Factor Xa: Structura și situsurile de legareEdit

Structura 3D a factorului Xa

Factorii IIa, Xa, VIIa, IXa și XIa sunt toate enzime proteolitice care au un rol specific în cascada coagulării. Factorul Xa (FXa) este cel mai promițător datorită poziției sale la intersecția dintre calea intrinsecă și extrinsecă, precum și datorită faptului că generează aproximativ 1000 de molecule de trombină pentru fiecare moleculă de Xa, ceea ce duce la un efect anticoagulant puternic. FXa este generat din FX prin scindarea unei peptide de activare de 52 de aminoacizi, deoarece „a” din factorul Xa înseamnă activat. FXa este alcătuit dintr-un domeniu catalitic de 254 de aminoacizi și este, de asemenea, legat de un lanț ușor de 142 de aminoacizi. Lanțul conține atât domeniul GLA, cât și două domenii ale factorului de creștere epidermică (domenii asemănătoare EGF).

Sitemul activ al FXa este structurat pentru a cataliza scindarea substraturilor fiziologice și scindează PhePheAsnProArg-ThrPhe și TyrIleAspGlyArg-IleVal în protrombină. FXa are patru așa-numite buzunare care sunt ținte pentru ca substraturile să se lege de factorul Xa. Aceste buzunare sunt aliniate de aminoacizi diferiți, iar inhibitorii Xa vizează aceste buzunare atunci când se leagă de factorul Xa. Cele două buzunare cele mai relevante în ceea ce privește afinitatea și selectivitatea pentru inhibitorii Xa sunt S1 și S4.

S1: Buzunarul S1 este un buzunar hidrofob și conține un reziduu de acid aspartic (Asp-189) care poate servi ca situs de recunoaștere pentru o grupare bazică. FXa are un spațiu rezidual în buzunarul S1 și este căptușit de reziduurile Tyr-228, Asp-189 și Ser-195.

S2: Buzunarul S2 este un buzunar mic și puțin adânc. Acesta se unește cu buzunarul S4 și are loc pentru aminoacizi mici. Tyr-99 pare să blocheze accesul la acest buzunar, astfel că acest buzunar nu este la fel de important ca S1 și S4.

S3: Buzunarul S3 este situat pe marginea buzunarului S1 și este plat și expus la solvent. Acest buzunar nu este la fel de important ca S1 și S4.

S4: Buzunarul S4 este de natură hidrofobă, iar podeaua buzunarului este formată din reziduul Trp-215. Reziduurile Phe-174 și Tyr-99 din FXa se unesc cu Trp-215 pentru a forma o cutie aromatică care este capabilă să lege fragmente alifatice, aromatice și încărcate pozitiv. Datorită legăturii cu entități încărcate pozitiv, poate fi descrisă ca o gaură de cationi.

Structura chimică și proprietățile inhibitorilor direcți ai XaEdit

.

Structura apixabanului, edoxaban și rivaroxaban. Inhibitori direcți ai Xa existenți în prezent

Legătura inhibitorilor Xa cu factorul XaEdit

Inhibitorii Xa se leagă toți în așa-numita formă de L în cadrul situsului activ al factorului Xa. Constituenții cheie ai factorului Xa sunt situsurile de legare S1 și S4. S-a observat pentru prima dată că compușii naturali, antistasina și TAP, care posedă componente foarte polare și, prin urmare, încărcate, se leagă de țintă cu o anumită specificitate. De aceea, au fost concepute medicamente mai noi cu grupe încărcate pozitiv, dar acestea au dus la o biodisponibilitate slabă. Inhibitorii Xa comercializați în prezent conțin, prin urmare, un inel aromatic cu diverse fracțiuni atașate pentru diferite interacțiuni cu situsurile de legare S1 și S4. Acest lucru asigură, de asemenea, o bună biodisponibilitate, precum și menținerea unei rezistențe ferme a legăturii. Inhibitorii Xa comercializați în prezent pe piață se bazează, prin urmare, pe legături hidrofobe și de hidrogen în loc de interacțiuni foarte polare.

Legătura antistasinei cu factorul XaEdit

Antistasina conține un domeniu N- și un domeniu C-terminal care sunt similare în secvențele lor de aminoacizi cu ~40% identitate și ~56% omologie. Fiecare dintre ele conține o structură β-sheet scurtă și 5 legături disulfidice. Numai domeniul N-terminal este necesar pentru a inhiba Xa, în timp ce domeniul C-terminal nu contribuie la proprietățile inhibitorii din cauza diferențelor în structura tridimensională, chiar dacă domeniul C-terminal are un model puternic analog cu situsul activ real.

Interacțiunea antistasinei cu FXa implică atât situsul activ, cât și suprafața inactivă a FXa. Situl reactiv al antistasinei format de Arg-34 și Val-35 în domeniul N-terminal se potrivește cu situsul de legare al FXa, cel mai probabil buzunarul S1. În același timp, Glu-15 situat în afara situsului reactiv al antistasinei se potrivește reziduurilor încărcate pozitiv de pe suprafața FXa. Legătura multiplă este avantajoasă din punct de vedere termodinamic și conduce la o inhibiție sub-nanomolară (Ki = 0,3-0,6 nM).

Legătura DX-9065a la factorul XaEdit

DX-9065a, prima moleculă mică inhibitor direct al Xa, este un derivat amidinoarilic cu o greutate moleculară de 571,07g/mol. Grupa sa amidinonaftalenică încărcată pozitiv formează o punte de sare cu reziduul Asp-189 din buzunarul S1 al FXa. Inelul de pirolidină se potrivește între Tyr-99, Phe-174 și Trp-215 în buzunarul S4 al FXa.

În comparație cu medicamentele mai vechi, de exemplu heparina, DX-9065a este selectiv pentru FXa în comparație cu trombina, chiar dacă FXa și trombina sunt similare în structura lor. Acest lucru este cauzat de o diferență în reziduul de aminoacizi din poziția 192 a omologului. În timp ce FXa are un reziduu de glutamină în acea poziție, trombina are un acid glutamic care provoacă repulsie electrostatică cu grupul carboxil al DX-9065a. În plus, o punte de sare între Glu-97 din trombină și grupul amidină fixat în inelul de pirrolidină al DX-9065a reduce flexibilitatea moleculei DX-9065a, care acum nu se poate roti suficient pentru a evita ciocnirea electrostatică. Acesta este motivul pentru care valoarea IC50 pentru trombină este >1000µM, în timp ce valoarea IC50 pentru FXa este de 0,16µM.

Legarea rivaroxabanului de buzunarele S1 și S4 ale factorului Xa. Se formează două legături de hidrogen care au un rol important în direcționarea rivaroxabanului în subsitele S1 și S4. Datorită acestor legături de hidrogen, rivaroxabanul formează o formă de L și se potrivește în buzunare. Substituentul clor al medicamentului interacționează cu Tyr-228 în buzunarul S1, ceea ce permite ca rivaroxabanul să atingă o bună biodisponibilitate orală și potență.

Legătura rivaroxabanului cu factorul XaEdit

Legătura rivaroxabanului cu FXa este mediată prin două legături de hidrogen cu aminoacidul Gly-219. Aceste două legături de hidrogen au un rol important în direcționarea medicamentului în subsitemele S1 și S4 ale FXa. Prima legătură de hidrogen este o interacțiune puternică care provine de la oxigenul carbonil al nucleului de oxazolidinonă al rivaroxabanului. A doua legătură de hidrogen este o interacțiune mai slabă și provine de la grupul amino al fracțiunii clorotiofen carboxamidă.

Aceste două legături de hidrogen au ca rezultat faptul că medicamentul formează o formă de L și se potrivește în buzunarele S1 și S4. Reziduurile de aminoacizi Phe-174, Tyr-99 și Trp-215 formează un canal hidrofob îngust care reprezintă buzunarul de legare S4. Partea morfolinonică a rivaroxabanului este „înghesuită” între aminoacizii Tyr-99 și Phe-174, iar inelul arilic al rivaroxabanului este orientat perpendicular pe Trp-215. Grupul carbonil al morfolonei nu are o interacțiune directă cu coloana vertebrală a FXa, în schimb, contribuie la o planarizare a inelului morfolonei și, prin urmare, susține rivaroxabanul să fie intercalat între cei doi aminoacizi.

Interacțiunea dintre substituentul clor al fracțiunii tiofenice și inelul aromatic al Tyr-228, care este situat în partea inferioară a S1, este foarte importantă datorită faptului că înlătură necesitatea unor grupări puternic bazice pentru o afinitate ridicată pentru FXa. Acest lucru permite rivaroxabanului, care nu este bazic, să obțină o bună biodisponibilitate orală și potență.

Legătura apixabanului cu buzunarele S1 și S4 ale factorului Xa. Atomul de azot al pirazolului N-2 al apixabanului interacționează cu aminoacidul Gln-192 din buzunarul S4. Oxigenul carbonil interacționează cu Gly-216 din buzunarul S1, precum și interacționează cu o moleculă de apă.

Legătura apixabanului cu factorul XaEdit

Apixaban prezintă un mod de legare similar cu cel al rivaroxabanului și formează un complex inhibitor-enzimă strâns atunci când este conectat la FXa. Grupul p-metoxi al apixabanului se conectează la buzunarul S1 al FXa, dar nu pare să aibă nicio interacțiune cu nicio reziduu din această regiune a FXa. Atomul de azot al pirazolului N-2 al apixabanului interacționează cu Gln-192, iar oxigenul carbonil interacționează cu Gly-216. Grupul fenil lactam al apixabanului este poziționat între Tyr-99 și Phe-174 și, datorită orientării sale, este capabil să interacționeze cu Trp-215 din buzunarul S4. Gruparea carbonil oxigenată a fracțiunii lactam interacționează cu o moleculă de apă și nu pare să interacționeze cu niciun reziduu din buzunarul S4.

SAR al rivaroxabanului incluzând fracțiunile finale. În timpul testării SAR, R1 a fost definit ca fiind cel mai important grup pentru potență. Pyrrolidinona a fost prima grupare funcțională R1 care a crescut semnificativ potența, dar cercetările ulterioare au relevat o potență și mai mare cu o grupare morfolinonă în locul acesteia. Grupurile R2 și R3 au avut hidrogen sau fluor atașat și s-a evaluat rapid că având hidrogenul a rezultat cea mai mare potență

Relația structură-activitate-relație (SAR)Edit

O parte importantă a conceperii unui compus, care este un inhibitor ideal pentru o anumită țintă, este înțelegerea secvenței de aminoacizi a situsului țintă la care trebuie să se lege compusul. Modelarea atât a protrombinei, cât și a FXa face posibilă deducerea diferenței și identificarea aminoacizilor de la fiecare situs de legare. În partea de jos a buzunarului S1 de pe FXa, aminoacidul de legare este Asp-189, de care se pot lega grupele de amidină. După radiografierea situsului de legare al FXa, s-a descoperit că buzunarul S1 are o formă plană, ceea ce înseamnă că un grup amidinoarilic plat ar trebui să se lege de acesta fără impedimente sterice.

Inhibitorii direcți moderni ai Xa sunt molecule în formă de L ale căror capete se potrivesc perfect în buzunarele S1 și S4. Partea lungă a formei în L trebuie să se conformeze unui tunel foarte specific din cadrul situsului activ al țintelor. Pentru a realiza acest lucru, această parte a moleculelor este concepută pentru a avea puține interacțiuni formale cu FXa în acea regiune. Deoarece nu există nicio legătură specifică, potrivirea acestor agenți între buzunarele FXa crește specificitatea totală a medicamentelor față de molecula FXa. Interacțiunea dintre buzunarul S1 al FXa și inhibitor poate fi atât ionică, cât și neionică, ceea ce este important, deoarece permite ajustarea designului fracțiunii pentru a crește biodisponibilitatea orală. Compușii concepuți anterior erau molecule încărcate care nu sunt bine absorbite în tractul gastrointestinal și, prin urmare, nu au atins concentrații serice ridicate. Medicamentele mai noi au o biodisponibilitate mai bună deoarece nu sunt încărcate și au o interacțiune non-ionică cu buzunarul S1.

Rivaroxaban

În timpul dezvoltării SAR a rivaroxabanului, cercetătorii și-au dat seama că adăugarea unei grupări 5-clorotiofen-2-carboxamidă la nucleul de oxazolidonină ar putea crește de 200 de ori potența, care anterior fusese prea slabă pentru utilizarea medicală. În plus față de această descoperire, a fost confirmată o preferință clară pentru configurația (S). Acest compus avea un profil farmacocinetic promițător și nu conținea o grupare amidină foarte bazică, dar care fusese considerată anterior importantă pentru interacțiunea cu buzunarul S1. Aceste constatări au condus la cercetări SAR (relația structură-activitate) extinse. În timpul testelor SAR, R1 a fost definit ca fiind cel mai important grup pentru potență. Pyrrolidinona a fost prima grupare funcțională R1 care a crescut semnificativ potența, dar cercetările ulterioare au evidențiat o potență și mai mare cu o grupare morfolinonă în locul acesteia. Grupurile R2 și R3 au avut hidrogen sau fluor atașat și s-a evaluat rapid că hidrogenul a dus la cea mai mare potență. Grupurile R2 și R3 au fost apoi înlocuite cu diferite grupe, care au fost toate mai puțin puternice decât hidrogenul, astfel încât hidrogenul a fost rezultatul final. Deoarece fracțiunea de clorotiofen avea o solubilitate inadecvată în apă, s-a încercat înlocuirea acesteia cu un alt grup, dar nu s-a reușit. Fracțiunea clorotiofen se leagă de Tyr-228 în partea de jos a buzunarului S1, ceea ce face din aceasta un factor cheie în ceea ce privește legarea la FXa. Rivaroxaban are atât o afinitate ridicată, cât și o bună biodisponibilitate.

Structura apixabanului, înainte de ajustarea fracțiunilor pentru potență maximă

Apixaban

Fracțiunea 13F intermediară înainte ca apixaban să fie complet dezvoltat

În timpul dezvoltării SAR a apixabanului au existat trei grupe care trebuiau testate pentru a obține potență și biodisponibilitate maxime. Primul grup care trebuia testat a fost situsul inactiv, deoarece acesta trebuie să fie stabilizat înainte de testarea SAR asupra grupului p-metoxifenil (fracțiunea de legare S1). Există mai multe grupe care cresc potența compusului, în principal amide, amine și tetrazoli, dar și grupe metilsulfonil și trifluorometil. Dintre aceste grupări, carboxamida are cea mai mare capacitate de legare și a avut o activitate de coagulare similară cu cea a compușilor.

În testele efectuate pe câini, acest compus cu o grupare carboxamidă, numit 13F, a prezentat un profil farmacocinetic excelent, un clearance scăzut și un timp de înjumătățire și un volum de distribuție adecvate. Datorită succesului de a găsi un grup stabilizator, cercetarea SAR pentru fracțiunea de legare S1 (p-metoxifenil) a fost întreruptă. În grupul de legare S4, analogii N-metilacetil și lactam s-au dovedit a avea o afinitate de legare foarte mare pentru FXa, au prezentat o coagulare și o selectivitate mare față de alte proteaze. Orientarea s-a dovedit a fi importantă, deoarece N-metilacetilul, în comparație cu acetamida, a avut o capacitate de legare la FXa de 300 de ori mai mică din cauza planarității nefavorabile în apropierea situsului de legare a regiunii S4.

SynthesisEdit

RivaroxabanEdit

Rivaroxaban aparține din punct de vedere chimic grupului de n-aryloxazolidinone. Alte medicamente din acest grup sunt linezolidul și tedizolidul, ambele fiind antibiotice. În 2016 a fost publicată o sinteză a n-aryloxazolidinonelor pornind de la un etil(2,3-dihidroxipropil)-carbamat protejat cu O-sililil. Într-o reacție într-un singur vas, carbamatul se ciclicizează la un inel de 2-oxazolidonă în condiții ușor bazice, în timp ce, simultan, azotul oxazolidonei este arilizat prin catalizare cu cupru. Pentru rivaroxaban, în special, 3-morfolinona înlocuiește iodul din poziția p a inelului benzenic prin catalizare cu cupru. Ulterior, gruparea protectoare sililică este îndepărtată, iar alcoolul rezultat este înlocuit cu o grupare amino care este apoi acilată în ultima etapă.

Un preparat industrial de rivaroxaban a fost înregistrat ca brevet de către Bayer Healthcare în 2005. Acesta pornește de la N-(4-aminofenol)-morfolinona care este alchilată de un derivat de oxid de propilenă care conține, de asemenea, o amină primară implicată într-o grupare de protecție ftalimidă. Apoi, se adaugă un echivalent fosgenic pentru a forma inelul 2-oxazolidonă și se elimină ftalimida. Amina liberă poate fi acum acilată, ceea ce duce la rivaroxaban.

Cu toate acestea, conform brevetului, sinteza are „diverse dezavantaje în gestionarea reacției care are efecte deosebit de nefavorabile pentru preparare”. Brevetul explică, de asemenea, o altă sinteză care pornește de la un derivat de clorotiofen și care ar fi mai potrivită pentru procesul industrial, dar subliniază faptul că din produsul final trebuie eliminați solvenții sau reactivii toxici. Prin urmare, această cale nu este o alternativă.

Au fost descrise diverse alte căi de sinteză a rivaroxabanului.

Sinteza rivaroxabanului, așa cum a fost patentată de Bayer Healthcare în 2005.
1-a etapă: Alchilarea aminei aromatice primare
Etapa a 2-a: Formarea inelului de 2-oxazolinidonă, folosind un echivalent de fosgen
Etapa a 3-a: Îndepărtarea grupării de protecție ftalimidă
4-a etapă: Acilarea aminei primare

ApixabanEdit

Prima sinteză completă a apixabanului a fost publicată în 2007. Etapa cheie a acestei reacții este o (3+2)cicloadiție a unui derivat de p-metoxifenilclorohidrazon și a unui derivat de p-iodofenil-morfolin-dihidropiridină. După eliminarea ulterioară a HCl și a morfolinei, iodul este substituit cu 2-pipperidinonă prin catalizare cu cupru, iar eterul etilic este transformat în amidă (aminoliză). Această reacție a fost înregistrată ca brevet în 2009.

Sinteza apixabanului, așa cum a fost publicată de Pinto, et al. în 2007. Etapa cheie notabilă este o (3+2)cicloadiție a derivatului de p-metoxifenilclorohidrazon și a derivatului de p-iodofenil-morfolin-dihidropiridină în prima reacție.

.