Abstract

Wnt5a jest zaangażowany w aktywację kilku niekanonicznych szlaków sygnałowych Wnt, które mogą hamować lub aktywować kanoniczny szlak sygnałowy Wnt/β-katenina w sposób zależny od kontekstu receptora. Sygnalizacja Wnt5a jest krytyczna dla regulacji prawidłowych procesów rozwojowych, w tym samoodnawiania się komórek macierzystych, proliferacji, różnicowania, migracji, adhezji i polarności. Ponadto, nieprawidłowa aktywacja lub hamowanie sygnalizacji Wnt5a staje się ważnym czynnikiem w progresji nowotworów, wywierając zarówno efekt onkogenny, jak i supresyjny. Ostatnie badania wskazują na udział sygnalizacji Wnt5a w regulacji samoodnowy prawidłowych i nowotworowych komórek macierzystych, proliferacji komórek nowotworowych, migracji i inwazji. W tym artykule dokonano przeglądu najnowszych ustaleń dotyczących molekularnych mechanizmów i roli sygnalizacji Wnt5a w komórkach macierzystych w embriogenezie oraz w prawidłowej lub nowotworowej piersi lub jajniku, podkreślając, że Wnt5a może mieć różne efekty na komórki docelowe w zależności od receptorów powierzchniowych wyrażonych przez komórkę docelową.

1. Wprowadzenie

Komórki macierzyste, w tym embrionalne komórki macierzyste i komórki macierzyste zidentyfikowane w dorosłych tkankach, mają zdolność do samoodnawiania się i generowania bardziej zróżnicowanego potomstwa. Embrionalna komórka macierzysta pochodzi z wewnętrznej masy komórkowej blastocysty, jest pluripotentna, a zatem może generować wszystkie tkanki organizmu. Komórki macierzyste w dorosłych tkankach rezydują w wyspecjalizowanych niszach, gdzie integrują różne środowiskowe i wewnętrzne sygnały wejściowe, które określają los komórek i utrzymują homeostazę tkanek.

Faktory Wnt są grupą tych cząsteczek sygnalizacyjnych, które działają na komórki macierzyste w obrębie niszy komórek macierzystych, aby pomóc w utrzymaniu ich zdolności do samoodnowy. Czynniki Wnt są znane z wiązania się z różnymi receptorami w celu transdukcji kanonicznej ścieżki sygnalizacyjnej lub niekanonicznej ścieżki (ścieżek) sygnalizacyjnej, które regulują różnorodne działania biologiczne. Kanoniczna ścieżka sygnałowa Wnt jest inicjowana, gdy czynniki Wnt wiążą się z receptorami z rodziny Frizzled (Fzd) i receptorami białkowymi związanymi z białkiem 5/6 receptora lipoprotein o niskiej gęstości (LRP5/6), tworząc kompleksy. Skutkuje to rekrutacją Axin i dishevelled (Dvl) do błony plazmatycznej i zaburzeniem kompleksu degradacyjnego β-kateniny, co prowadzi do akumulacji β-kateniny w cytoplazmie, która następnie ulega translokacji do jądra, gdzie wiąże się z rodziną T-cell factor (TCF)/lymphoid enhancer factor (LEF) i aktywuje transkrypcję kanonicznych genów docelowych Wnt. W przeciwieństwie do tego, kilka czynników Wnt aktywuje szlaki niezależne od β-kateniny (niekanoniczne szlaki sygnalizacyjne Wnt), znane jako szlak Wnt-Ca2+ lub szlak planarnej polaryzacji komórek (PCP), które działają w celu kierowania migracją komórek podczas embriogenezy .

Dziewiętnaście wydzielanych, bogatych w cysteinę glikoprotein rodziny Wnt zostało zidentyfikowanych u myszy i ludzi. Podczas wcześniejszej embriogenezy ssaków lub utrzymania homeostazy dorosłych tkanek, te czynniki Wnt i ich receptory są dynamicznie wyrażane w celu aktywacji odpowiedniej sygnalizacji, aby zapewnić właściwą równowagę między proliferacją i różnicowaniem. Zaburzenia sygnalizacji Wnt z nieprawidłową ekspresją czynników Wnt, ich receptorów lub cząsteczek sygnałowych mogą prowadzić do rozwoju wielu ludzkich nowotworów. Ponieważ zdolność do inicjacji nowotworu wydaje się być ograniczona do małej populacji komórek nowotworowych, które są obdarzone zdolnością do samoodnawiania i różnicowania, są one często określane jako komórki macierzyste nowotworu (CSCs, lub komórki inicjacji nowotworu). Co ważniejsze, biologia embrionalnych komórek macierzystych, prawidłowych komórek macierzystych i CSCs jest silnie powiązana. Jest to oczywiste z faktu, że sygnały molekularne (np. sygnalizacja Wnt), które definiują i utrzymują embrionalne komórki macierzyste lub dorosłe normalne komórki macierzyste są często nieprawidłowo aktywowane w komórkach nowotworowych.

Głównym przedmiotem tego przeglądu jest rola sygnalizacji Wnt5a poprzez różne receptory powierzchniowe w regulacji komórek macierzystych w embriogenezie oraz w normalnej lub nowotworowej piersi lub jajniku, ponieważ istnieje już kilka doskonałych przeglądów, które obejmują aspekty sygnalizacji Wnt w raku jelita grubego. Podsumowaliśmy najnowsze osiągnięcia w zakresie szlaków sygnałowych, które są aktywowane przez Wnt5a i które stanowią wyzwanie dla racjonalnego projektowania leków mających na celu pozbawienie CSCs (lub komórek inicjujących nowotwory) w obrębie guzów przy jednoczesnym oszczędzaniu funkcji prawidłowych tkanek.

2. Szlak sygnałowy Wnt5a

Wnt5a jest niekanonicznym ligandem Wnt, który jest ewolucyjnie konserwowany i odgrywa ważną rolę w rozwoju. Homozygotyczne myszy z nokautem Wnt5a mają okołoporodową śmiertelność z powodu wad rozwojowych. Wcześniejsze badania wykazały, że Wnt5a może oddziaływać z Fzd2 i receptorem tyrozynowej kinazy sierocej typu 2 (ROR2) w celu aktywacji Rac1 w szlaku niezależnym od β-kateniny. Ostatnio wykazaliśmy, że Wnt5a indukuje heterooligermanizację sierocego receptora 1/2 (ROR1/ROR2), który rekrutuje i aktywuje czynniki wymiany guaniny (GEFs), które z kolei aktywują RhoA i Rac1, odpowiednio, zwiększając chemotaksję i proliferację komórek białaczkowych. Z drugiej strony, jako inne działanie Wnt5a, konkurował z Wnt3a o wiązanie z Fzd2, hamując w ten sposób zależną od Wnt3a fosforylację LRP6 i akumulację β-kateniny in vitro i w nienaruszonych komórkach, hamując zdolność Wnt3a do indukowania akumulacji β-kateniny, a tym samym hamując zależną od β-kateniny sygnalizację Wnt.

Jednakże, Wnt5a również może aktywować ścieżkę zależną od β-kateniny i indukować tworzenie osi wtórnej w zarodkach Xenopus, które współekspresjonowały receptor Fzd5 . Następnie w innym badaniu stwierdzono, że Wnt5a może hamować kanoniczną sygnalizację Wnt/β-kateniny w komórkach, które wyrażały ROR2, ale również może indukować kanoniczną sygnalizację Wnt/β-kateniny w komórkach, które wyrażały Fzd4 i LRP5. Tak więc, pojedynczy ligand Wnt5a może mieć różny wpływ na komórki w zależności od dostępności receptorów. Dlatego też kontekst komórkowy dyktuje efekt działania Wnt5a. This might account to the observation that the Wnt5a could exert either oncogenic or tumor suppressive effects in different cancers .

3. Wnt5a Signaling in Embryonic Stem Cells

The Wnt pathway (triggered either by Wnt3a, Wnt5a, or Wnt6) also could be involved in the short-term maintenance of pluripotency of both mouse and human ES cells . Pierwszych dowodów na to dostarczyły badania nad farmakologicznym inhibitorem kinazy syntazy glikogenu-3 (GSK3), który mógł modulować aktywność GSK3, prowadząc do aktywacji kanonicznej sygnalizacji β-kateniny i zwiększonej stabilności c-Myc. Następnie stwierdzono, że Wnt5a i Wnt6 są produkowane przez komórki podścielające fibroblasty embrionalne, które mogą hamować różnicowanie mysich komórek ES w sposób zależny od surowicy. Bezpośrednia aktywacja β-kateniny, przy użyciu konstytutywnie aktywnej β-kateniny (S33Y) bez naruszania komponentów upstream Wnt/β-katenina, w pełni rekapitulowała efekt Wnts na komórki ES. Co ważne, Wnt5a jest również silnym inhibitorem fosforylacji β-kateniny, stabilizując w ten sposób β-kateninę. Dane te sugerują, że Wnt5a sygnalizuje stabilizację β-kateniny w celu dalszej aktywacji kanonicznej sygnalizacji Wnt/β-kateniny w mysich komórkach ES. Wreszcie, szlak Wnt/β-katenina może zwiększać mRNA dla STAT3, znanego regulatora samoodnowy komórek ES, co sugeruje mechanizm molekularny, w którym szlak Wnt/β-katenina działa w celu zapobiegania różnicowaniu komórek ES poprzez zbieżność ze szlakiem LIF/JAK-STAT na poziomie STAT3. Jednakże, jakie receptory powierzchniowe są zaangażowane w aktywację sygnalizacji Wnt5a/β-kateniny w komórkach ES i czy niekanoniczna sygnalizacja Wnt również może być aktywowana przez Wnt5a w komórkach ES pozostaje niejasna.

4. Wnt5a Signaling on Stem Cells in Normal Mammary Gland and Ovarian Tissues

Linia dowodów wspiera znaczenie Wnt w utrzymaniu komórek macierzystych w gruczole sutkowym. Jednakże, Wnt5a nie indukuje aktywności transaktywacji β-kateniny/TCF w tkance gruczołu sutkowego. Komórki gruczołu sutkowego są hiperproliferacyjne u myszy pozbawionych Wnt5a, podczas gdy w obecności ektopowej Wnt5a, rozszerzanie przewodów jest zahamowane. Fenotypy te są odwrotnością aktywacji kanonicznej sygnalizacji Wnt/β-katenina. Dlatego też Wnt5a może ograniczać i kontrolować wzrost gruczołu sutkowego poprzez supresję sygnalizacji Wnt/β-katenina. Zastanawiające jest więc, że to zahamowanie wzrostu gruczołu sutkowego nie było obserwowane w transgenicznych szczepach MMTV-Wnt5a .

W germarium Drosophila, zmieniona sygnalizacja Wingless (Wg; homolog Wnt muchy) występuje w jajnikowych zarodkowych komórkach macierzystych (GSCs) poprzez usunięcie jej regulatorów, takich jak dishevelled, armadillo, Axin i shaggy; powoduje to utratę GSC, wpływa na proliferację komórek pęcherzykowych i indukuje różnicowanie . Zastosowanie warunkowego ukierunkowania genu dla Wnt5a w komórkach ziarnistych jajnika (GC) prowadzi do subpłodności kobiet, związanej ze zwiększoną atrezją pęcherzyków jajnikowych i obniżonymi wskaźnikami owulacji. Dalsze badania wykazały, że Wnt5a reguluje swoje geny docelowe nie poprzez sygnalizację za pośrednictwem szlaku Wnt/Ca2+ lub szlaku planarnej polarności komórek, ale raczej poprzez hamowanie szlaku kanonicznego, powodując obniżenie poziomu białka β-kateniny i białka CREB (cAMP responsive element binding) za pośrednictwem szlaku zależnego od kinazy syntazy glikogenu-3β w komórkach ziarnistych jajnika (GC). Dane te wskazują, że Wnt5a jest wymagany do normalnego rozwoju pęcherzyków jajnikowych i może antagonizować reaktywność gonadotropiny w komórkach ziarnistych poprzez tłumienie kanonicznej sygnalizacji Wnt/β-kateniny .

Ogółem, Wnt5a najprawdopodobniej tłumi sygnalizację β-kateniny w normalnych komórkach macierzystych gruczołu sutkowego i tkanek jajnika, chociaż Wnt5a jest w stanie aktywować sygnalizację β-kateniny w embrionalnych komórkach macierzystych. Czy ta różnica wynika z receptorów, które ulegają różnej ekspresji w embrionalnych komórkach macierzystych w porównaniu z komórkami macierzystymi normalnego gruczołu sutkowego lub jajnika, wymaga dalszych badań.

5. Wnt5a Signaling in Breast Cancer Stem Cells

Faktory Wnt mogą wpływać na różne komórki nabłonka sutka i indukować ekspansję komórek macierzystych podczas progresji nowotworu. Co więcej, nieprawidłowa ekspresja β-kateniny była związana z podstawnymi, potrójnie ujemnymi rakami piersi i złym wynikiem klinicznym. Występowanie nieprawidłowej sygnalizacji Wnt w określonych podtypach raka piersi jest mniej prawdopodobne podyktowane aktywacją spowodowaną mutacjami somatycznymi. Mutacje nie zostały zidentyfikowane w CTNNB1, który koduje β-kateninę, a mutacje w APC zostały zidentyfikowane w mniej niż 20% próbek pacjentów z rakiem piersi. Konieczne są dalsze badania w celu ustalenia, które ligandy i receptory Wnt powodują tę nieprawidłową sygnalizację Wnt/β-katenina.

Ostatnio w badaniu na mysich komórkach pierwotnych MMTV-Wnt1 stwierdzono, że zarówno rekombinowany Wnt3a, jak i rekombinowany Wnt5a mogą zwiększać tworzenie mammosfer in vitro. Tworzenie mammosfer przez Wnt5a nie było spowodowane wzrostem kanonicznej sygnalizacji Wnt/β-katenina, ale było mediowane przez niekanoniczną sygnalizację Wnt wymagającą receptorowej kinazy tyrozynowej ROR2 i aktywności N-końcowej kinazy Jun, JNK, w komórkach mysiego raka piersi. Jest to zgodne z obserwacją, że pacjentki z rakiem piersi wykazującym ekspresję ROR2 miały znacznie krótsze przeżycie całkowite niż te z guzami pozbawionymi ekspresji ROR2. Jednakże, wyciszenie ROR2 w ludzkich liniach komórkowych raka piersi zmniejszyło zarówno cele zależne od β-kateniny, jak i niezależne od β-kateniny, co sugeruje, że ROR2 może być zaangażowany zarówno w zależne od β-kateniny, jak i niezależne od β-kateniny szlaki sygnalizacyjne Wnt. ROR1 wydaje się ulegać ekspresji głównie w mniej zróżnicowanych guzach, które mają wysoki potencjał do nawrotów i przerzutów, a także wykazują ekspresję markerów związanych z przejściem nabłonkowo-mezenchymalnym (EMT). I odwrotnie, wyciszenie ROR1 w ludzkich liniach komórkowych raka piersi może zmniejszyć ekspresję genów związanych z EMT i osłabić ich zdolność do migracji/inwazji in vitro oraz potencjał przerzutowy in vivo. Bardzo niedawno Chien i wsp. donieśli, że ekspresja ROR1 może być niezależnym niekorzystnym czynnikiem prognostycznym u pacjentek z potrójnie ujemnym rakiem piersi. Czy ROR1 może mieć podobny wpływ do ROR2 na komórki macierzyste raka piersi i jakie szlaki sygnałowe są aktywowane przez ROR1 w komórkach macierzystych raka piersi pozostaje nieznane.

Badanie na mysim modelu raka piersi indukowanego ErbB2 znalazło sprzeczne dowody na wpływ Wnt5a na komórki macierzyste ludzkiego raka piersi. Podczas indukowanego przez ErbB2 nowotworzenia sutka, bazalne komórki inicjujące nowotworzenie (TIC), które wykazywały zwiększoną zdolność do nowotworzenia w porównaniu z odpowiadającymi im progenitorami luminalnymi, preferencyjnie traciły ekspresję Wnt5a, jak określono w analizie profilowania transkryptów. Co więcej, heterozygotyczność Wnt5a promowała mnogość guzów i przerzuty do płuc. Jako substrat TGFβ, produkowany przez komórki luminalne Wnt5a wywołał pętlę sprzężenia zwrotnego, która aktywowała SMAD2 w sposób zależny od RYK i TGFβR1, aby ograniczyć ekspansję bazalnych TIC w sposób parakrynny, co stanowi potencjalne wyjaśnienie supresyjnego wpływu Wnt5a na nowotworzenie gruczołu sutkowego. W tym modelu mysim nie jest pewne, czy kanoniczna sygnalizacja Wnt/β-katenina była aktywowana, czy też Wnt5a hamowała również kanoniczną sygnalizację β-kateniny w celu zahamowania ekspansji bazalnych TIC.

Laboratorium Weinberga badało unieśmiertelnione ludzkie komórki nabłonka sutka (mMECs) i odkryło, że zarówno kanoniczne, jak i niekanoniczne szlaki Wnt współpracowały z sygnalizacją TGFβ nie tylko w utrzymaniu, ale co intrygujące również w indukcji, właściwości komórek macierzystych. Co więcej, tylko niekanoniczne ligandy Wnt, Wnt5a i Wnt16, zostały wyregulowane w komórkach macierzystych w stosunku do komórek nie macierzystych. Dlatego też możliwe jest, że Wnt5a lub Wnt16 mogą aktywować kanoniczny lub niekanoniczny szlak sygnałowy Wnt w sposób zależny od kontekstu receptora w komórkach macierzystych ludzkiego raka piersi.

6. Sygnalizacja Wnt5a w komórkach macierzystych raka jajnika

Podobnie jak w przypadku raka piersi, wpływ Wnt5a na raka jajnika jest również kontrowersyjny. Wczesne badania pierwotnych guzów jajnika (), które wykazały niski poziom Wnt5a w raku jajnika w stosunku do normalnego jajnika jest predyktorem złego wyniku. Ektopowa ekspresja Wnt5a hamuje proliferację ludzkiej linii komórkowej raka jajnika OVCAR5 zarówno in vitro, jak i w mysich modelach ortotopowego raka jajnika in vivo. Mechanistycznie, ektopowa ekspresja Wnt5a w OVCAR5 antagonizuje kanoniczną sygnalizację Wnt/β-kateniny i indukuje senescencję komórkową poprzez aktywację ścieżki senescencji histonu represora A (HIRA)/promyelocytic leukemia (PML) .

W przeciwieństwie do tego, w badaniach obejmujących dużą liczbę pacjentów stwierdzono, że upregulation of Wnt5a był związany ze stosunkowo złym rokowaniem . W porównaniu z częstością ekspresji Wnt1 w raku jajnika, Wnt5a częściej występował u chorych na złośliwego nabłonkowego raka jajnika (80% z 38). Należy zauważyć, że pacjentki z rakiem jajnika, u których stwierdzono wysoki poziom ekspresji zarówno Wnt1, jak i Wnt5a, miały znacząco niższe prawdopodobieństwo długoterminowego przeżycia niż pacjentki z rakiem jajnika, u których nie stwierdzono ekspresji Wnt1 lub Wnt5a. Ponadto, Wnt5a występuje w płynie wodobrzusznym uzyskanym od kobiet z rakiem jajnika, co sugeruje, że przyczynia się on do rozwoju mikrośrodowiska guza jajnika. Jest to zgodne z obserwacją, że wysokie poziomy Wnt5a są związane ze zwiększonym ryzykiem przerzutów .

Mutacje aktywujące w kanonicznej ścieżce Wnt są rzadkie w raku jajnika, z wyjątkiem endometrioidalnych raków jajnika . Udział kanonicznej sygnalizacji Wnt w progresji raka jajnika pozostaje nieznany. Z drugiej strony, badania nad niekanoniczną sygnalizacją Wnt/β-katenina wykazują, że Wnt5a może regulować EMT raka jajnika, migrację i przerzuty poprzez niekanoniczne szlaki sygnalizacyjne. Zgodnie z tym poglądem, ostatnie badania wykazały, że ekspresja ROR1, receptora dla Wnt5a, była wysoce wyrażona przez raki jajnika o wysokim stopniu zaawansowania i mniej zróżnicowane oraz związana ze stosunkowo krótkim czasem przeżycia wolnego od choroby i przeżycia całkowitego w porównaniu z rakami jajnika, które nie wyrażały ekspresji ROR1. Raki jajnika, które wyrażają wysoki poziom ROR1 miały sygnatury ekspresji genów związane z jajnikowymi CSCs . Ponadto, ekspresja ROR1 w komórkach nowotworowych najwyraźniej koreluje z ekspresją ALDH1 i zdolnością do tworzenia sferoidów nowotworowych in vitro (oba markery CSC). Traktowanie pierwotnych komórek nowotworowych PDX (patient-derived xenograft) raka jajnika, które wykazują wysoki poziom ekspresji ROR1, mAbem anty-ROR1 (UC-961 lub cirmtuzumab), zahamowało tworzenie sferoid i migrację in vitro oraz engrafting i reengrafting u myszy z niedoborem odporności, wskazując, że ROR1 może wpływać na samoodnawianie się komórek macierzystych raka jajnika. Konieczne są dalsze badania w celu ustalenia, czy Wnt5a jest odpowiedzialny za wpływ, jaki ROR1 najwyraźniej ma na biologię komórek macierzystych raka jajnika.

7. Uwagi końcowe

Wnt5a może odgrywać ważną rolę w rozwoju embrionalnych komórek macierzystych i organów. Jednakże, rola Wnt5a w nowotworowych komórkach macierzystych jest zróżnicowana i złożona. Może on tłumić lub promować progresję nowotworu. Aby wyjaśnić mechanizmy molekularne, które napędzają zmienione zachowanie komórek, potrzebne są dodatkowe badania nad tkankowo-specyficzną ekspresją specyficznych receptorów i coreceptorów. W szczególności, bardziej szczegółowe zrozumienie złożonego wzajemnego oddziaływania pomiędzy Wnt5a i specyficznymi receptorami, które ulegają ekspresji w embrionalnych komórkach macierzystych i które mogą być ponownie ekspresjonowane lub reaktywowane w nowotworowych komórkach macierzystych, ale nie w prawidłowych tkankach somatycznych (np, ROR1 i ROR2), może umożliwić opracowanie specyficznych inhibitorów, które blokują nieprawidłową sygnalizację, a tym samym korzystnie wpływają na przeżycie pacjentów.

Konflikty interesów

Autorzy deklarują, że nie ma konfliktów interesów dotyczących publikacji tej pracy.

Podziękowania

Badania te były wspierane przez Breast Cancer Research Foundation (NIH Grant P01-CA081534), California Institute for Regenerative Medicine, National Natural Science Foundation of China (NSFC, Grant no. 2016YFC009159) oraz Science and Technology Foundation of Shenzhen, China (Shenzhen Peacock Innovation Team Project, Grant no. KQTD20140630100658078).