By Sara Ryding, B.Sc.Reviewed by Deepthi Sathyajith, M.Pharm.

Sekwencjonowanie bisulfitowe całego genomu, czyli WGBS, to technika sekwencjonowania nowej generacji służąca do analizy metylacji DNA.

Image Credit: Egorov Artem /

Metylacja DNA jest mechanizmem epigenetycznym regulującym ekspresję genów i polega na dodaniu grupy metylowej do zasady cytozyny. Nieprawidłowe wzorce metylacji zostały powiązane z kilkoma warunkami i chorobami, takimi jak rak. Od czasu opracowania WGBS, jest ona stosowana do badania przeprogramowania epigenetycznego, sygnatur epigenetycznych i innych.

Podstawowa metodologia

WGBS łączy w sobie wykorzystanie traktowania wodorosiarczanem sodu i sekwencjonowania DNA o wysokiej przepustowości. Bisiarczyn sodu chroni metylowane cytozyny, lub metylocytozyny, przed przekształceniem, podczas gdy niemetylowane cytozyny są przekształcane do uracylu.

Niemetylowane cytozyny są następnie dalej przekształcane do tyminy po PCR, co oznacza, że wyniki sekwencjonowania pokazują głównie adeninę, guaninę i tyminę, z wszelkimi bazami cytozyny wskazującymi na metylowane miejsca cytozyny.

Metoda ta została początkowo wypróbowana na Aradopsis thaliana, roślinie, ze względu na jej stosunkowo mały genom. Od tego czasu okazała się ona zdolna do analizy około 90% wszystkich cytozyn, które zostały poddane próbie. Technika WGBS została zastosowana do genomów ludzi, myszy, kukurydzy i soi.

Zastosowanie komórek macierzystych

Komórki macierzyste są niezróżnicowanymi komórkami, które zachowują zdolność do przekształcania się w każdy rodzaj komórek, takich jak neurony czy komórki mięśniowe. To czyni je bardzo interesującymi dla biologów rozwojowych i ewentualnych zastosowań w medycynie, aby zrozumieć, co odróżnia je od dojrzałych komórek.

Pierwsze genomowe mapy metylowanych cytozyn w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych i fibroblastach płodowych wykazały duże różnice między nimi. W komórkach embrionalnych, prawie jedna czwarta wszystkich zidentyfikowanych metylacji była w nie-cytozynowym kontekście guaninowym (CG), podczas gdy w komórkach płodowych 99,98% metylocytozyn było w kontekście GC.

Kontekst nie-CG oznacza, że była w CHG lub CHH, gdzie H reprezentuje adeninę, tyminę lub cytozynę. Wcześniej uważano, że prawie cała metylacja DNA ssaków zachodzi w kontekście CG, podczas gdy to badanie wskazuje, że może to być ogólna cecha ludzkich zarodkowych komórek macierzystych.

Metylacja nie-CG okazała się być utracona przy różnicowaniu. Metylacja non-CG została przywrócona, gdy komórki płodowe były manipulowane w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste. To również pokazuje, że metylacja CHG i CHH nie wynika z różnic genetycznych, ale zamiast tego jest cechą embrionalnych komórek macierzystych.

Poprzednie badanie wskazało, że komórki macierzyste, czy indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste lub embrionalne komórki macierzyste, wspólne cechy epigenetyczne poprzez metylację. Komórki macierzyste są niezmiernie ważne dla celów terapeutycznych i badania chorób. Różnią się one od komórek somatycznych poprzez przekształcenia epigenomowe, a nie genetyczne, co czyni badanie ich wzoru metylacji bardzo interesującym.

Następne badanie skupiło się na różnicach pomiędzy embrionalnymi komórkami macierzystymi a indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi i odkryło, że podczas gdy ich wzór metylacji jest bardzo podobny na poziomie globalnym, indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste wykazują znaczne różnice w przeprogramowaniu w porównaniu z embrionalnymi komórkami macierzystymi. Tak więc, podczas gdy WGBS pomogło wyjaśnić wiele na temat komórek macierzystych, pewne pytania nadal pozostają.

WGBS w biologii rozwoju

Metylacja DNA jest ważna podczas normalnego rozwoju u ssaków. W szczególności, metylacja nie-CG jest szeroko rozpowszechniona w pluripotencjalnych komórkach macierzystych i oocytach.

Badacze wykorzystali WGBS do dalszego badania tej koncepcji i odkryli, że prawie dwie trzecie wszystkich metylacji w oocytach pęcherzyków zarodkowych myszy występuje w kontekście nie-CG. Stwierdzili również, że metylacja miejsc nie-CG gromadziła się podczas wzrostu oocytu.

Metylacja nie-CG wydawała się zależeć w szczególności od kilku metylotransferaz, a mianowicie kompleksu metylotransferaz DNA, tj. kompleksu Dnmt3s-Dnmt3L. W przeciwieństwie do tego, Dnmt1 wydawał się utrzymywać metylację CG.

Dziedziczenie programowania epigenetycznego jest bardziej powszechne u roślin niż u ssaków. Badanie koncentrujące się na metylacji wykazało, że dzięki zastosowaniu WGBS, roślinna linia zarodkowa zachowała metylację CG i CHG. Jest to kontrast w stosunku do ssaków, u których metylacja CHH jest tracona w mikrosporach i plemnikach. Jest ona jednak przywracana przez metylotransferazę de novo DNA kierowaną przez małe RNA po zapłodnieniu.

WGBS do wczesnego diagnozowania chorób

Badania wykazały, że WGBS może być wykorzystywana do wykrywania nieprawidłowej metylacji poprzez badania przesiewowe w kierunku specyficznych, hipermetylowanych genów supresorowych, widocznych w nowotworach takich jak ostra białaczka promielocytowa, rak żołądka i tak dalej.

Zastosowanie WGBS w kryminalistyce

Badania kryminalistyczne zostały przeprowadzone na próbkach wysuszonych plam krwi przy użyciu WGBS po ekstrakcji DNA. Zastosowanie WGBS zapewnia wysoką jakość próbek, co usprawnia analizę metylacji DNA na plamach kryminalistycznych.

Podsumowując, WGBS staje się coraz bardziej popularne w badaniach metylacji DNA ze względu na zdolność tej techniki do szacowania metylacji DNA w bisulfitowym genomowym DNA z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu.

Ale chociaż WGBS jest bardzo wydajnym narzędziem do zrozumienia przeprogramowania epigenetycznego, równie ważne jest opracowanie i utrzymanie opłacalnej technologii wysokosekwencjonowania, która może być stosowana w różnych dziedzinach badań naukowych.

Dalsza lektura

• Wszystkie treści związane z sekwencjonowaniem DNA
• Sekwencjonowanie DNA
• Zestawianie sekwencji DNA
• Mikromacierze DNA
• Techniki sekwencjonowania DNA o wysokiejthroughput DNA Sequencing Techniques

Written by

Sara Ryding

Sara jest pasjonatką nauk przyrodniczych, która specjalizuje się w zoologii i ornitologii. Obecnie kończy studia doktoranckie na Uniwersytecie Deakin w Australii, które koncentrują się na tym, jak dzioby ptaków zmieniają się wraz z globalnym ociepleniem.

Ostatnia aktualizacja Oct 31, 2018

Cytowania

Proszę użyć jednego z następujących formatów, aby zacytować ten artykuł w swoim eseju, pracy lub raporcie:

• APA

  Ryding, Sara. (2018, October 31). Zastosowania sekwencjonowania bisulfitowego całego genomu (WGBS). Wiadomości-Medyczne. Retrieved on March 27, 2021 from https://www.news-medical.net/life-sciences/Applications-of-Whole-Genome-Bisulfite-Sequencing-(WGBS).aspx.

• MLA

  Ryding, Sara. „Zastosowania sekwencjonowania bisulfitowego całego genomu (WGBS)”. News-Medical. 27 marca 2021. <https://www.news-medical.net/life-sciences/Applications-of-Whole-Genome-Bisulfite-Sequencing-(WGBS).aspx>.

• Chicago

  Ryding, Sara. „Zastosowania sekwencjonowania bisulfitowego całego genomu (WGBS)”. News-Medical. https://www.news-medical.net/life-sciences/Applications-of-Whole-Genome-Bisulfite-Sequencing-(WGBS).aspx. (dostęp 27 marca 2021 r.).

• Harvard

  Ryding, Sara. 2018. Zastosowania sekwencjonowania bisulfitowego całego genomu (WGBS). News-Medical, przeglądane 27 marca 2021, https://www.news-medical.net/life-sciences/Applications-of-Whole-Genome-Bisulfite-Sequencing-(WGBS).aspx.

.