Aby zniwelować duży dystans ewolucyjny między obecnymi kręgowcami a przodkiem strunowców z nieduplikowanym genomem, Sacerdot i współpracownicy najpierw zrekonstruowali genom przodka amniota. W tym celu zastosowali opracowany przez siebie wcześniej algorytm AGORA (Algorithm for Gene order Reconstruction in Ancestors) do analizy kolejności, orientacji i drzew genowych 61 genomów wymarłych zwierząt z bazy danych Ensembl. Wśród nich było 40 ssaków, 3 ptaki, 2 gady, 1 płaz, 8 teleostów, 1 koelakant, 2 osłonice, 1 nicień i 1 mucha. Niestety, Ensembl nie zawiera genomu żadnej ryby chrzęstnoszkieletowej (np. rekina słoniowego, Callorhinchus milii, chimaery, która ma najwolniej ewoluujący genom kręgowców), ani hemichordates, echinoderms czy cephalochordates – bezkręgowych deuterostomów, których genomy nie uległy znacznej utracie genów i zagęszczeniu charakterystycznemu dla genomów tuńczyków.

Sacerdot i wsp. zidentyfikowali pary genów ohnologicznych w tym rodowym genomie amniota i stworzyli zestawy Contiguous Ancestral Regions (CARs). Ohnologi to homologiczne geny w obrębie gatunku, powstałe w wyniku WGD. Wreszcie, pogrupowali te CARs w zestaw 51, które w znaczący sposób dzieliły się na 17 grup po cztery, lub tetrad; oczekiwany wynik dwóch rund WGD. Aby rozróżnić wzór fuzji i rozszczepień chromosomalnych podczas ewolucji, chcieli porównać te 17 tetrad z organizacją genów w nieduplikowanym genomie przedkręgowców. Jednak genomy osłonic ewoluują bardzo szybko i są dość rozbieżne z genomami innych deuterostomów bezkręgowych, a opublikowany genom cefalochordata Branchiostoma floridae jest zbyt rozczłonkowany, by można było przeprowadzić analizę. Dlatego autorzy porównali 17 tetrad RCA z 17 grupami powiązań przodków chrzęstnoszkieletowych, ustalonymi wcześniej przez porównanie syntezy genów na chromosomach człowieka i na rusztowaniach genomu B. floridae. Co godne uwagi, każda z tych grup powiązań chordatowych korelowała z jednym dominującym tetradem CAR. Z porównania tego wywnioskowali, że genom przodka kręgowców składał się z 17 chromosomów, które następnie uległy duplikacji do 34 chromosomów w wyniku jednej rundy WGD (1R). Następnie doszło do 7 fuzji chromosomowych, w wyniku których powstało 27 chromosomów, które w momencie powstania kręgowców, przed rozszczepieniem agnatów/gnatosomów, zduplikowały się ponownie (2R WGD), tworząc 54 chromosomy. Po 2R WGD nastąpiły cztery dodatkowe fuzje przed powstaniem przodka kręgowców kostnych, a następnie piąta fuzja przed powstaniem podstawy płazów. Tak więc kariotyp przodka kręgowców kostnych zawierał 50 chromosomów, a przodek amniota miał 49 chromosomów (ryc. 1b).

Oprócz rekonstrukcji duplikacji, fuzji i rozszczepień chromosomów w toku ewolucji, algorytm AGORA może obliczyć kolejność genów na chromosomach hipotetycznego przodka amniota, porównując kolejność genów na chromosomach jego wymarłych potomków. Ten zrekonstruowany genom przodka amniota zawiera 80% z 15 854 genów w RCA. Nierównomierne rozmieszczenie tych genów na 49 chromosomach przodka amniota może odzwierciedlać rzeczywistość lub alternatywnie trudności w rekonstrukcji kolejności genów na chromosomach, które przeszły znaczną rearanżację genów podczas ewolucji.

Even so, dwie rzeczy wyróżniają się w analizie. Pierwszą z nich jest to, że porównanie genomu ancestralnego amniota z CARs zgrupowanymi w 17 tetradach do super-scaffolds genomu minoga (Petromyzon marinus) pokazuje wyraźny wzór 1 do 4 zgodny z 2R WGD przed rozszczepieniem agnatów/gnathostomów. Jest to sprzeczne z wynikami Smitha i in., którzy znaleźli silne dowody na istnienie tylko 1R WGD u minoga w porównaniu z kurczakiem. Rozbieżność ta może być wyjaśniona przez włączenie danych genomowych z większej liczby gatunków do rekonstrukcji hipotetycznego genomu ancestralnego amniota, co samo w sobie eliminuje mylące rearanżacje genomowe, które wystąpiły u kręgowców po przodku amniota. Jest to prawdopodobnie również spowodowane włączeniem danych filogenetycznych do określenia tetrad CAR, ujawniając w ten sposób ohnologi, które rozeszły się u podstawy ewolucji kręgowców.

Drugim wynikiem, który wyróżnia się jest zgodność między kolejnością genów na ludzkich chromosomach i 17 chromosomach pre-1R. Kiedy 17 chromosomów pre-1R jest zakodowanych kolorami (ryc. 1b), a kolory każdego genu przeniesione na pozycje 8282 ludzkich genów, które wywodzą się z genów pre-1R, wzór duplikacji genomu i translokacji jest widoczny. Na przykład, chromosom 1 w genomie pre-1R zawiera geny Hox. Duży segment ludzkiego chromosomu 2 zawiera klaster HoxD oraz wiele innych genów odpowiadających tym na chromosomie 1 pre-1R. Pozostałe 3 ludzkie klastry Hox znajdują się na ludzkich chromosomach 7, 12 i 17. Ponadto, znaczna liczba homologów innych genów na chromosomie 1 pre-1R znajduje się na ludzkich chromosomach 1, 3, 10, 16 i 22, co wskazuje na translokacje.