July 20, 2015

Findings Provide Potential New Target To Interfere With Viral Life Cycle

By Jocelyn Duffy / 412-268-9982 / [email protected]

Wszystkie wirusy mają przemysłowe wytrzymałe powłoki, które otaczają i chronią materiał genetyczny wewnątrz, umożliwiając cząstkom wirusowym pozostanie stabilnym, zakaźnym i zdolnym do rozprzestrzeniania się. Biofizyk z Uniwersytetu Carnegie Mellon, Alex Evilevitch, i jego współpracownicy zidentyfikowali piętę achillesową tej twardej powłoki. Opublikowane w Journal of Virology, najważniejszym czasopiśmie w tej dziedzinie, odkrycia wskazują najsłabszą część powłoki wirusowej i stanowią potencjalny nowy cel dla zakłócenia cyklu życiowego wirusa oraz dla opracowania stabilnych nośników terapii genowej.

Wirusy takie jak Herpes Simplex 1 i Phage Lambda mają twarde zewnętrzne powłoki (szare), które osłaniają i chronią wirusowe DNA (zielone). Alex Evilevitch i współpracownicy zidentyfikowali teraz piętę achillesową tej twardej powłoki – portal wirusowy (czerwony). Powyższe obrazy to rekonstrukcje Cryo EM; schemat portalu jest nałożony.

Zewnętrzna powłoka, zwana kapsydem, otacza materiał genetyczny wirusa. Wirusy takie jak Herpes Simplex virus typu 1 (HSV-1) zawierają dwuniciowe DNA, którego długie nici są ciasno upakowane i wywierają ogromne ciśnienie, sięgające dziesiątek atmosfer, na wewnętrzną ścianę kapsydu. W poprzedniej pracy Evilevitch po raz pierwszy zmierzył to ciśnienie w HSV-1; pokazał również, że to właśnie to ciśnienie napędza DNA z małego portalu w kapsydzie wirusa i do komórki gospodarza.

W swoich najnowszych badaniach Evilevitch i student fizyki David Bauer ujawniają, że portal jest czymś więcej niż tylko przewodnikiem dla DNA. Jest to również najsłabsza część strukturalna kapsydu.

„Najbardziej ekscytujące jest to, że po raz pierwszy pokazaliśmy, jak ciśnienie DNA wpływa na stabilność portalu, co ostatecznie określa stabilność wirusa w każdej temperaturze”, powiedział Evilevitch, profesor nadzwyczajny fizyki i członek CMU’s Center for the Mechanics and Engineering of Cellular Systems.

Portal jest krytycznym elementem kapsydu wirusowego. Złożony z kilku różnych białek, kompleks portalu aktywnie pakuje DNA podczas montażu wirusa, uwalnia DNA podczas infekcji i, jak ujawniają nowe badania, jest kluczem do utrzymania delikatnej równowagi kapsydów, które są wystarczająco stabilne, aby utrzymać genom, a jednocześnie są wystarczająco niestabilne, aby umożliwić skuteczne uwolnienie genomu podczas infekcji.

„Poprzednie eksperymenty badały rolę ciśnienia wewnętrznego na integralność strukturalną kapsydów wirusowych,” powiedział Evilevitch. „Tutaj dostarczamy pierwszych eksperymentalnych dowodów na to, że to wytrzymałość mechaniczna samego kompleksu portalowego określa stabilność wirusa w odniesieniu do zatrzymania genomu.”

„Najbardziej ekscytujące jest to, że po raz pierwszy pokazaliśmy, jak ciśnienie DNA wpływa na stabilność portalu, co ostatecznie określa stabilność wirusa w czasie w każdej temperaturze.” – Alex Evilevitch

Dla tego badania, Evilevitch i jego zespół przyjrzeli się stabilności kompleksu portalowego w trzech różnych, wirusach – dwóch wirusach, które infekują bakterie (Lambda i P22) i jednym, który infekuje ludzkie komórki (HSV-1). Wszystkie trzy wirusy zawierają dwuniciowe DNA, które wywiera nacisk na ścianę kapsydu.

Używając nowatorskiego testu skaningowej mikrokalorymetrii różnicowej, który opracowali, badacze ogrzewali próbki wirusów i wykrywali temperaturę, w której portal otwiera się, aby uwolnić DNA. Temperatura ta odzwierciedla mechaniczną stabilność portalu.

Dla każdego typu wirusa, który badali, naukowcy stworzyli zmutowane szczepy tego wirusa poprzez zmianę długości upakowanego DNA wewnątrz, tworząc w ten sposób mutanty o różnych ciśnieniach wewnętrznych. Wyniki testów ujawniły, że mutanty z większą ilością upakowanego DNA, a zatem z większym ciśnieniem, uwalniały swoje DNA przez portal w niższej temperaturze. To odkrycie sugeruje, że mechaniczna siła genomu napierająca na portal wirusa destabilizuje go i czyni go podatnym na złamanie.

Dodatkowo, zespół badawczy porównał temperaturę uwalniania DNA dla trzech różnych typów wirusa. Wyniki ujawniły wzrost stabilności portalu dla wirusów, które mają dłuższe genomy i dlatego mają wyższe ciśnienie wewnątrz.

„Nasze wyniki sugerują, że kompleks portalowy ewoluował, aby wytrzymać siłę zewnętrzną zapakowanego genomu zrównoważoną z wymogiem skutecznego uwalniania DNA podczas infekcji”, powiedział Evilevitch. „Dalsze zrozumienie tej równowagi pomiędzy wewnętrznym ciśnieniem a stabilnością portalu oferuje nowe spojrzenie na zakłócanie replikacji wirusowej, jak również projektowanie wektorów wirusowych do terapii genowej, które mogą stabilnie zatrzymywać obcy kwas nukleinowy.”

Oprócz Evilevitcha i Bauera, naukowcy zaangażowani w projekt obejmują: CMU’s Dong Li; University of Pittsburgh School of Medicine’s Fred Homa i Jamie Huffman; University of Utah School of Medicine’s Kasandra Wilson, Justin Leavitt i Sherwood Casjens; oraz Louisiana State University School of Veterinary Medicine’s Joel Baines.

Te badania zostały sfinansowane przez Swedish Research Council i National Science Foundation (CHE-1152770 do AE) z dodatkowym wsparciem z Public Health Service dotacji i National Institutes of Health szkolenia grant.

.