Konie. Uzyskano 378 próbek surowicy od zdrowych koni domowych z kilku rancz zlokalizowanych w czterech powiatach. Próbki surowicy pobrano również od koni wyścigowych (Figura 1).

Człowiek. Próbki surowicy pobrane od 42 pacjentów (17 mężczyzn i 25 kobiet) z Kliniki Chorób Zakaźnych i Neuroinfekcji Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku. U pacjentów występowały objawy neurologiczne charakterystyczne dla zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych, limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i kleszczowego zapalenia mózgu. Byli hospitalizowani w okresie od maja do września 2010 roku. U wszystkich pacjentów wykonano badania na obecność przeciwciał przeciwko wirusowi kleszczowego zapalenia mózgu za pomocą preparatu Enzygnost Anti-TBE/FSME Virus, Siemens . Próbki były konserwowane w temperaturze -20°C.

Wszystkie badane próbki były podwójnie sprawdzane i testowane w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 3+.

ELISA-1. Badanie serologiczne przeprowadzono przy użyciu komercyjnie dostępnego konkursu, ELISA ID Screen West Nile Competition (Innovative Diagnostics, Montpelier, Francja), do wykrywania przeciwciał wirusa Zachodniego Nilu przeciwko białkom otoczki pr-E i pr-M zawierającym epitop wspólny z wirusem japońskiego zapalenia mózgu, zgodnie z protokołem producenta. Wszystkie próbki były badane dwukrotnie. Mikropłytki odczytywano przy długości fali 450 nm. Test ELISA został zatwierdzony po obliczeniu stosunku wiązania resztkowego (S/N%). Próbki surowicy ze współczynnikami S/N równymi lub niższymi niż 40% uznano za pozytywne; próbki ze współczynnikami wyższymi niż 50% uznano za negatywne. Wartości S/N pomiędzy 40% a 50% były wątpliwe.

ELISA-2 została wykonana przy użyciu ID Screen West Nile IgM Capture (Innovative Diagnostics, Montpelier, Francja). Studzienki były pokryte przeciwciałem poliklonalnym IgM. Gdy uzyskano wyniki pozytywne, obecność przeciwciał pojawiała się jako niebieski roztwór, a po dodaniu roztworu zatrzymującego stawał się żółty. W przypadku braku przeciwciał nie pojawiało się żadne zabarwienie. Płytki odczytywano przy długości fali 450 nm.

ELISA-3 została wykonana przy użyciu testu enzymatycznego Ingezim WNV Compac (Ingenasa, Hiszpania) w oparciu o blokowanie ELISA, w którym zastosowano przeciwciało monoklonalne (MAb) specyficzne dla białka E wirusa WNV. Jeśli przeciwciała były obecne w próbkach surowicy, wiązały się one z antygenem. Po dodaniu MAb specyficznego dla białka E, wiązało się ono z antygenem, który nie był blokowany przez przeciwciała z próbki surowicy. W przypadku przeciwciał blokujących antygen, koniugat nie wiązał się z nim. Test odczytywano za pomocą reakcji kolorymetrycznej po dodaniu substratu. Próbki uznawano za pozytywne, gdy wartości OD były równe lub niższe niż w przypadku próbek surowicy kontrolnej. Próbki uznawano za negatywne, gdy wartość OD była równa lub wyższa od negatywnego punktu odcięcia. Próbki z wartością OD w zakresie obu wartości były uważane za wątpliwe.

Test mikroneutralizacji wirusa. Test mikroneutralizacji wirusa z pozytywnymi próbkami ELISA od dzikich ptaków został przeprowadzony w Europejskim Laboratorium Referencyjnym, ANSES, Francja. W teście wykorzystano komórki Vero i wirusa Zachodniego Nilu, szczep IS-98-ST1. Test został przeprowadzony w oparciu o standardową procedurę OIE.

3. Wyniki

Powiaty Polski oraz obszary, z których pobrano próbki przedstawiono na rycinie 1.

Większość próbek została pobrana od ptaków w trakcie przydziału i zabiegów weterynaryjnych. Część ptaków po wypadkach znalazła się w ośrodku rehabilitacyjnym. Ptaki nie przejawiały żadnych objawów chorób neurologicznych ani żadnych oznak infekcji neurologicznych. Każdy ptak został zaopatrzony przez organizację wysyłającą próbki w informacje o lokalizacji, płci, wieku oraz, gdy było to możliwe, o historii podróży.

Badania próbek surowicy wykazały obecność swoistych przeciwciał WNV w 63 próbkach pobranych od dzikich ptaków: 62 od bocianów białych i jednej od zięby zwyczajnej. Jedną dodatnią próbkę surowicy uzyskano od klaczy.

W odniesieniu do próbek surowicy od ludzi, 14 z 42 było dodatnich, a jedna była wątpliwa. Wszyscy pacjenci mieli historię ukąszeń komarów i kleszczy. Kleszczowe zapalenie mózgu zdiagnozowano u 16 pacjentów.

Aby potwierdzić wyniki, wykonano test ELISA-2 w celu wykrycia swoistych przeciwciał WNV IgM w surowicy jako pierwszej linii odpowiedzi immunologicznej. Wyniki były negatywne, a zatem nie potwierdziły obecności przeciwciał IgM ani żadnych dowodów niedawnego zakażenia zwierząt.

Aby zweryfikować wyniki uzyskane przez ELISA-1, wykonano ELISA-3 i w tych przypadkach potwierdzono obecność swoistych przeciwciał WNV. Wyniki przedstawiono w tabeli 1.

W celu potwierdzenia wyników dodatnich, dodatnie próbki surowicy ptaków były ponownie badane testem mikroneutralizacji wirusa. Wszystkie 63 próbki surowicy od dzikich ptaków zostały potwierdzone i zidentyfikowane jako pozytywne dla przeciwciał WNV z mianem 10 w 60 próbkach i mianem 30 w trzech próbkach. Jeśli chodzi o badania innych członków JECV, próbki były również negatywne dla wirusa Usutu. Nie zaobserwowano reakcji krzyżowych.

Porównanie wyników uzyskanych różnymi metodami diagnostycznymi (ELISA i testy mikroneutralizacji wirusa) przedstawiono w tabeli 1.

4. Dyskusja

W ciągu ostatnich lat zauważono, że WNV rozprzestrzenia się w krajach o klimacie umiarkowanym. Komary z rodziny Culicidae są najczęstszym wektorem rozprzestrzeniania się wirusa i obecnie sześć gatunków komarów występuje w polskiej strefie klimatycznej. W latach dziewięćdziesiątych ubiegłego wieku Juřicová i wsp. za pomocą testu zahamowania hemaglutynacji potwierdzili obecność przeciwciał WNV u 12,1% wróbli domowych (Passer domesticus) i u 2,8% wróbli drzewnych (Passer montanus) na terenie leśnictwa Campinas w Polsce. W następnych latach przeciwciała WNV stwierdzono u trzech bocianów, jednej wrony (Corvus corone cornix) i jednego łabędzia niemego (Cygnus olor) w drugiej części Polski .

W celu przedstawienia, a następnie potwierdzenia uzyskanych wyników wykonaliśmy trzy różne testy ELISA. Pierwszym testem ELISA był ID Screen West Nile Competition, test specyficzny dla WNV, ale dający również krzyżowe reakcje serologiczne wśród członków JECV. Gdy uzyskano pozytywne wyniki, wykonano test ELISA-2 West Nile IgM Capture, który jest specyficzny tylko dla WNV i pozwala wykluczyć reakcje krzyżowe, ale wykrywa tylko IgM. Oznacza to, że możemy zidentyfikować tylko niedawne zakażenie i nie możemy wykryć przeciwciał IgG. ELISA-3 została użyta do potwierdzenia wyników uzyskanych za pomocą ELISA-1 i wyniki zostały potwierdzone w 100% przypadków.

W naszym badaniu, pozytywne wyniki z próbek surowicy dzikich ptaków uzyskane za pomocą testów ELISA zostały potwierdzone testem mikroneutralizacji wirusa. Dodatkowo, test ELISA wykazał obecność przeciwciał WNV w 14 z 42 próbek surowicy od pacjentów z objawami zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych, limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i kleszczowego zapalenia mózgu, ale nie byliśmy w stanie zweryfikować uzyskanych wyników za pomocą testu neutralizacji redukcyjnej (PRNT). Zakażenie WNV u ludzi i identyfikacja WNV w płynie mózgowo-rdzeniowym były zwykle potwierdzane za pomocą RT-PCR, Nested PCR lub w utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie tkankach ludzkich za pomocą RT-PCR. Według badań Czupryny i wsp. wszystkie próbki płynu mózgowo-rdzeniowego od 24 pacjentów hospitalizowanych w Klinice Chorób Zakaźnych i Neuroinfekcji Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku były ujemne dla RNA WNV.

próbki surowicy ludzi, ptaków i koni były używane jako próbki właściwe do oznaczania swoistych przeciwciał WNV. W przypadku potwierdzenia obecności swoistych przeciwciał w próbkach surowicy, uznawano, że zwierzę lub człowiek miał kontakt z wirusem (w Polsce lub poza granicami kraju). Przypuszcza się, że dzikie ptaki z wynikiem dodatnim mogły mieć kontakt z wirusem poza granicami kraju. Jeśli chodzi o dodatnie próbki od ludzi, to 11 pacjentów nigdy nie opuściło kraju, co oznacza, że musieli mieć kontakt z wirusem już w Polsce. Podobnie jest w przypadku koni, które zgodnie z historią podróży nigdy nie opuszczały kraju.

Na podstawie sytuacji epidemiologicznej w Europie, roli dzikich ptaków w transmisji WNV oraz wyników dotychczasowych badań serologicznych ludzi i ptaków wskazuje się, że obecność WNV w Polsce może być możliwa. W Polsce przeciwciała WNV wykryto u gorączkujących kobiet oraz u zdrowych pracowników leśnych z regionu świętokrzyskiego (28,85%) i podlaskiego (34,14%). Uzyskane przez nas wyniki serologiczne mogą sugerować, że wirus jest już obecny w naszej strefie klimatycznej i w naszym ekosystemie. Należy wziąć pod uwagę możliwość jego reakcji krzyżowej z wirusami kleszczowego zapalenia mózgu i choroby endemicznej.

Zgoda etyczna

Badanie zostało zatwierdzone przez II Lokalną Komisję Etyczną w Lublinie (numer 92/2010 z dnia 16 listopada 2010 r.) oraz uzyskało zgodę Generalnego Dyrektora Ochrony Środowiska (numer DOP-OZGŁZ. 6401.03.36.2011.dł).

Konflikt interesów

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować za wsparcie finansowe udzielone przez projekt pracy ramowej P/020, Wolno żyjące ptaki wodne jako rezerwuar i wektor podczas ekspansji chorób wirusowych oraz projekt pracy ramowej W/211, Opracowanie metod diagnostycznych i ocena ryzyka występowania zakażeń wirusem Zachodniego Nilu u ptaków w Polsce (2014-2018).

.