativ.
Flera andra syntesvägar för rivaroxaban har beskrivits.
1:a steget: Alkylering av den primära aromatiska aminen
2:a steget: Bildning av 2-oxazolinidonringen med hjälp av en fosgenekvivalent
3: Avlägsnande av ftalimidskyddsgruppen
4:e steget: Acylering av den primära aminen
ApixabanEdit
Den första fullständiga syntesen av apixaban publicerades 2007. Nyckelsteget i denna reaktion är en (3+2)cycloaddition av ett p-metoxifenylklorhydrazonderivat och ett p-jodfenylmorfolin-dihydropyridinderivat. Efter följande eliminering av HCl och morfolin substitueras jodet med 2-piperidinon genom kopparkatalisering och etylestern omvandlas till en amid (aminolys). Denna reaktion registrerades som patent 2009.
