Uma tela genética haplóide para dependência da glicose

Muitas linhas celulares imortalizadas mostram flexibilidade nutricional limitada e são altamente dependentes da glicose como fonte primária de carbono. Descobrimos que a sobrevivência da linha de células haplóides humanos Hap1 requer glicose no meio de cultura. Para identificar os fatores envolvidos em tal “dependência da glicose”, realizamos uma triagem genética haplóide15 para isolar os mutantes que sobrevivem na completa ausência de glicose. Nós mutagênizamos aleatoriamente 1 × 108 células Hap1 com baixa multiplicidade de infecção com um vetor de armadilha genética retroviral16 e cultivamos a população mutagênica em meio com deficiência de glucose por 12 dias. Após a morte da maioria (>99%) das células, as células resistentes à depleção da glicose foram recuperadas e expandidas em meio rico em nutrientes. Foram identificados locais de inserção de travas genéticas na população resistente, utilizando o sequenciamento Illumina baseado em PCR inverso17. Na população selecionada, os genes SLC3A2/4F2hc (399 inserções distintas) e xCT/SLC7A11 (39 inserções) foram perturbados em alta freqüência pela integração retroviral (Fig. 1a). Notavelmente, os produtos protéicos desses genes são conhecidos por interagir fisicamente, com a subunidade SLC3A2 denominada cadeia pesada e a subunidade SLC7A11 denominada cadeia leve, para formar o aminoácido antiporter conhecido como sistema xc- ou o xCT antiporter18. O antitransportador xCT é um transportador de aminoácidos de superfície celular que exporta glutamato em troca de cistina. Esta troca é importante para defesa contra espécies de oxigênio reativas celulares (ROS), pois a cistina é o dímero oxidado da cisteína, um precursor crítico para a síntese do glutationa (GSH), um importante antioxidante19. Para maior clareza, nos referimos ao transportador funcional como ‘sistema xc-‘ ou ‘xCT antiporter’, e à subunidade de cadeia leve como SLC7A11.

(a) Representação das inserções do filtro genético encontradas nos genes SLC3A2 e SLC7A11, nas células Hap1 que sobrevivem ao esgotamento da glicose. Os retângulos negros representam exons, e as marcas azuis representam eventos de inserção. O número de inserções de gene-trap das populações não selecionadas e selecionadas foi analisado pelo teste exato de Fisher unilateral para calcular os valores de P. (b) Análise de Western blot das células SLC3A2 e SLC7A11 nos níveis WT Hap1 (WT), AC6 (SLC7A11 gene-trap clone) e AC24 (SLC3A2 gene-trap clone). (c) Quantificação da libertação de glutamato no meio. Os valores foram normalizados para WT. Os dados representam a média±s.d. (n=3); **P<0,01; teste t de Student não pareado. (d,e) Imagens representativas (d) e quantificação (e) da viabilidade celular às 24 h após retirada da glicose, com veículo (DMSO) ou 500 μM sulfasalazina (SASP). Barra de escalas, 200 μm. Os dados representam as médias±s.d. (n=3).

Para caracterizar as conseqüências celulares dessas interrupções genéticas, isolamos os clones Hap1 com as inserções de SLC3A2 e SLC7A11. O mutante SLC3A2, denominado AC24, tem uma inserção de trap genético no segundo intron de SLC3A2 na orientação esperada para a disrupção gênica e não mostra nenhuma expressão de SLC3A2. Além disso, possui expressão SLC7A11 substancialmente inferior, o que é esperado porque a SLC3A2 deve se associar à SLC7A11 para formar um complexo estável (Fig. 1b). A SLC7A11 mutante, denominada AC6, tem uma inserção de trava de gênero na região não traduzida de 5′ do primeiro exon da SLC7A11 e apresenta uma expressão de SLC7A11 muito reduzida nos níveis de proteína (Fig. 1b) e mRNA (Fig. 1b suplementar). Os níveis de SLC3A2 não são em grande parte afetados no AC6, provavelmente porque a subunidade SLC3A2 é compartilhada por vários transportadores de aminoácidos18. Ambos os clones mostram menor liberação de glutamato no meio (Fig. 1c), confirmando que o sistema xc- está funcionalmente perturbado. É importante ressaltar que ambos os clones apresentam viabilidade altamente melhorada sob condições de deficiência de glucose-deficiente (Fig. 1d,e). Após 24 h de privação de glicose, >70% das células em ambos os clones permanecem viáveis, enquanto apenas 10% das células do Hap1 dos pais sobrevivem. Consistente com este resultado, o tratamento das células Hap1 com sulfassalazina (SASP)20, um sistema xc- inibidor, melhorou a viabilidade das células WT Hap1 após a retirada da glicose (Fig. 1d,e).

Sistema xc- regula a viabilidade celular durante a retirada da glicose

Para confirmar independentemente os resultados da tela genética, utilizamos RNAs (shRNAs) de grampo curto para o sistema de choque estável xc- nas células Hap1 (Fig. 2a). Como o SLC3A2 tem funções pleiotrópicas como a cadeia pesada comum para vários transportadores de aminoácidos18, concentramos nossos esforços de derrubada na subunidade SLC7A11. Células contendo qualquer uma de duas SLC7A11 shRNAs independentes liberam substancialmente menos glutamato em meio (Fig. 2b). Elas mostraram uma grande melhora na viabilidade após a retirada da glicose (Fig. 2c). Entretanto, não houve alteração na taxa de proliferação em meios contendo glucose (Suplemento Fig. 2a).

(a) Análise ocidental dos níveis de proteína SLC7A11 do SLC7A11 em células SLC7A11-sobre-expressoras de HeLa. (b) Quantificação da liberação de glutamato no meio. Os dados representam a média±s.d. (n=4); **P<0,01; teste t de Student não pareado; scr, scrambled shRNA. (c,d) Viabilidade celular às 24 h após a retirada da glicose. As células SLC7A11 knockdown Hap1 (c) e SLC7A11-overexpressoras de células HeLa (d) foram cultivadas em meio glicosado com veículo (DMSO), 500 μM SASP ou 4 mM dm-αKG durante 24 h. Os dados representam os meios±s.d. (n=3); vetor: vetor vazio.

Conversamente, nos perguntamos se o aumento do nível do sistema xc- em uma linha celular com SLC7A11 baixo endógeno sensibilizaria as células para a retirada da glicose. Em comparação com as células Hap1, as células HeLa expressaram níveis quase indetectáveis da subunidade SLC7A11 (Fig. 2a) e exibiram baixa liberação de glutamato no meio (Fig. 2b). Curiosamente, as células de HeLa de controle mostraram alta viabilidade diante da remoção da glicose (Fig. 2d). A superexpressão da subunidade SLC7A11 causou um grande aumento na liberação de glutamato (Fig. 2a,b) e um grande aumento na morte celular durante a depleção da glicose (Fig. 2d). Entretanto, em meios contendo glucose, não houve alteração na taxa de proliferação de células SLC7A11-sobreexpressoras de HeLa em relação ao controle (Suplemento Fig. 2a). Assim, a sobreexpressão da SLC7A11 é suficiente para eliciar o vício da glicose. Resultados similares foram obtidos usando condições de cultura com baixa glicose (contra nenhuma glicose nos experimentos acima) (Suplemento Fig. 2b). Além disso, nem a derrubada nem a superexpressão da SLC7A11 alteraram significativamente a viabilidade celular após o esgotamento da glutamina (Suplemento Fig. 2c). Em conjunto, estes resultados indicam que o nível de atividade xc- do sistema controla a sensibilidade das células à retirada da glicose.

Os benefícios da depleção xCT requerem o metabolismo da glutamina

Retirada da glicose do componente, a glutamina torna-se a fonte primária de carbono e seu metabolismo é crítico para a sobrevivência celular6,7,8. Uma vez importada, a glutamina intracelular é convertida em glutamato e posteriormente em α-ketoglutarate, um intermediário do ciclo do TCA. Portanto, especulamos que células com baixa atividade xc- do sistema podem ser mais capazes de manter os níveis de glutamato intracelular e seu metabolismo no ciclo do TCA. Para testar essa idéia, medimos diretamente os níveis de glutamato intracelular 1 h após a retirada da glicose. As células SLC7A11 knockdown (Fig. 3a) e SLC3A2 ou SLC7A11 mutantes gene-trap (Suplemento Fig. 3a) mantiveram seus níveis de glutamato intracelular após a depleção da glicose muito melhor do que as células controle. Por outro lado, as células SLC7A11-sobrepressoras de HeLa tinham níveis mais baixos de glutamato intracelular do que as células controle (Fig. 3b). Consistente com o papel conhecido do sistema xc- para a síntese de GSH, o SLC7A11 reduziu o nível de GSH intracelular nas células Hap1, enquanto que o SLC7A11-overexpressor de HeLa mostrou níveis mais altos de GSH do que as células controle (Suplemento Fig. 3b).

(a,b) Quantificação do glutamato intracelular em células SLC7A11-sobreexpressoras de HeLa (a) e SLC7A11-sobreexpressoras de células de Hap1 (b) antes e 1 h após a remoção da glicose. Os dados representam a média±s.d. (n=3); **P<0,01; teste t de Student não pareado. (c) Enzimas e inibidores envolvidos no metabolismo da glutamina/glutamato. (d,e) Viabilidade celular Hap1 às 24 h após a retirada da glicose. Foram adicionados os seguintes medicamentos, conforme indicado: 0,5 mM AOA, 50 μM EGCG, 10 μM BPTES ou 4 mM dm-αKG. Os dados representam os meios±s.d. (n=3). (f) Consumo de oxigénio em condições de glucose-deplete. As células foram incubadas durante 3 h em meio glicosado (1 mM de glutamina) e a OCR foi medida. Os dados representam a média±s.d. (n=4); *P<0,05. **P<0,01; teste t de Student não pareado. (g) Padrões de etiquetagem isotópica dos intermediários do TCA. As células foram incubadas durante 8 h em meios sem glucose contendo U-13C5-glutamina antes de extrair os metabólitos. Os dados representam a média±s.d. (n=3).

Em seguida perguntamos se o metabolismo da glutamina/glutamato é importante para o aumento da sobrevivência celular do sistema xc– células deficientes durante a retirada da glicose. Testamos três compostos , aminooxiacetato (AOA, inibidor de aminotransferase) e galato de epigalocatequina (EGCG, inibidor de glutamato desidrogenase)21 que inibem as enzimas envolvidas na conversão de glutamina em glutamato e depois α-ketoglutarate (Fig. 3c). No tratamento com EGCG, as células Hap1 perturbadas para SLC7A11 (Fig. 3d; Suplemento Fig. 3c) ou SLC3A2 (Suplemento Fig. 3c) já não mostram maior viabilidade sob privação de glicose, sugerindo que a glutamato desidrogenase (GDH) é crítica para o efeito. Como o GDH converte o glutamato para α-ketoglutarate, perguntamos se o α-ketoglutarate poderia reverter o efeito inibitório do EGCG. De fato, o efeito inibitório do EGCG foi totalmente resgatado pela suplementação com dimetil α-ketoglutarate (dm-αKG), uma forma permeável às células do α-ketoglutarate, (Fig. 3e; Suplementar Fig. 3d). Além disso, a suplementação com dm-αKG durante a retirada da glicose melhorou muito a viabilidade celular em células do tipo selvagem (WT) e controle do shRNA Hap1 (Fig. 3e; Suplemento Fig. 3d) e SLC7A11-overexpressor de células de HeLa (Fig. 2d), enquanto a suplementação adicional de glutamina no meio não melhorou significativamente a viabilidade celular (Suplemento Fig. 3e). Portanto, estes resultados sugerem que a conversão do glutamato em α-ketoglutarate está subjacente ao efeito protetor da ruptura do sistema xc- sob condições de déficit de glucose-. A falta de efeito por BPTES ou AOA sugere que o GLS1 não é a glutaminase primária nas células Hap1, e que o GDH, ao invés de aminotransferase, é importante para a conversão do glutamato em α-ketoglutarate.

Na ausência de glicose, o OXPHOS mitocondrial (como principal fonte de síntese de ATP) torna-se essencial para a sobrevivência. Através da anaplerose, o glutamato derivado da glutamina α-ketoglutarate repõe os intermediários do ciclo TCA, que gera substratos para a condução do OXPHOS21. Portanto, testamos se os níveis do sistema xc- podem regular a respiração mitocondrial. Na presença de glicose, a taxa de consumo de oxigênio (OCR) do SLC7A11 knockdown Hap1 ou das células HeLa superexpressoras é comparável à das células de controle (Suplemento Fig. 3f). No entanto, as células SLC7A11 apresentam uma maior respiração mitocondrial após 3 h de depleção de glicose, enquanto a OCR das células SLC7A11-sobreexpressoras de HeLa é inferior à das células controle sob retirada de glicose (Fig. 3f).

Trabalhos recentes descobriram que α-ketoglutarate generated from consumed glutamine may undergo oxidative metabolism via the ‘forward’, clockwise TCA cycle or reductive carboxylation via a ‘reverse’ counter clockwise TCA reaction22,23,24. O fluxo relativo através do ciclo de TCA para frente versus ciclo de TCA inverso pode ser determinado utilizando a rotulagem estável de isótopos 13C (C5) de glutamina extracelular e a incorporação da etiqueta de medição nos intermediários do ciclo de TCA22,23,25. Para determinar se a modulação do sistema xc- altera o fluxo do ciclo TCA para frente versus fluxo inverso, as células SLC7A11 knockdown Hap1 ou HeLa overexpressing foram cultivadas na ausência de glicose e com U-13C5-glutamina (ver Métodos). A exposição à U-13C5-glutamina extracelular resultou na rotulagem quase completa (M+5) de glutamina e glutamato intracelular (Fig. 3g suplementar). O glutamato rotulado entrou no TCA através da reação anaplerótica ao α-ketoglutarate com a rotulagem de M+4 dos intermediários de TCA dianteiros succinato, fumarato, malato e citrato (Fig. 3g). O rótulo M+5 do citrato (produto TCA redutor) foi observado em muito menor grau (∼8:1 M+4:M+5 citrato), indicativo de baixo fluxo reverso de TCA. É importante notar que o grau relativo de fluxo para frente versus fluxo reverso não foi alterado com a derrubada ou superexpressão de SLC7A11.

xCT regula a dependência das células cancerosas da mama da glicose

Para estender nossas observações sobre o efeito negativo do sistema xc- no metabolismo e na respiração da glutamina, analisamos dados de expressão gênica para 947 linhas de células cancerosas do projeto Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)26. Para cada tipo de câncer, categorizamos 15-20 linhas de células cancerígenas como SLC7A11 altas e baixas, expressando e realizando análise de enriquecimento do conjunto genético entre esses dois grupos. Verificamos que os genes relacionados ao OXPHOS foram enriquecidos nos grupos com SLC7A11 baixo, especialmente nas linhas de células cancerígenas de pulmão (valor de P=0,018) e de mama (valor de P=0,039). Além disso, a análise de 59 células cancerígenas da mama mostrou uma correlação negativa marcada e seletiva entre a expressão dos genes SLC7A11 e OXPHOS mitocondrial (Suplemento Fig. 4a,b). Esta observação sugere que a maioria das células de câncer de mama com baixa expressão de SLC7A11 tem um perfil de expressão consistente com a upregulação do mecanismo OXPHOS, e vice-versa.

Escolhemos duas linhas de células de câncer de mama, Hs578T e SK-BR-3, como representativas das linhas de células que expressam alta e baixa SLC7A11, respectivamente (Suplemento Fig. 4a). Consistentes com os dados da expressão CCLE, as células Hs578T apresentaram um alto nível de expressão de SLC7A11 e liberação ativa de glutamato em meio, enquanto as células SK-BR-3 apresentaram baixa expressão de SLC7A11 e nenhuma liberação detectável de glutamato (Fig. 4a; Suplemento Fig. 5a). Também determinamos o estado metabólico das células Hs578T e SK-BR-3 pela medição das atividades de OCR e glicólise (taxa de acidificação extracelular (ECAR)). As células Hs578T apresentaram menor OCR e uma relação OCR/ECAR menor que SK-BR-3 (Fig. 4b,c), sugerindo que as células Hs578T são mais dependentes da glicólise do que as SK-BR-3. A maioria das células Hs578T, como as células Hap1, morreram na retirada da glicose (Fig. 4d), enquanto as células SK-BR-3 eram resistentes (Fig. 4e). As células Hs578T esgotadas para SLC7A11 mostraram diminuição da liberação de glutamato no meio (Suplemento Fig. 5a) e manutenção mais efetiva dos níveis de glutamato intracelular sob depleção de glicose (Suplemento Fig. 5b). É importante ressaltar que a SLC7A11 melhorou muito a viabilidade celular do Hs578T durante a retirada da glicose (Fig. 4d). Entretanto, células de Hs578T sem SLC7A11 tinham níveis celulares de ROS mais altos que células controle, consistente com seu papel na defesa antioxidante (Suplemento Fig. 5c). Por outro lado, as células com SLC7A11 superexpressas tinham níveis mais baixos de ROS (Suplemento Fig. 5c). A sobrevida das células SLC7A11 durante a retirada da glicose foi abolida pelo EGCG e BPTES, mais uma vez implicando que a produção de α-ketoglutarate a partir do glutamato é crítica (Fig. 4d). Como esperado, os efeitos prejudiciais do tratamento com EGCG ou BPTES foram totalmente revertidos pela suplementação com dm-αKG (Fig. 4d). O efeito diferencial da BPTES (compare Fig. 4d com Fig. 3d) implica que o GLS1 é a glutaminase primária nas células Hs578T, mas não nas células Hap1.

(a) níveis de proteína SLC7A11 em células SLC7A11-knockdown Hs578T e SLC7A11-overexpressores de células SK-BR-3. (b,c) Estado metabólico em condições de glucose-repleto. A taxa OCR (b) e OCR/ECAR (c) foram medidas na presença de 10 mM de glucose+2 mM de glutamina. Os dados representam a média±s.d. (n=3). (d,e) Viabilidade celular 24 h após a retirada da glicose. As células SLC7A11-sobre-expressoras SK-BR-3 (e) foram cultivadas em meio com deficiência de glucose durante 24 h. As seguintes drogas foram adicionadas conforme indicado: 500 μM SASP, 0,5 mM AOA, 50 μM EGCG, 10 μM BPTES ou 4 mM dm-αKG. Os dados representam a média±s.d. (n=3).

Overexpressão de SLC7A11 em células SK-BR-3 aumentou a liberação de glutamato (Suplemento Fig. 5a) e concomitantemente reduziu a capacidade de manter o glutamato intracelular sob condições de déficit de glucose-deficiência (Suplemento Fig. 5b). A sobreexpressão SLC7A11 causou a morte substancial das células SK-BR-3 após a retirada da glicose. A morte celular foi resgatada pela adição de dm-αKG, sugerindo que a superexpressão de SLC7A11 leva a uma deficiência de α-ketoglutarate em condições de déficit de glucose-deficiência (Fig. 4e).

Hs578T células com SLC7A11 knockdown foram capazes de manter sua atividade respiratória por períodos prolongados após a retirada de glicose (Suplemento Fig. 5d). Pelo contrário, as células SK-BR-3 com SLC7A11 excesso de pressão mostraram um declínio acentuado na OCR sob o mesmo regimento. Em conjunto, estes resultados indicam que o sistema xc- nas células cancerosas da mama regula o fluxo intracelular do glutamato no ciclo TCA e aumenta a sensibilidade à retirada de glicose.

Nrf2 opera a montante da SLC7A11

Nrf2 (fator nuclear eritróide 2, NFE2L2) é um fator chave de transcrição que upregula muitos genes citoprotetores envolvidos no estresse oxidativo27. Como SLC7A11 é um gene alvo conhecido de Nrf2 (ref. 27), examinamos a correlação da expressão Nrf2 e SLC7A11 nas células cancerígenas. A expressão Nrf2 está positivamente correlacionada com a expressão SLC7A11 em 59 linhas de células cancerígenas da mama (R=0,5688), assim como todas as 947 linhas de células cancerígenas (R=0,4306) nos dados de expressão CCLE. Além disso, a expressão do gene alvo Nrf2 mostra alta correlação com a expressão da SLC7A11 através de 947 linhas de células cancerígenas. O coeficiente de correlação (R) entre os genes alvo SLC7A11 e NRF2 são: NQO1 (+0,4179), GCLC (+0,3283), GCLM (+0,3944) e TXNRD1 (+0,4321).

Estas correlações sugerem que o Nrf2 suporta a expressão SLC7A11 em um subconjunto de células cancerígenas. Para testar esta idéia, derrubamos o Nrf2 em células Hs578T e MDA-MB-231 de câncer de mama, dois expulsores altos de SLC7A11. A derrubada de Nrf2 causou uma diminuição acentuada da expressão de SLC7A11 (Fig. 5a,b,e) e redução da liberação de glutamato (Fig. 5c,f). É importante ressaltar que as células com Nrf2 apresentaram grande melhora na viabilidade durante a retirada da glicose (Fig. 5d,g). Novamente, essa mudança na viabilidade depende do metabolismo do glutamato, pois o tratamento com EGCG aboliu o efeito pró-sobrevivência da derrubada do Nrf2 (Fig. 5d). Além disso, α-ketoglutarate supplementation was sufficient to promote cell survival, even in the presence of EGCG.

(a) Western blot of SLC7A11 protein levels in Nrf2 and SLC7A11 knockdown Hs578T cells. (b) Análise RT-PCR em tempo real dos níveis de Nrf2 e SLC7A11 mRNA nas células Nrf2 e SLC7A11 knockdown MDA-MB-231. As medições foram normalizadas para níveis de rRNA de 18 s. Os dados representam a média±s.d. (n=3); **P<0,01, teste t de Student não pareado. (c,d) Análise das células Nrf2 e SLC7A11 de KO578T. (c) Libertação de glutamato no meio. Os dados representam a média±s.d. (n=3); **P<0,01; teste t de Student não-parado. (d) Viabilidade celular 24 h após a retirada da glicose. EGCG (50 μM) e dm-αKG (4 mM) foram adicionados conforme indicado. Os dados representam a média±s.d. (n=4). (e-g) As células MDA-MB-231 foram tratadas com veículo (DMSO) ou 15 μM DMF durante 24 h em meio glucose-repleto. Manipulações adicionais incluíram a derrubada de SLC7A11 ou Nrf2, e a superexpressão de SLC7A11. (e) Mancha ocidental de níveis de SLC7A11 após tratamento com DMF. (f) Libertação de glutamato em meios. Após o pré-tratamento com DMF, as células foram incubadas em meio com glucose-deficiente fresco sem DMF, e o glutamato liberado no meio foi medido às 2 h. Os dados representam a média±s.d. (n=4). (g) Viabilidade celular 24 h após depleção da glicose. Após o pré-tratamento com DMF, as células foram incubadas em meio com deficiência de glucose fresco sem DMF por mais 24 h antes da medição da viabilidade celular. Os dados representam a média±s.d. (n=4); NT, sem tratamento.

Para examinar o efeito da upregulação de Nrf2, tratamos as células com fumarato de dimetila (DMF), um ativador de Nrf2 permeável à célula28. O tratamento com DMF fez com que células de MDA-MB-231 induzissem a expressão de SLC7A11 e a liberação de glutamato (Fig. 5e,f). Além disso, as células pré-tratadas com DMF mostraram viabilidade substancialmente reduzida durante a depleção da glicose em comparação com as células controle (Fig. 5g). Excluímos efeitos fora do alvo mostrando que estes resultados do tratamento com DMF eram dependentes tanto da SLC7A11 quanto da Nrf2 (Fig. 5f,g). Em conjunto, esses resultados indicam que o eixo Nrf2-SLC7A11 regula o metabolismo do glutamato, a dependência das células cancerígenas da glicose e sua capacidade de utilizar a glutamina como fonte alternativa de carbono. Importante, sugere que a adaptação ao estresse oxidativo em células cancerígenas pode comprometer a flexibilidade dos nutrientes, particularmente através do aumento do fenótipo de adição de glicose.

xCT regula a função mitocondrial em células mtDNA-mutante

Nossos achados acima indicam que células com sistema xc- upregulation devido ao estresse oxidativo podem ter flexibilidade de nutrientes restrita devido ao metabolismo da glutamina deficiente. A inibição da cadeia respiratória mitocondrial pode aumentar as espécies reativas de oxigênio29,30. Verificamos que a expressão da SLC7A11 foi induzida por drogas que bloqueiam a função mitocondrial, especialmente rotenona e oligomicina, que inibem o complexo I (NADH desidrogenase) e V (ATP sintase) das máquinas OXPHOS, respectivamente (Fig. 6a Suplementar). Consistente com estes resultados farmacológicos, SLC7A11 foi upregulada em células cíbridas contendo mutações mtDNA homoplasmáticas na subunidade ND1 do complexo I ou subunidade ATP6 do complexo V (NARP) (Fig. 6a)30,31. A indução SLC7A11 foi particularmente marcada na linha celular NARP, que tem sido relatada como tendo altos níveis de ROS e indução da enzima mitocondrial MnSOD30. A indução de SLC7A11 nas células híbridas NARP foi altamente dependente dos fatores de transcrição Nrf2 e Atf4 (Suplemento Fig. 6b) e poderia ser suprimida pelo tratamento com o antioxidante N-acetilcisteína (Suplemento Fig. 6c).

(a) Western blot of SLC7A11 levels in 143B and isogenic mtDNA-mutant ND1 and NARP cells. (b-e) Análise de SLC7A11 knockdown ou erastin (Era)-treated (5 μM) células ND1 e NARP cultivadas na presença de 10 mM galactose e 2 mM glutamina. (b) Quantificação do glutamato intracelular às 24 h após cultura de galactose. Os dados representam a média±s.d. (n=4); ** P<0,01; teste t de Student não pareado. (c) Viabilidade celular em meio galactose durante 3 dias. Os dados representam as médias±s.d. (n=4). (d) Imagens representativas e quantificação da morfologia mitocondrial às 24 h após cultura de galactose. Os dados representam as médias±s.d. (n=3). Barra de escalas, 10 μm. (e) O consumo de oxigênio foi determinado às 24 h após cultura de galactose. Os dados representam a média±s.d. (n=5); **P<0.01; teste t de Student não emparelhado. (f) Modelo para os efeitos duplos do antitransportador xCT. O antitransportador xCT desvia o metabolismo da glutamina do ciclo do TCA para a síntese do GSH, o que é importante para a função antioxidante. Sob certas condições celulares, o desvio excessivo da glutamina do ciclo TCA é prejudicial (painel médio) e, portanto, a inibição do antitransportador melhora a sobrevivência (painel direito).

Nós investigamos se essas mudanças compensatórias na expressão do sistema xc- afetam o metabolismo celular nas células cíbridas. Consistentes com sua maior expressão de SLC7A11, os cíbridos ND1 e NARP apresentaram menores níveis de glutamato intracelular (Fig. 6b). Inibição do sistema xc- por SLC7A11 knockdown ou um potente inibidor, erastin, aumento do glutamato intracelular nas células ND1 e NARP. Da mesma forma, o xc-ketoglutarato intracelular α-, um produto do metabolismo do glutamato, também foi aumentado pela inibição da SLC7A11 (Suplemento Fig. 6d). Há muito se sabe que células com defeitos de OXPHOS sobrevivem mal em meio contendo galactose-contendo, o que força uma maior demanda por OXPHOS como fonte de geração de ATP32. Os cíbridos ND1 e NARP-mutante, ao contrário das células isogênicas WT 143B, não foram capazes de sobreviver em meio contendo galactose-contendo galactoses (Fig. 6c; Suplemento Fig. 6e). Entretanto, o tratamento com SLC7A11 knockdown ou erastin salvou fortemente a viabilidade dos cíbridos ND1 e NARP em meio galactose. O efeito foi mais acentuado nos cíbridos NARP, que mostraram uma indução muito maior da SLC7A11 (Fig. 6c).

Este aumento na viabilidade celular foi correlacionado com a normalização marcante da morfologia mitocondrial. Nosso grupo relatou anteriormente que células WT alongam suas mitocôndrias sob condições médias que requerem maior atividade OXPHOS, enquanto células com mutações mtDNA ao invés disso fragmentam suas mitocôndrias33. Consistentes com este resultado, as citocôndrias ND1 e NARP apresentaram acentuada fragmentação mitocondrial após 24 h de cultura de galactose. Em contraste, cíbridos com SLC7A11 ou tratamento de erastinagem mostraram alongamento substancial das mitocôndrias quando a fonte de carbono no meio foi trocada de glicose para galactose (Fig. 6d; Suplemento Fig. 6f). O SLC7A11 knockdown não alterou os níveis de várias proteínas da dinâmica mitocondrial, incluindo Opa1, Mfn1 e Drp1 (Suplemento Fig. 6g). Além disso, as células SLC7A11 apresentaram maior atividade respiratória do que as células controle-mutante (Fig. 6e). Em conjunto, esses resultados sugerem que a inibição do sistema xc- em cíbridos mtDNA-mutante melhora a morfologia mitocondrial e a respiração, resultando em sobrevida acentuadamente aumentada em meio galactose.