8 Polymyxins

Polymyxins are a class of cationic cyclic decapeptides characterised by the presence of five positively charged amine residues, from di-amino butyric acid (Dab), and a lipophilic tail, as shown in the structure of polymyxin B1 (50). Wykazują one silną aktywność wobec bakterii Gram-ujemnych i po raz pierwszy zostały zastosowane klinicznie w latach 50-tych, ale ich stosowanie było ograniczone przez doniesienia o toksyczności, szczególnie nefrotoksyczności. Jednak w ciągu ostatniej dekady, wraz z rosnącą częstością występowania wielolekoopornych bakterii Gram-ujemnych, nastąpił powrót do stosowania polimyksyn jako leków ostatniej szansy. Najczęstszym preparatem w użyciu klinicznym jest prolek polimyksyny E (kolistyny) (51) znany jako CMS (metanosulfonian kolistyny), który został opracowany w latach sześćdziesiątych jako mniej toksyczna forma dawkowania. Jednakże, jako prolek z pięcioma sulfonylowanymi grupami aminowymi, farmakokinetyka jest skomplikowana i nie jest dobrze poznana. Polimyksyna B jest podawana w postaci soli siarczanowej w powolnym wlewie dożylnym w celu przezwyciężenia ostrego działania toksycznego, ale obawy związane z nefrotoksycznością prowadzą do nieoptymalnego dawkowania. Polimyksyna „drugiej generacji” o lepszym indeksie terapeutycznym i schemacie dawkowania opracowanym przy użyciu nowoczesnej metodologii PK-PD byłaby korzystnym dodatkiem do arsenału leków przeciw wielolekoopornym zakażeniom Gram-ujemnym.

Sposób działania polimyksyn nie jest w pełni poznany. Polimyksyny wiążą się z ujemnie naładowanym lipopolisacharydem (LPS) błony zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych i zakłócają jego działanie, umożliwiając przejście polimyksyny (i innych leków) do przestrzeni peryplazmatycznej. Chociaż polimyksyny są kationowymi cząsteczkami amfifilowymi, wiązanie i rozpoznawanie z błoną zewnętrzną jest specyficzne. Delecja łańcucha tłuszczowo-acylowego i aminokwasu 1 prowadzi do powstania nonapeptydu polimyksyny B (PMBN, (52)), który, choć znacznie mniej aktywny niż polimyksyna B, zachowuje zdolność do permeabilizacji błony zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych. Enancjomer PMBN nie jest jednak permeabilizatorem. Na podstawie badań NMR polimyksyny w kompleksie z LPS opracowano model wiązania się polimyksyny z silnie konserwowanym hydrofobowym lipidem A LPS. W modelu tym dodatnio naładowane aminy oddziałują z fosforanami LPS, podczas gdy lipofilowy ogon i lipofilowy region aminokwasów 6-7 rdzenia oddziałują z lipidowym ogonem LPS. Wykazano, że niektóre pochodne polimyksyny bez znaczącej aktywności przeciwbakteryjnej wiążą się z LPS i permeabilizują bakterie na działanie innych antybiotyków .

Zależności struktura-aktywność polimyksyn zostały kompleksowo przejrzane w 2010 r. i od tej daty nastąpił dalszy rozwój chemii medycznej i badań przedklinicznych ukierunkowany zarówno na zmniejszenie toksyczności, jak i zwiększenie poziomu aktywności, szczególnie przeciwko pojawiającym się szczepom wielolekoopornym.

Polimyksyny wykazują nefrotoksyczność na poziomie zbliżonym do dawki terapeutycznej, jak również szereg słabo scharakteryzowanych ostrych efektów toksykologicznych. Mechanizm nefrotoksyczności jest obecnie przedmiotem badań, jednak uważa się, że jest on związany z kationowym charakterem cząsteczki i akumulacją w komórkach nabłonka kanalików proksymalnych nerek, przy czym w wychwycie pośredniczy receptor wielogrupowy, megalina. Cytotoksyczność została określona w typach komórek, w których lek się gromadzi, na przykład w ludzkich komórkach cewki proksymalnej nerki (HK-2) lub komórkach nabłonka cewki proksymalnej (PTEC), i może obejmować uszkodzenie mitochondriów lub udział reaktywnych form tlenu.

W ostatnich latach podjęto szereg działań w celu zmniejszenia toksyczności i poprawy wskaźnika terapeutycznego polimyksyn. Główną drogą jest całkowita synteza nowych pochodnych polimyksyny, poprzez syntezę peptydów w fazie stałej, co pozwala na manipulację w dowolnym punkcie struktury polimyksyny. Szeroko wykorzystywana jest również półsynteza z samej polimyksyny, wykorzystująca zdolność różnych enzymów do selektywnego rozszczepiania lipofilowego ogona i łańcucha tripeptydowego w określonych miejscach. Selektywna ochrona końcowych grup aminowych reszt Dab została również osiągnięta, umożliwiając półsyntezę różnych pochodnych nonapeptydu.

Zgłoszono, że usunięcie lipofilowego ogona i aminokwasu 1 w celu pozostawienia nonapeptydu polimyksyny B (PMBN) (52) prowadzi do znacznego zmniejszenia nefrotoksyczności i aktywności przeciwbakteryjnej, zachowując zdolność cząsteczki do permeabilizacji bakterii na działanie innych antybiotyków. To zmniejszenie toksyczności zostało ostatnio potwierdzone przez badania in vivo w AstraZeneca , w których histopatologia ujawniła znaczące zmiany w nerkach szczurów leczonych kolistyną w porównaniu z tymi leczonymi PMBN lub kontrolą nośnika.

W serii pochodnych pozbawionych łańcucha tłuszczowo-acylowego, Katsuma i współpracownicy badali analogi polimyksyny specyficzne dla Pseudomonas . Zastąpienie łańcucha tłuszczowo-acylowego i aminokwasu 1 polimyksyny wszystkimi resztami podstawowymi, takimi jak łańcuch Dab-Dab-Dab (53a), spowodowało silną i selektywną aktywność Pseudomonas in vitro, ale ze zwiększoną ostrą toksycznością u myszy. Mały hydrofilowy aminokwas na N-końcu (kwas di-amino propionowy (Dap) lub seryna) (53b,c) powodował aktywność Pseudomonas in vitro porównywalną do samej polimyksyny B. Analog Dap (53b) wykazywał 4,9-krotnie mniejszą ostrą toksyczność niż polimyksyna B u myszy. Wpływ na toksyczność dla nerek nie został zgłoszony w tej serii.

Podejście zastosowane przez Northern Antibiotics w celu zmniejszenia toksyczności pochodnych polimyksyny polegało na zmniejszeniu liczby ładunków dodatnich w cząsteczce. Chociaż wykazano, że reszty Dab w cyklicznej części polimyksyny są kluczowe zarówno dla wiązania LPS, jak i dla późniejszej aktywności przeciwbakteryjnej, wiązanie z LPS może nadal mieć miejsce w analogach pozbawionych reszt aminowych w liniowej części peptydu. Takie pochodne mogą działać jako permeabilizatory dla innych antybiotyków, a niektóre z nich wykazują samodzielną aktywność przeciwko węższemu spektrum organizmów. Przykłady obejmują nieapeptydy NAB-7061 (54a) z aminomaślanem w pozycji 3 i NAB-739 (54b) z d-seryną w pozycji 3. Oba zachowują zdolność polimyksyny do permeabilizacji błony zewnętrznej i działają synergistycznie z innymi antybiotykami. Zarówno NAB-7061, jak i NAB-739 wykazywały niższe powinowactwo (o około jedną piątą niższe) do błony granicznej szczoteczek kory nerek niż polimyksyna, co wykazano w teście przemieszczania gentamycyny znakowanej radiolabilnie. NAB-739 wykazał mniejszą cytotoksyczność w linii komórkowej HK-2 z wartościami IC50 około 26-krotnie mniejszymi niż polimyksyna B. NAB-739 wykazał również aktywność przeciwbakteryjną zarówno in vitro, jak i in vivo. Podczas gdy profilowanie in vitro wykazało dobrą aktywność wobec E. coli i Klebsiella, aktywność była zmniejszona w porównaniu z polimyksyną wobec gatunków Pseudomonas. NAB-739 wykazał skuteczność w modelu zakażenia E. coli, jednak do tej pory nie ma doniesień o badaniach toksyczności in vivo.

Cubist Pharmaceuticals poinformowali o zmniejszeniu toksyczności poprzez zastąpienie lipofilowego ogona polimyksyny arylo-mocznikiem w związku CB-182,804 (55). Jak dotąd jest to jedyna z nowej generacji polimyksyn, która przeszła do badań I fazy, po wykazaniu zmniejszonej nefrotoksyczności u małp cynomolgous .

Pfizer zgłosił ostatnio syntezę różnych pochodnych polimyksyny, w których Dab-3 liniowej części łańcucha aminokwasowego zastąpiono kwasem di-amino propionowym Dap , co, jak zgłoszono, zwiększa aktywność przeciwbakteryjną. Zbadano wiele różnych końcowych grup biarylowych z wnioskiem, że związki z bardziej polarnymi łańcuchami bocznymi, mierzonymi przez ClogD, były mniej cytotoksyczne w stosunku do linii komórek nerkowych hRPTEC, ale miały ogólną tendencję do zmniejszonej siły działania przeciwbakteryjnego. Jednakże jeden szczególny związek firmy Pfizer, 5x (56), w którym lipofilowy ogon polimyksyny zastąpiono polarną cząsteczką N-fenylo-pirydonową, wykazał znacznie zmniejszoną toksyczność in vitro w porównaniu z polimyksyną przy jednoczesnym zachowaniu aktywności. Związek 5x był badany in vivo pod kątem potencjału nefrotoksycznego w porównaniu do polimyksyny B w badaniu 7-dniowym na szczurach. Przy poziomie ekspozycji, przy którym polimyksyna B powodowała zmiany martwicze nerek u każdego zwierzęcia (aczkolwiek minimalne) (56) nie wykazano występowania zmian martwiczych nerek. Jednak u psa nie stwierdzono znaczącego marginesu bezpieczeństwa dla (56) w porównaniu z polimyksyną B. Zrozumienie związku toksyczności in vitro z sytuacją in vivo w przypadku polimyksyn jest nadal przeszkodą, którą należy pokonać.

Cantab anti-infectives zgłosił, że pochodne polimyksyny niebędące apeptydami, w których łańcuch acylowy zawiera funkcję polarną, wykazują zmniejszoną toksyczność in vitro i in vivo przy jednoczesnym zachowaniu skuteczności in vivo. Na przykład, związek (57) porównywano z polimyksyną B w mysim modelu zakażenia E. coli na udzie. Całkowita dawka 10 mg/kg (i.v., b.i.d.) związku (57) dała zmniejszenie obciążenia bakteryjnego o 4 log10 w porównaniu z kontrolą nieleczoną, podczas gdy ta sama dawka polimyksyny zmniejszyła obciążenie bakteryjne o 4,8 log10. Podobne wyniki uzyskano w modelu zakażenia Klebsiella pneumoniae, gdzie (57) dawał podobne zmniejszenie obciążenia bakteryjnego (zmniejszenie o 2,3 log10) jak kolistyna w dawce 10 mg/kg. In vitro, (57) był sześciokrotnie mniej cytotoksyczny niż polimyksyna, mierzona na podstawie IC50 wobec linii komórkowej HK-2. In vivo, w szczurzym modelu nefrotoksyczności, (57) dawał znacząco niższe poziomy biomarkerów uszkodzenia nerek w moczu (N-acetylo-beta-d-glukozaminidazy, albuminy i cystatyny C) w porównaniu z kolistyną na tym samym poziomie dawki.

Inne podejście zostało podjęte przez grupę z Monash University, która badała modyfikacje, które wykazują aktywność przeciwko opornym szczepom. Polimyksyny o zwiększonej lipofilności przy aminokwasach 6 i 7 rdzenia oraz lipofilnym łańcuchu, np. FADDI-02 (58a) i FADD1-03 (58b) wykazują lepszą aktywność wobec opornych szczepów Pseudomonas aeruginosa i Acinetobacter baumanii w porównaniu z polimyksyną B. Nie odnotowano toksyczności in vitro, jednak związki te były oceniane w modelu in vivo nefrotoksyczności. Badanie histologiczne nie wykazało żadnych zmian u tych szczurów leczonych FADDI-03 w porównaniu z pozytywnymi oznakami uszkodzenia nerek u zwierząt leczonych polimyksyną B. Ta niższa toksyczność została przypisana wysokiemu wiązaniu cząsteczki w surowicy, zapobiegającemu akumulacji w nerkach.

.