3.06.4.1.1 Drożdże Saccharomyces

Wcześniejsze badania wykazały, że drożdże Saccharomyces mogą fermentować ksylulozę do etanolu, aczkolwiek nie wydajnie. Tak więc, teoretycznie, drożdżom Saccharomyces brakuje jedynie enzymu(ów) do przekształcania ksylozy w ksylulozę. Jak opisano powyżej, bakterie przekształcają ksylozę w ksylulozę za pomocą pojedynczego enzymu, który nie wymaga kofaktorów (Rysunek 3). Dla kontrastu, drożdżowy system przekształcania ksylozy w ksylulozę wymagał dwóch enzymów, które nie są idealne pod względem metabolicznym, jak opisano powyżej. Początkowo prawie 10 różnych laboratoriów z całego świata próbowało sklonować bakteryjny gen izomerazy ksylozy do drożdży. Ho i wsp. z Purdue University byli pierwszą grupą, której udało się sklonować gen izomerazy ksylozy z Escherichia coli. Jednakże, białko syntetyzowane w drożdżach przez sklonowany gen bakteryjny nie miało aktywności izomerazy ksylozy.

Drugie podejście polegało na sklonowaniu genów XR i XD z P. stipitis do drożdży Saccharomyces. Jednakże kinetyka tych enzymów i równowaga termodynamiczna reakcji sprzyjają produkcji ksylitolu zamiast etanolu. Na początku lat 90-tych, trzy grupy (Kotter, Ciriacy i współpracownicy z Uniwersytetu w Dusseldorfie, Tantirungkij i współpracownicy z Uniwersytetu w Osace oraz Hahn-Hägerdal i współpracownicy z Uniwersytetu w Lund) doniosły o udanym sklonowaniu genów XR i XD do drożdży Saccharomyces, aby uczynić je zdolnymi do fermentacji ksylozy. Jednakże, rekombinowane drożdże opracowane przez te grupy fermentowały ksylozę niezwykle wolno i produkowały niewiele etanolu; głównym produktem metabolicznym był ksylitol.

Grupa Ho wysunęła hipotezę, że nadekspresja natywnej ksylulokinazy (XK) wraz z XR i XD z P. stipitis poprawi przepływ ksylozy przez metabolizm do etanolu poprzez obniżenie wewnątrzkomórkowego stężenia ksylulozy. Ponieważ ksylulokinaza katalizuje nieodwracalną reakcję w kierunku produkcji etanolu (Rysunek 3), wysoka aktywność ksylulokinazy spowoduje niskie stężenie ksylulozy. Jest to pożądane, ponieważ równowaga reakcji katalizowanej przez XD faworyzuje ksylitol, a niskie stężenia ksylulozy w stanie ustalonym są potrzebne do skierowania strumienia metabolicznego w kierunku produkcji etanolu. Ponadto, sklonowanie tych trzech genów pozwoliło na kontrolowanie ich ekspresji w komórce. W natywnym systemie kontroli ekspresji komórki, ich ekspresja jest indukowana przez obecność ksylozy i hamowana przez glukozę. Powstałe w ten sposób rekombinowane drożdże mogą być zdolne do jednoczesnej fermentacji glukozy i ksylozy do etanolu bez długiego okresu opóźnienia między fermentacją glukozy i ksylozy, co byłoby niezwykle pożądane w przemysłowej produkcji etanolu.

W 1989 roku grupa Ho z Purdue po raz pierwszy zgłosiła sklonowanie genu ksylulokinazy z drożdży Saccharomyces. Następnie grupa Ho zastąpiła sekwencje DNA upstream genów strukturalnych XR, XD, i XK sekwencjami upstream genów glikolitycznych zawierających efektywne konstytutywne promotory. Powstałe w ten sposób geny XR, XD i XK sklonowano na plazmidzie o wysokiej liczbie kopii 2μ, a powstały w ten sposób plazmid, pLNH32, wykorzystano do transformacji szczepu drożdży przemysłowych Saccharomyces typu dzikiego, o którym wiadomo, że jest lepszy do produkcji etanolu z wykorzystaniem skrobi (glukozy) jako substratu. W 1993 r. ta sama grupa donosiła o pomyślnym rozwoju rekombinowanych drożdży Saccharomyces 1400 (pLNH32), które mogły fermentować wysokie stężenia ksylozy prawie całkowicie do etanolu z bardzo niewielką ilością ksylitolu jako produktu ubocznego. Ponadto, otrzymane drożdże mogą współfermentować glukozę i ksylozę do etanolu bez znacznego okresu opóźnienia pomiędzy fermentacją tych dwóch cukrów, chociaż szybkość fermentacji ksylozy jest wolniejsza niż glukozy (Rysunek 4). Następnie opisano szczegóły dotyczące budowy i rozwoju 1400 (pLNH 32). Od tego czasu grupa Ho kontynuowała ulepszanie drożdży za pomocą różnych nowatorskich podejść, jak opisano poniżej.

Rysunek 4. (Po lewej) Szczep drożdży Saccharomyces 1400 transformowany macierzystym plazmidem pLNH32 nie zawierającym genów XR, XD lub XK lub zawierającym tylko XR i XD, ale nie XK, użyty do fermentacji mieszaniny glukozy i ksylozy. (Po prawej) 1400 drożdży transformowanych plazmidem pLNH32, zawierającym sklonowane geny XR, XD i XK. Drożdże te zostały użyte do fermentacji glukozy i ksylozy w identycznych warunkach jak wyniki opisane na lewej rycinie. Geny sklonowane w tych plazmidach zostały zmodyfikowane i skonstruowane identycznie jak opisano w odnośniku 9.

Plazmid 2 μ, pLNH32, zawierający sklonowany gen XR-XD-XK jest plazmidem o szerokim gospodarzu, zaprojektowanym tak, aby był w stanie transformować dowolne szczepy drożdży Saccharomyces, w tym przemysłowe drożdże Saccharomyces typu dzikiego. Taki plazmid może być wykorzystany do badań nad lepszymi gospodarzami do produkcji etanolu celulozowego. Grupa Ho opracowała również nową, unikalną technikę integracji genów, ułatwiającą efektywną integrację wielu genów do chromosomu drożdży w wielu kopiach. Technika ta jest łatwa do wykonania i prawie gwarantuje, że geny sklonowane na plazmidzie integracyjnym i transformowane do komórek drożdży gospodarza mogą być zintegrowane z genomem gospodarza w takiej liczbie kopii, jaka jest pożądana dla zapewnienia najlepszej aktywności (Rysunek 5). Ta technika integracji została wykorzystana do stworzenia stabilnego szczepu 1400 (LNH-ST) fermentującego ksylozę, poprzez pierwszą integrację genów XR-XD-XK razem jako kasety do chromosomu drożdży w wystarczającej liczbie kopii, aż do uzyskania drożdży fermentujących ksylozę z najwyższą wydajnością (Rysunek 6). Najlepszy obecnie szczep opracowany przez grupę Ho, 424A (LNH-ST), został wyselekcjonowany spośród 10 różnych szczepów drożdży Saccharomyces poprzez transformację każdego szczepu plazmidem 2 μ pLNH32 w celu upewnienia się, że szczepy te są w stanie fermentować ksylozę, jak również efektywnie współfermentować glukozę/ksylozę w obecności pLNH32, a następnie integrację genów do chromosomów wybranych szczepów drożdży w celu stworzenia „stabilnych drożdży” przy użyciu tej nowej techniki integracji. Współfermentacja glukozy/ksylozy przez 424A (LNH-ST) jest pokazana na Rysunku 7.

Rysunek 5. Demonstracja stopniowej integracji wielu kopii genów XR-XD-XK do chromosomów szczepu drożdży Saccharomyces 259 metodą opisaną w Ho i wsp. Drożdże na różnych etapach integracji zostały użyte do fermentacji glukozy i ksylozy w identycznych warunkach, aby zademonstrować postęp integracji tych genów: a) na początkowym etapie integracji, b) 25% ukończenia, c) 50-75% ukończenia, d) po zakończeniu integracji. O zakończeniu integracji świadczy to, że komórki z procesu integracji dają takie same wyniki fermentacji przez wystarczająco długi okres czasu.

Ryc. 6. Współfermentacja glukozy i ksylozy z udziałem 1400 (LNH-ST) zawierających wiele kopii genów XR-XD-XK zintegrowanych z chromosomami drożdży metodą Ho i wsp. .

Figura 7. Współfermentacja glukozy i ksylozy z użyciem rekombinowanego szczepu Saccharomyces 424A (LNH-ST) zawierającego wielokrotne kopie genów XR-XD-XK zintegrowanych z chromosomami drożdży Saccharomyces szczep 424A metodą Ho et al. . Są to najlepsze drożdże Ho-Purdue opracowane na Purdue University przed 2007 r. i obecnie dostarczane przemysłowi do produkcji etanolu celulozowego.

Jeśli rekombinowany mikroorganizm jest używany do produkcji przemysłowej na dużą skalę, takiej jak produkcja etanolu, konieczna jest integracja genów, które mają być sklonowane do chromosomów gospodarza z dwóch kluczowych powodów. Jednym z nich jest to, że jeśli sklonowane geny zostaną zintegrowane z chromosomami gospodarza za pomocą niezawodnej metody, sklonowane geny mogą być utrzymywane na chromosomie gospodarza bez konieczności stosowania specjalnych chemikaliów, pożywek, antybiotyków i dodatków. Wymóg stosowania chemikaliów lub antybiotyków w celu utrzymania cech nie tylko zwiększa koszt chemikaliów, ale także zwiększa koszty i trudności w procesie zatwierdzania przepisów i oczyszczania wszelkich ścieków. Nawet w obecności czynnika selektywnego, plazmidy o wysokiej liczbie kopii, takie jak pLNH32, używane do klonowania genów do komórek gospodarza, mogą nie być w stanie utrzymać działalności przemysłowej na dużą skalę. Grupa Ho wykazała, że stabilne drożdże opracowane przy użyciu nowego systemu integracyjnego, 1400 (LNH-ST), były w stanie utrzymać ciągłą fermentację hydrolizatów z resztek kukurydzy do etanolu w zakładzie pilotażowym, podczas gdy ten sam szczep drożdży zawierający plazmid, 1400 (pLNH32), nie był w stanie tego zrobić.

Rekombinowane drożdże opracowane przez Hahn-Hägerdal zostały szeroko ulepszone poprzez klonowanie różnych dodatkowych genów, w tym klonowanie genu ksylulokinazy po tym, jak grupa Ho z Purdue University wykazała, że zwiększona ekspresja tego rodzimego genu poprawia wydajność etanolu z ksylozy .

Drożdże opracowane przez grupę Ho z Purdue są dostępne do przemysłowej produkcji etanolu celulozowego. Prawdopodobnie będą miały duże szanse powodzenia, ponieważ są to drożdże przemysłowe do produkcji etanolu i zostały gruntownie przetestowane. Ostatnio grupa z Purdue kontynuowała prace nad ulepszeniem szczepu poprzez współfermentację arabinozy z pozostałymi czterema cukrami (glukozą, ksylozą, mannozą i galaktozą) oraz poprzez uodpornienie go na etanol i kwas octowy.

Nawet mimo, że wczesna próba opracowania drożdży Saccharomyces fermentujących ksylozę na bazie izomerazy ksylozy nie powiodła się i opracowano skuteczne, oparte na XR/XD zmodyfikowane drożdże fermentujące ksylozę, zainteresowanie opracowaniem drożdży fermentujących ksylozę na bazie izomerazy ksylozy było kontynuowane przez lata, częściowo dlatego, że ta ścieżka nie wykazuje nierównowagi redoks. W 2009 roku Brat i wsp. skonstruowali drożdże S. cerevisiae fermentujące ksylozę przy użyciu izomerazy ksylozy z Closteidium phytofermentans. Również w 2009 roku, Cargill poinformował o opracowaniu szczepu drożdży innych niż Saccharomyces, wyrażającego izomerazę ksylozy i zdolnego do wydajnej fermentacji mieszaniny glukozy i ksylozy przy niskim pH i w obecności 1% kwasu octowego.

Nawet jeśli arabinoza jest obecna w niewielkich ilościach w biomasie z traw jako część hemicelulozy GAX, kilka specjalnych źródeł biomasy, takich jak włókno kukurydziane, zawiera stosunkowo duże ilości arabinozy. Niemniej jednak, idealnym rozwiązaniem jest posiadanie mikroorganizmów produkujących etanol celulozowy zdolnych do fermentacji wszystkich pięciu różnych cząsteczek cukru obecnych w biomasie celulozowej, ponieważ recykling strumieni procesowych w procesie przemysłowym może zwiększyć stężenie pomniejszych składników .

Mechanizm metabolizmu arabinozy w mikroorganizmach jest równie skomplikowany jak metabolizm ksylozy. Ponownie, mechanizm metabolizmu arabinozy w drożdżach jest inny niż u bakterii . Podobnie jak w przypadku metabolizmu ksylozy, mechanizm metaboliczny drożdży nie sprzyja metabolizmowi beztlenowemu. Ostatnio, Hahn-Hägerdal i współpracownicy zmodyfikowali drożdże Saccharomyces fermentujące ksylozę do współfermentacji arabinozy z ksylozą i innymi cukrami poprzez grzybiczą ścieżkę l-arabinozy. Jednakże, powstałe w ten sposób drożdże nadal nie były w stanie fermentować arabinozy do znaczącej ilości etanolu, ale były w stanie przekształcić niewielką ilość arabinozy do arabitolu.