Descoberta e desenvolvimento dos inibidores diretos Xa
Factor Xa: Estrutura e sítios de ligaçãoEditar
Factores IIa, Xa, VIIa, IXa e XIa são todas enzimas proteolíticas que têm um papel específico na cascata da coagulação. O fator Xa (FXa) é o mais promissor devido à sua posição na intersecção da via intrínseca e extrínseca, além de gerar cerca de 1000 moléculas de trombina para cada molécula de Xa, o que resulta em um potente efeito anticoagulante. FXa é gerado a partir de FX por clivagem de um peptídeo de ativação de 52 aminoácidos, já que o “a” no fator Xa significa ativado. FXa consiste em 254 aminoácidos de domínio catalítico e também está ligado a uma cadeia ligeira de 142 aminoácidos. A cadeia contém tanto o domínio GLA quanto dois domínios de fator de crescimento epidérmico (EGF como domínios).
O sítio ativo de FXa é estruturado para catalisar a clivagem de substratos fisiológicos e clivagem PhePheAsnProArg-ThrPhe e TyrIleAspGlyArg-IleVal em protrombina. FXa tem quatro bolsões chamadas bolsas que são alvos para que os substratos se liguem ao fator Xa. Estas bolsas são alinhadas por diferentes aminoácidos e os inibidores de Xa têm como alvo estas bolsas quando se ligam ao fator Xa. As duas bolsas mais relevantes quanto à afinidade e seletividade para os inibidores Xa são S1 e S4.
S1: A bolsa S1 é uma bolsa hidrofóbica e contém um resíduo de ácido aspártico (Asp-189) que pode servir como um local de reconhecimento para um grupo básico. FXa tem um espaço residual no bolso S1 e é forrado por resíduos Tyr-228, Asp-189 e Ser-195.
S2: O bolso S2 é um bolso pequeno e raso. Funde-se com o bolso S4 e tem espaço para pequenos aminoácidos. Tyr-99 parece bloquear o acesso a este bolso, por isso este bolso não é tão importante como S1 e S4.
S3: A bolsa S3 está localizada na borda da bolsa S1 e é plana e exposta ao solvente. Este bolso não é tão importante como S1 e S4.
S4: O bolso S4 é hidrófobo por natureza e o piso do bolso é formado por resíduos Trp-215. Os resíduos Phe-174 e Tyr-99 de FXa unem-se ao Trp-215 para formar uma caixa aromática que é capaz de unir fragmentos alifáticos, aromáticos e com carga positiva. Devido à ligação a entidades com carga positiva, pode ser descrito como um furo catiónico.
Estrutura química e propriedades dos inibidores directos XaEdit
| Rivaroxaban | Apixaban | Edoxaban | |
|---|---|---|---|
| MW (g/mol) | 436 | 460 | 548 |
| Molecular fórmula | C19H18ClN3O5S | C25H25N5O4 | C24H30ClN7O4S |
| Forma | L | L | L |
| Ki | 0.4 nM | 0,08 nM | 0,561 nM |
| IC50 | 0.7 nM | N/A | N/A |
| Biodisponibilidade oral (%) | 66-100 (dose-dependente) | 50 | 62 |
Ligação dos inibidores Xa ao factor XaEdit
Os inibidores Xa ligam-se todos em forma de L dentro do sítio activo do factor Xa. Os principais constituintes do fator Xa são os locais de ligação S1 e S4. Foi primeiramente observado que os compostos naturais, antistasina e TAP, que possuem componentes altamente polares e portanto carregados, ligam-se ao alvo com alguma especificidade. É por isso que as drogas mais recentes foram concebidas com grupos de carga positiva, mas estas resultaram numa fraca biodisponibilidade. Hoje em dia, os inibidores de Xa comercializados, contêm um anel aromático com vários moieties ligados para diferentes interacções com os locais de ligação S1 e S4. Isto também garante uma boa biodisponibilidade, bem como a manutenção de uma firme força de ligação. Os inibidores de Xa atualmente no mercado, portanto dependem da ligação hidrofóbica e hidrogênio ao invés de interações altamente polares.
Ligação de Antistasin ao fator XaEdit
Antistasin contém um domínio N- e um domínio C-terminal que são similares em suas seqüências de aminoácidos com ~40% de identidade e ~56% de homologia. Cada um deles contém uma pequena estrutura em β e 5 ligações de dissulfeto. Apenas o domínio N-terminal é necessário para inibir Xa enquanto que o domínio C-terminal não contribui para as propriedades inibitórias devido a diferenças na estrutura tridimensional, embora o domínio C-terminal tenha um padrão fortemente análogo ao site ativo real.
A interação do antistasin com FXa envolve tanto o site ativo quanto a superfície inativa de FXa. O sítio reactivo de antistasin formado por Arg-34 e Val-35 no domínio N-terminal adequa-se ao sítio de ligação da FXa, muito provavelmente ao bolso S1. Ao mesmo tempo, o Glu-15 localizado fora do sítio reativo de antistasin se adapta aos resíduos positivamente carregados na superfície da FXa. A ligação múltipla é termodinamicamente vantajosa e leva à inibição sub-nanomolar (Ki = 0.3-0.6 nM).
DX-9065a ligação ao fator XaEdit
DX-9065a, a primeira pequena molécula inibidora direta do Xa-inibidor, é um derivado amidinoaril com peso molecular de 571.07g/mol. Sua carga positiva entre o grupo amidinonaftaleno forma uma ponte salina para o resíduo Asp-189 na bolsa S1 da FXa. O anel de pirrolidina cabe entre Tyr-99, Phe-174 e Trp-215 na bolsa S4 de FXa.
Drogas antigas não semelhantes, por exemplo heparina, DX-9065a é seletivo para FXa em comparação com trombina mesmo que FXa e trombina sejam similares em sua estrutura. Isto é causado por uma diferença no resíduo de aminoácidos na posição homóloga 192. Enquanto a FXa tem um resíduo de glutamina nessa posição, a trombina tem um ácido glutâmico que causa repulsão eletrostática com o grupo carboxil do DX-9065a. Além disso, uma ponte salina entre Glu-97 de trombina e o grupo amidina fixado no anel de pirrolidina de DX-9065a reduz a flexibilidade da molécula DX-9065a, que agora não pode girar o suficiente para evitar o choque eletrostático. É por isso que o valor IC50 para trombina é >1000µM enquanto o valor IC50 para FXa é 0,16µM.
Ligação do rivaroxaban ao factor XaEdit
A ligação do rivaroxaban ao FXa é mediada por duas ligações de hidrogénio ao aminoácido Gly-219. Estas duas ligações de hidrogênio têm um papel importante dirigindo o medicamento para os subsites S1 e S4 da FXa. A primeira ligação de hidrogênio é uma forte interação que vem do oxigênio carbonilo do núcleo de oxazolidinona do rivaroxaban. A segunda ligação de hidrogênio é uma interação mais fraca e vem do grupo amino do clorothiophene carboxamide moiety.
Estas duas ligações de hidrogênio resultam na formação de um medicamento em forma de L e cabe nos bolsos S1 e S4. Os resíduos de aminoácidos Phe-174, Tyr-99, e Trp-215 formam um canal hidrofóbico estreito que é a bolsa de ligação S4. A parte de morfolinona da rivaroxaban é “ensanduichada” entre os aminoácidos Tyr-99 e Phe-174 e o anel aryl da rivaroxaban é orientado perpendicularmente através do Trp-215. O grupo da morfolinona carbonila não tem uma interacção directa com a espinha dorsal FXa, pelo contrário, contribui para uma planarização do anel de morfolinona e por isso suporta que a rivaroxaban seja ensanduichada entre os dois aminoácidos.
A interacção entre o substituto clorídrico da moleza tiofeno e o anel aromático do Tyr-228, que se encontra no fundo do S1, é muito importante devido ao facto de evitar a necessidade de grupos fortemente básicos para uma elevada afinidade com a FXa. Isto permite que o rivaroxaban, que não é básico, atinja uma boa biodisponibilidade oral e potência.
Ligação do apixaban ao factor XaEdit
Apixaban mostra um modo de ligação semelhante ao rivaroxaban e forma um complexo enzimático inibidor apertado quando ligado ao FXa. O grupo p-methoxy do apixaban liga-se à bolsa S1 da FXa mas não parece ter qualquer interacção com quaisquer resíduos nesta região da FXa. O átomo de nitrogênio pirazol N-2 do apixaban interage com Gln-192 e o oxigênio carbonilo interage com Gly-216. O grupo fenil lactame do apixaban está posicionado entre Tyr-99 e Phe-174 e devido à sua orientação, é capaz de interagir com Trp-215 da bolsa S4. O grupo carbonil oxigénio da fracção de lactame interage com uma molécula de água e não parece interagir com quaisquer resíduos na bolsa S4.
Estrutura-actividade-relação (SAR)Editar
Uma parte importante do desenho de um composto, que é um inibidor ideal para um determinado alvo, é compreender a sequência de aminoácidos do local alvo para o composto se ligar. Modelar tanto a protrombina como a FXa permite deduzir a diferença e identificar os aminoácidos em cada local de ligação. No fundo da bolsa S1 em FXa o aminoácido de ligação é Asp-189, ao qual as moieties de amidina podem ligar-se. Após a radiografia do local de ligação da FXa, foi revelado que a bolsa S1 tinha uma forma planar, o que significa que um grupo de amidinoaryl plano deve ligar-se a ela sem obstáculos estéreis.
Inibidores Xa diretos modernos são moléculas em forma de L cujas extremidades encaixam perfeitamente nos bolsos S1 e S4. O lado longo da forma L tem que se conformar a um túnel altamente específico dentro do local ativo dos alvos. Para conseguir isso, esta parte das moléculas é projetada para ter poucas interações formais com FXa naquela região. Como não há uma ligação específica, o ajuste desses agentes entre as bolsas de FXa aumenta a especificidade total das drogas para a molécula FXa. A interação entre a bolsa S1 de FXa e o inibidor pode ser tanto iônica quanto não-iônica, o que é importante porque permite que o desenho da molécula seja ajustado para aumentar a biodisponibilidade oral. Os compostos previamente desenhados eram moléculas carregadas que não são bem absorvidas no trato gastrointestinal e, portanto, não alcançavam altas concentrações séricas. Os medicamentos mais recentes têm uma biodisponibilidade melhor porque não são carregados e têm uma interacção não iónica com a bolsa S1.
Rivaroxaban
Durante o desenvolvimento da SAR do rivaroxaban, os investigadores perceberam que a adição de um grupo de 5-clorothiophene-2-carboxamida ao núcleo de oxazolidonina poderia aumentar a potência em 200 dobras, que anteriormente era demasiado fraca para uso médico. Além desta descoberta, foi confirmada uma clara preferência pela (S)-configuração. Este composto tinha um perfil farmacocinético promissor e não continha um grupo de amidina altamente básico, mas que anteriormente tinha sido considerado importante para a interação com a bolsa S1. Estes achados levaram a extensas pesquisas de SAR (relação estrutura-actividade). Durante os testes de SAR, o R1 foi definido como o grupo mais importante para a potência. A pirrolidinona foi o primeiro grupo funcional R1 a aumentar significativamente a potência, mas outras pesquisas revelaram uma potência ainda maior com um grupo de morfolinona. Os grupos R2 e R3 tinham hidrogênio ou flúor ligado e foi rapidamente avaliado que ter hidrogênio resultava em maior potência. Os grupos R2 e R3 foram então substituídos por vários grupos, que eram todos menos potentes que o hidrogênio, então o hidrogênio foi o resultado final. Como a fracção de clorotiofeno tinha uma solubilidade inadequada da água, foi tentada a sua substituição por outro grupo, mas sem sucesso. A fracção de clorothiophene liga-se ao Tyr-228 no fundo da bolsa S1, o que a torna um factor chave na ligação à FXa. O Rivaroxaban tem tanto alta afinidade como boa biodisponibilidade.
Apixaban
Durante o desenvolvimento da SAR do apixaban houve três grupos que precisaram ser testados para atingir a potência máxima e biodisponibilidade. O primeiro grupo a ser testado foi o não ativo, pois precisava ser estabilizado antes dos testes de SAR no grupo p-metoxifenil (S1 binding moiety). Há vários grupos que aumentam a potência do composto, principalmente amidas, aminas e tetrazóis, mas também grupos metilsulfonil e trifluorometilo. Destes grupos, a carboxamida tem a maior ligação e teve uma actividade de coagulação semelhante à dos compostos.
Em testes caninos, este composto com um grupo carboxamida chamado 13F, mostrou um grande perfil farmacocinético, uma baixa depuração e uma meia-vida e volume de distribuição adequados. Devido ao sucesso em encontrar um grupo estabilizador, a pesquisa de SAR para o grupo de ligação S1 (p-metoxifenil) foi descontinuada. No grupo de ligação S4, os análogos de N-metilacetílico e lactaminas mostraram uma afinidade de ligação muito alta para FXa, mostraram grande coagulação e seletividade em relação a outras proteases. A orientação mostrou-se importante já que o N-metil acetil, comparado à acetamida, tinha uma capacidade de ligação 300 vezes menor à FXa devido à planaridade desfavorável próxima ao local de ligação da região S4.
SynthesisEdit
RivaroxabanEdit
Rivaroxaban quimicamente pertence ao grupo das n-aryloxazolidinonas. Outros medicamentos desse grupo são linezolida e tedizolida, sendo ambos antibióticos. Uma síntese de n-aryloxazolidinonas começando com um etil(2,3-dihidroxipropil)-carbamato de O-sililo protegido foi publicada em 2016. Em uma reação de um pote o carbamato ciclisiza a um anel de 2-oxazolidona sob condições ligeiramente básicas enquanto simultaneamente o nitrogênio oxazolidona é arilhado por catalização de cobre. Para o rivaroxaban em particular, a 3-morfolinona substitui o iodo na posição p do anel de benzeno por catalização do cobre. Posteriormente, o grupo protector do silil é removido e o álcool resultante é substituído por um grupo amino, que é depois acilado no último passo.
Uma preparação industrial de rivaroxaban foi registada como patente pela Bayer Healthcare em 2005. Ele começa com N-(4-aminofenol)-morfolinona que é alquilada por um derivado de óxido de propileno que também contém uma amina primária envolvida em um grupo de proteção contra ftalimida. Em seguida, um equivalente de fosgênio é adicionado para formar o anel de 2-oxazolidona e a ftalimida é removida. A amina livre pode agora ser acilada o que leva ao rivaroxaban.
No entanto, de acordo com a patente a síntese tem “várias desvantagens no manejo da reação que tem efeitos particularmente desfavoráveis para a preparação”. A patente também explica outra síntese a partir de um derivado do clorotiofeno que seria mais adequado para o processo industrial, mas assinala que os solventes ou reagentes tóxicos têm de ser removidos do produto final. Portanto, esta forma não é uma alternativa.
Várias outras vias de síntese do rivaroxaban foram descritas.
1ª etapa: Alquilação da amina aromática primária
2°passo: Formação do anel de 2-oxazolinidona, utilizando um equivalente de fosgénio
3º degrau: Remoção do grupo de protecção de ftalimida
4º degrau: Acilação da amina primária
ApixabanEdit
A primeira síntese completa do apixaban foi publicada em 2007. O passo chave desta reacção é uma (3+2)cicloadição de um derivado de p-metoxifenilcloroidrazona e um derivado de p-iodofenil-morfolina-dihidropiridina. Após a seguinte eliminação do HCl e morfolina, o iodo é substituído por 2-piperidinona por catalização de cobre e o éter etílico é convertido em amida (aminólise). Esta reação foi registrada como patente em 2009.
