B Fotoreceptory

Zwyrodnienia fotoreceptorów są najczęstszą formą ślepoty w świecie zachodnim i wiążą się z utratą wzroku z powodu dystrofii i/lub śmierci fotoreceptorów siatkówki. Patologie te można z grubsza podzielić na takie, które początkowo wpływają na fotoreceptory pręcikowe, jak retinitis pigmentosa (RP), i takie, które początkowo wpływają na fotoreceptory czopkowe, jak zwyrodnienie plamki żółtej.141 Chociaż degeneracja fotoreceptorów może być również spowodowana pośrednio przez pierwotne defekty w RPE, który pełni ważną funkcję w zdrowiu i homeostazie fotoreceptorów, temat ten zostanie omówiony w dalszej części (patrz część II.C).

Fotoreceptory są wysoce spolaryzowanymi komórkami czuciowymi, które składają się z segmentu wewnętrznego (IS), który jest połączony z segmentem zewnętrznym (OS) przez wysoce zmodyfikowane cilium (Ryc. 5).189 W dojrzałych fotoreceptorach białka, które są wymagane do wzrostu i utrzymania OS fotoreceptorów, jak również do fototransdukcji, są transportowane wzdłuż spolaryzowanych mikrotubul z bazalnego IS do apikalnego OS. Fotoreceptory są podobne do komórek nabłonkowych w tym, że ich powierzchnie są podzielone na domeny apikalne i basolateralne przez połączenia komórkowe. Ich centrosomy s± zlokalizowane na powierzchni apikalnej, podczas gdy j±dra znajduj± się na powierzchni bazalnej.190 Prawidłowy rozwój i utrzymanie fotoreceptorów kręgowców zależy od ustanowienia wła¶ciwej polaryzacji apikalno-podstawnej, jak również od funkcjonowania mechanizmów transportowych. Nie jest zatem zaskakujące, że spośród ponad 100 genetycznych loci, o których wiadomo, że powodują degeneracje fotoreceptorów u kręgowców, większość wpływa na strukturę i funkcję OS.191

Fig. 5. Budowa fotoreceptorów pręcikowych i czopkowych. Komórki fotoreceptorowe składają się z segmentu zewnętrznego, który zawiera krążki błonowe związane z pigmentem wzrokowym. Segment wewnętrzny jest spolaryzowanym ciałem komórkowym fotoreceptora, w którym jądro znajduje się od strony podstawowej, a cilium rozpoczyna się apikalnie i rozciąga się do OS. Terminal synaptyczny tworzy połączenia synaptyczne z interneuronami siatkówki, przekazując informacje wizualne.161,188

Badania genetyczne u zebrafish rzuciły światło na molekularne podstawy tych funkcji komórkowych poprzez wyizolowanie mutantów, w których rozwój i/lub utrzymanie fotoreceptorów jest wadliwe.24,192,193 U jednego z takich mutantów, mosaic eyes (moe), stwierdzono obecność rozszerzonych cech apikalnych w fotoreceptorach.20,21 locus moe koduje białko zawierające domenę FERM, które tworzy kompleks z białkami Crumbs, które z kolei okazały się krytyczne dla biegunowości apikalno-podstawnej u Drosophila, jak również u kręgowców.194-196 Co ciekawe, mutacje w ludzkim ortologu Crumbs, CRB1, są związane z dystrofiami fotoreceptorów siatkówki, takimi jak RP 12197 i wrodzona amauroza Lebera (LCA1; ref. 198,199). Inne mutanty zebrafish, takie jak nagie oko (nok) i heart and soul (has) nie tylko odwzorowują fenotyp mutanta moe, ale białka, które kodują (odpowiednio Pals1 i PKCi) również oddziałują biochemicznie z Moe.20 Ponadto, morfolino knockdown z crb2b, paralogu zebrafish Crumbs, skutkuje redukcją rozmiaru IS.14 Badania te rozpoczęły więc odkrywanie roli kompleksu Crumbs w rozwoju fotoreceptorów kręgowców i w chorobach.

Powstanie prawidłowej polaryzacji apikalno-podstawnej zależy nie tylko od właściwej funkcji determinantów polaryzacji komórek, ale także od ich transportu i lokalizacji. Fotoreceptory w siatkówce mutanta ale oko (ako) gromadzą determinanty apikalne Pals1 i PKCλ w swoich ciałach komórkowych i wykazują rozległą śmierć fotoreceptorów w późnym okresie rozwoju.19 Locus ako koduje podjednostkę p50 kompleksu dynaktyny, która pełni ważną rolę w transporcie ładunku wzdłuż mikrotubul jako część kompleksu motorycznego dyneiny.200 U innego mutanta, mikre oko (mok), który posiada mutację w dynaktynie-1, degeneracja siatkówki jest przynajmniej częściowo spowodowana błędną lokalizacją jąder fotoreceptorów. Co zaskakuj±ce, w przeciwieństwie do mutantów ako, determinanty apikalne, takie jak Crumbs i aPKCλ nie ulegaj± błędnej lokalizacji, co sugeruje, że degeneracja w tych mutantach nie jest spowodowana utrat± biegunowo¶ci komórek. Eksperymentalna błędna lokalizacja jądra przez nadekspresję silnika dyneinowego spowodowała śmierć komórki fotoreceptora, wspierając rolę pozycji jądrowej w przeżyciu fotoreceptora.201 Podczas gdy defekty pozycji jądrowej w fotoreceptorach mok wydają się mieć rolę autonomiczną dla komórki, inne niekomórkowe komponenty wydają się odgrywać rolę w degeneracji mok. Analizy mozaikowe ujawniły, że zmutowane fotoreceptory wykazują ponad 2,5-krotny wzrost przeżywalności, gdy są umieszczone w środowisku typu dzikiego.17 To odkrycie sugeruje, że zdrowie i przeżycie fotoreceptorów zależy od wskazówek środowiskowych z otaczających komórek. Odkrycia te są zgodne z defektami związanymi z niektórymi ludzkimi zwyrodnieniami, takimi jak RP, gdzie początkowy defekt w rodopsynie specyficznej dla pręcików ostatecznie prowadzi do utraty zarówno pręcików jak i czopków.202

Transport z ciała komórki do OS jest również ważny dla zastąpienia składników OS, które są tracone z powodu ciągłej fagocytozy OS fotoreceptorów przez nadległe RPE.203 W fotoreceptorach, podobnie jak w rzęskach, transport odbywa się w procesie znanym jako transport wewnątrzfaglagellarny (IFT), a mutacje w genach składowych IFT, takich jak ift57, ift80, ift88 i ift172, powodują atrofię OS i/lub całkowitą utratę OS u zebrafish.24-26 Mutacje w genie elipsa, który koduje białko mające ułatwiać IFT,35 powodują wczesną utratę fotoreceptorów,22 podczas gdy morfolino knockdown wielu podjednostek motoru wstecznego IFT dyneiny-2 podkreślił znaczenie IFT dla prawidłowego wydłużania OS i funkcji wzrokowych.204 Zwyrodnienia fotoreceptorów związane z defektem IFT są jednymi z wielu fenotypów związanych z rzęsistkowatością związanych z zespołem Bardeta-Biedla (BBS),205 a dalsze badania funkcji komponentów IFT u zeberek mogą okazać się kluczowe dla lepszego zrozumienia molekularnych przyczyn leżących u podstaw patologii ocznych związanych z BBS.

Podczas gdy mutanty opisane do tej pory w tej sekcji zostały wyizolowane w badaniach genetycznych wykorzystujących głównie metody histologiczne do wykrywania defektów fotoreceptorów, inne zostały wyizolowane w badaniach behawioralnych.15,82,206,207 Jeden z takich przesiewów wykorzystał zdolność zebrafish do wykazywania zachowań zależnych od wzroku już w 3 dpf (days post fertilization). Brockerhoff i wsp.15 po raz pierwszy zastosowali test odpowiedzi optokinetycznej (OKR) na zmutowanych embrionach w celu wykrycia defektów w funkcji wzrokowej. Drugie badanie obejmowało wykorzystanie zapisów elektroretinogramu (ERG) w celu zidentyfikowania, czy izolowane mutacje wpływają na funkcję siatkówki zewnętrznej. Z tego badania wyizolowano 18 mutantów, u których stwierdzono obniżoną funkcję wzrokową. Jeden z nich, no optokinetic response a (noa), nie posiadał żadnych poważnych nieprawidłowości fotoreceptorów w 5 dpf (dni po zapłodnieniu), ale okazał się ślepy, jak również letargiczny i zmarł przedwcześnie. Analiza mutacji noa wykazała niedobór podjednostki kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej (PDH), która reguluje produkcję energii w komórkach. Linia mutantów noa została wykorzystana jako model do badań nad niedoborem PDH (OMIM 245348), zaburzeniem występującym u ludzi, które, podobnie jak model zebrafish, powoduje ślepotę, defekty neurologiczne i wczesną śmierć.16 Ponieważ obecne metody leczenia niedoboru PDH u ludzi przyniosły ograniczony sukces, Taylor i wsp. wykorzystali mutanty noa do przetestowania diety ketogenicznej, która wykazała pewien sukces w łagodzeniu objawów niedoboru PDH u ograniczonej liczby pacjentów. Podawanie tej specjalnej diety przywrócił normalne zachowanie w noa mutantów, podkreślając potencjał studiowania terapii niedoboru PDH w linii noa mutant.

Inny mutant, nie optokinetyczne odpowiedzi f (nof) znaleziono posiadać mutację w podjednostce α transducyny stożek (Tcα), białko G wymagane do fototransdukcji. U ludzkich pacjentów cierpiących na schorzenie znane jako achromatopsja (OMIM 139340), mutacje w Tcα leżą u podstaw utraty widzenia barwnego. U mutantów nof rozwój czopków przebiega normalnie, jednak są one do 1000 razy mniej wrażliwe na światło, co wykryto w zapisach pojedynczych fotoreceptorów. Obszerna analiza odpowiedzi czopków na światło ujawniła, że fototransdukcja resztkowa jest zależna od światła, ale niezależna od transducyny. Napływ Ca+ 2, który jest ważny dla adaptacji fotoreceptorów do światła i wcześniej uważano, że jest kontrolowany przez transducynę, był nadal wykrywalny w mutantach nof. Badanie to ujawniło zatem, że pewien napływ Ca+ 2 w fotoreceptorach czopkowych może być niezależny od transducyny.

W oddzielnym badaniu przesiewowym przeprowadzono mutacje dominujące, które powodują degenerację fotoreceptorów u dorosłych zeberek, w celu wyizolowania mutantów genetycznych, które mogłyby być później wykorzystane do badania dziedziczonej u ludzi ślepoty nocnej, takiej jak RP.37,38 W przypadku RP u podłoża tej grupy zaburzeń leży wiele loci genetycznych. Jednakże, tylko około połowa przypadków dominującego RP została powiązana z określonymi mutacjami w czasie, gdy przeprowadzono badania przesiewowe.38 Li i wsp. przebadali zatem zmutowane dorosłe zebrafisy wykorzystując znaną reakcję ucieczki wykazywaną przez ryby. Brak takiej reakcji na zagrażającą wskazówkę został zinterpretowany jako utrata wzroku, co zostało później potwierdzone przy użyciu zapisów ERG. W sumie wyizolowano siedem heterozygotycznych mutantów (nightblindness a, b, c, d, e, i f), z których sześć wykazywało degenerację fotoreceptorów.38,39,208,209 Cztery z sześciu okazały się letalne embrionalnie jako homozygoty, co sugeruje, że zmutowane geny leżące u podstaw fenotypów fotoreceptorów pełnią inne krytyczne funkcje podczas rozwoju embrionalnego. To odkrycie podkreśla znaczenie takich badań dla identyfikacji dominujących mutacji, które mogą nie być łatwo wyizolowane w tradycyjnych badaniach z powodu wczesnej letalności embrionalnej.