Abstract

Scieżka sygnalizacyjna Wnt jest związana z wieloma istotnymi procesami komórkowymi. Celem pracy jest zbadanie wpływu sygnalizacji Wnt na proliferację hodowanych komórek HEK293T. Komórki inkubowano z Wnt3a, a aktywację szlaku Wnt śledzono poprzez analizę poziomu białka β-kateniny oraz poziomu ekspresji genów docelowych MYC i CCND1. Poziom białka β-kateniny wzrósł aż czterokrotnie. Podczas gdy poziom mRNA dla c-Myc i cykliny D1 wzrósł nieznacznie, poziom białka wzrósł aż 1,5-krotnie. Co ciekawe, testy MTT i BrdU wykazały odmienne wyniki w pomiarze tempa proliferacji stymulowanych przez Wnt3a komórek HEK293T. W testach BrdU można było zaobserwować wzrost tempa proliferacji, który korelował z zastosowanym stężeniem Wnt3a. Przeciwnie, korelacji tej nie udało się wykazać w testach MTT. Wyniki MTT, które opierają się na aktywności mitochondrialnej, zostały potwierdzone przez analizę kompleksu dehydrogenazy bursztynianowej metodą immunofluorescencji i western blotting. Podsumowując, nasze badania pokazują, że Wnt3a aktywuje proliferację komórek HEK293. Efekty te mogą być wykryte przez pomiar syntezy DNA, a nie przez pomiar zmian aktywności mitochondrialnej.

1. Wprowadzenie

Ścieżka sygnalizacyjna Wnt jest znana z odgrywania kluczowej roli w regulacji różnicowania komórkowego, proliferacji, przeżycia i apoptozy. Białka Wnt są wysoce konserwatywną rodziną wydzielanych, modyfikowanych lipidami, bogatych w cysteinę glikoprotein, które aktywują kaskady sygnalizacyjne wewnątrz komórki poprzez wiązanie się z członkiem rodziny Frizzled (Fz) receptorów sprzężonych z białkami G na macierzy zewnątrzkomórkowej. Istnieje 19 członków Wnts kręgowców, które można podzielić na dwie główne klasy w oparciu o ich zdolność do stabilizacji cytozolowej β-kateniny: szlak kanoniczny i niekanoniczny. Ostatnie prace wykazały również, że niektóre ligandy Wnt, takie jak Wnt5a, są w stanie aktywować więcej niż tylko jeden szlak sygnałowy Wnt, tak więc ściśle binarna klasyfikacja staje się coraz bardziej przestarzała. Nieprawidłowe funkcjonowanie szlaku sygnalizacyjnego Wnt jest związane z kilkoma chorobami, takimi jak osteoporoza, choroba Leśniowskiego-Crohna, choroba Alzheimera, schizofrenia, a zwłaszcza rak .

Ligand Wnt3a należy do zależnej od β-kateniny (kanonicznej) sygnalizacji Wnt, która wiąże się z receptorami transmembranowymi frizzled. Następnie kompleks receptora lipoprotein o niskiej gęstości z białkiem 5 (LRP5) lub LRP6 aktywuje cytoplazmatyczne białka disheveled, które powodują hamowanie kinazy 3β syntazy glikogenu (GSK-3β). Protoonkoproteina β-katenina gromadzi się w cytoplazmie w wyniku rozpadu kompleksu destrukcyjnego, który tworzą: adenomatoza polipowatości coli (APC), AXIN i GSK-3β. W ten sposób β-katenina może być translokowana do jądra, gdzie aktywuje transkrypcję genów docelowych, w której pośredniczy specyficzny dla komórek T czynnik transkrypcyjny (TCF)/czynnik wzmacniający limfoidy (LEF). Geny te są odpowiedzialne za regulację istotnych procesów fizjologicznych w rozwoju embrionalnym i dorosłym, takich jak proliferacja komórek, różnicowanie, morfogeneza i adhezja komórek .

W przypadku wskazania proliferacji, istnieje złożona interakcja między kanoniczną sygnalizacją Wnt a cyklem komórkowym. Szlak sygnalizacyjny Wnt/β-katenina jest istotny w stymulowaniu progresji fazy G1 poprzez hamowanie GSK-3β, która reguluje efektory cyklu komórkowego i regulatory wzrostu .

Jednym z bezpośrednich genów docelowych szlaku sygnalizacyjnego Wnt/β-katenina jest protoonkogen MYC, który został zidentyfikowany jako cel Wnt w komórkach raka jelita grubego . Regulator transkrypcji c-Myc kontroluje wiele funkcji komórkowych, zwłaszcza regulację progresji cyklu komórkowego. Gen kodujący cyklinę D1 CCND1 jest również genem docelowym szlaku Wnt/β-katenina, który został opisany w komórkach raka jelita grubego. Cyklina D1 jako aktywator kinazy zależnej od cykliny (cdk) 4 lub cdk 6 napędza przejście fazowe G1/S .

Istnieje kilka sposobów pomiaru proliferacji komórek indukowanej przez Wnt3a. Jedną z nieradioaktywnych metod jest test immunologiczny oparty na inkorporacji 5-bromo-2′-deoksyurydyny (BrdU) do DNA w celu określenia syntezy DNA, która koreluje z przejściem w fazę S, a tym samym z proliferacją komórek. Inna metoda wykorzystuje pomiar aktywności mitochondrialnej komórek zdolnych do życia. W teście MTT nierozpuszczalny niebieski produkt formazanu jest wytwarzany przez dehydrogenazy mitochondrialne poprzez redukcję MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylo-tetrazolowy) .

W tym badaniu badaliśmy proliferację komórek HEK293T pod wpływem ligandów Wnt3a przy użyciu testu MTT, jak również testu BrdU. Ponadto porównano wyniki tych testów z aktywnością mitochondrialną komórek poddanych działaniu Wnt3a, mierzoną przez barwienie immunologiczne białka łańcucha transportu elektronów SDHA (succinate dehydrogenase complex subunit A).

2. Materiały i Metody

2.1. Cells and Cell Cultivation

Human embryonal kidney cells, HEK293T, were cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (PAN Biotech, Aidenbach, Germany), 1% nonessential amino acids, and 1% penicillin/streptomycin (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) at 37°C in 5% CO2.

2.2. Proliferation Assays

MTT i BrdU assays were performed on 96-well plates. W każdej studzience umieszczano 10 tysięcy komórek i stymulowano je rosnącymi dawkami Wnt3a (R&D Systems, Minneapolis, USA), a mianowicie 0, 10, 50, 100, 150 i 200 ng/mL, przez 24, 48 i 72 h. MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) rozpuszczano w PBS w stężeniu 5 mg/mL i do każdej studzienki dodawano 20 μL roztworu MTT, a następnie inkubowano przez trzy godziny w temperaturze 37°C w 5% CO2. Następnie medium z MTT wylewano i dodawano 200 μL DMSO. W celu rozpuszczenia kryształów, komórki wytrząsano przez 15 min w temperaturze pokojowej. Płytki odczytywano za pomocą czytnika ELISA (Tecan Group Ltd., Männedorf, Szwajcaria) przy długości fali 590 nm. Do oznaczania BrdU użyto komercyjnego zestawu „Cell Proliferation ELISA BrdU colorimetric” (Roche, Mannheim, Niemcy) zgodnie z instrukcjami producenta. Po dodaniu roztworu znakującego BrdU komórki były inkubowane przez trzy godziny w temperaturze 37°C w 5% CO2. Po ostatnim etapie płukania do komórek dodawano 100 μL/basenik roztworu substratu, a reakcję zatrzymywano po 15 min inkubacji w temperaturze pokojowej za pomocą kwasu siarkowego. Płytki odczytywano natychmiast za pomocą czytnika ELISA przy długości fali 450 nm. Wszystkie oznaczenia przeprowadzono w trzech powtórzeniach (). Do kalibracji komórki posiano w różnych liczbach (0,1 × 104 do 3 × 104).

2.3. Immunocytochemia i mikroskopia fluorescencyjna

Komórki HEK293T wysiewano na płytki 24-dołkowe i traktowano 0-200 ng/mL Wnt3a przy konfluencji 30% i utrwalano w 4% formaldehydzie po 24, 48 i 72 h. Dodawano przeciwciało SDHA (Abcam, Cambridge, UK) w rozcieńczeniu 1 : 200 i inkubowano komórki przez godzinę. Jądra komórkowe barwiono przeciwciałem DAPI przez 5 min. Komórki analizowano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (Observer. Z1 firmy Zeiss, Jena, Niemcy) i towarzyszącego mu oprogramowania AxioVision 4.7.

2.4. Protein Gel Electrophoresis and Western Blot

U Using the Bradford-Assay protein concentrations in whole-cell lysates were determined. Jednakowe ilości białek ładowano na żele SDS-poliakrylamidowe (NuPAGE, 4-12%, Life Technologies, Carlsbad, USA). Żele prowadzono pod napięciem 150 V przez 1 h i przenoszono na membrany nitrocelulozowe za pomocą iBlot System (Life Technologies). Membrany analizowano przy użyciu przeciwciał pierwotnych przeciwko SDHA, β-kateninie, c-Myc, cyklinie D1 i β-aktynie (Cell Signaling, Cambridge, UK), rozcieńczonych w stosunku 1 : 1000 w TBS-Tween z 3% mlekiem, a następnie inkubowano z odpowiednim przeciwciałem wtórnym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (rozcieńczenie 1 : 2000). Pasma białkowe były wizualizowane przy użyciu detekcji ECL.

2.5. RNA Isolation and RT-PCR

Total RNA was isolated using NucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel, Düren, Germany) and 1 μg RNA was reverse-transcribed with Verso cDNA-Kit (Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany) in a volume of 40 μL. Sekwencje primerów (MWG, Monachium, Niemcy) stosowanych do półilościowej PCR z odwrotną transkryptazą są następujące dla GAPDH 5′-catggtgctgagatttgccaac-3′ (do przodu) i 5′-tcaaccttgaccttctcatcac-3′ (do tyłu), dla MYC 5′-ccgagcaaggacgcgactctc-3′ (do przodu) i 5′-gcctttcagagaagcggtcct-3′ (do tyłu), oraz dla CCND1 5′-gcctgaacctgaggagcccca-3′ (do przodu) i 5′-gtcacacttgatcactctgg-3′ (do tyłu). Amplifikację PCR przeprowadzono przy użyciu My Taq Red Mix (Bioline, Luckenwalde, Niemcy) zgodnie z protokołem producenta. Reakcję przeprowadzano ze wstępną denaturacją przez 2 min w 94°C, następnie 30 cykli denaturacji w 94°C przez 1 min, annealing w 55°C (CCND1), 57°C (GAPDH) lub 60°C (MYC) przez 30 sek. i przedłużenie w 72°C przez 1 min. Końcowy etap przedłużania trwał 10 min w temp. 72°C. Produkty PCR analizowano metodą elektroforezy na 1,5% żelu agarozowym.

2.6. Analiza danych

Do zarządzania danymi, w tym do obliczania odchyleń standardowych, wykorzystano oprogramowanie Microsoft Excel. Western blots i żele agarozowe skanowano za pomocą systemu dokumentacji żelowej Quantum ST4 (Vilber Lourmat, Eberhardzell, Niemcy). Paski były kwantyfikowane przy użyciu oprogramowania ImageJ (Wayne Rasband, NIH, Bethesda, USA).

3. Wyniki

3.1. Effects of Wnt3a on Induction of β-Catenin and Typical Wnt Target Genes

W celu udowodnienia aktywacji szlaku Wnt, wykryliśmy ilość stężenia białka β-kateniny w komórkach HEK293T po traktowaniu Wnt3a (Figura 1). Po 24 godzinach leczenia, stężenie białka β-kateniny wzrastało wraz ze wzrostem stężenia Wnt3a. Najwyższe stężenie białka β-kateniny zidentyfikowano po 24 godzinach przy stężeniu 200 ng/mL Wnt3a. W tym przypadku kwantyfikacja wykazała czterokrotny wzrost w porównaniu do kontroli. W punktach czasowych 48 i 72 godzin po leczeniu efekt indukcji β-kateniny nie jest już wyraźnie rozpoznawalny. Ponadto przeanalizowaliśmy regulację genów docelowych Wnt: CCND1 i MYC po leczeniu Wnt3a zarówno za pomocą półilościowego RT-PCR, jak i western blot (Ryc. 2 i 3). W komórkach nieleczonych wykryto podstawowy poziom c-Myc i cykliny D1. Wyniki RT-PCR wykazały marginalne zmiany w ilości MYC cDNA oraz indukcję CCND1 po 24 i 48 h z 10 ng/mL Wnt3a, jak również po 72 h ze stężeniem 100-200 ng/mL Wnt3a. Nieznacznie podwyższony poziom białka c-Myc obserwowano przy stężeniu 50 ng/mL po 24 h. Oznaczenie ilościowe cykliny D1 metodą western blot wykazało jej wzrost o współczynnik 1,5 przy stężeniu Wnt3a od 50 do 200 ng/mL po 24 godzinach. Poziom białka c-Myc wzrastał w ten sam sposób wraz ze stężeniem 50 ng/mL Wnt3a po 24 godzinach.

Rysunek 1

Western blot analysis of HEK293T cells treated with 0-200 ng/mL Wnt3a for 24, 48, or 72 h. β-katenina nieznacznie wzrastała 24 godziny po leczeniu. Przeciwciało β-aktyna zostało użyte jako kontrola obciążenia. W celu kwantyfikacji poziomy białek znormalizowano do poziomu β-aktyny, a kontrolę nietraktowaną ustawiono na 1.

Figura 2

Wyniki RT-PCR. Eksponencjalnie rosnące komórki HEK293T traktowano 0-200 ng/mL Wnt3a przez 24, 48 lub 72 h. Po tych punktach czasowych wyizolowano całkowite RNA i przeprowadzono półilościową RT-PCR przy użyciu starterów specyficznych dla CCND1, MYC i, jako kontroli obciążenia, GAPDH. W celu kwantyfikacji, ekspresja została znormalizowana do poziomu ekspresji GAPDH, a kontrola nietraktowana została ustawiona na 100%.

Rysunek 3

Analiza Western blot komórek HEK293T traktowanych 0-200 ng/mL Wnt3a przez 24, 48, lub 72 h. Membranę inkubowano ze specyficznymi przeciwciałami cykliny D1 i c-Myc. Przeciwciało β-aktyna było używane jako kontrola obciążenia. W celu kwantyfikacji, poziomy białek zostały znormalizowane do poziomu β-aktyny, a kontrola bez leczenia została ustawiona na 100%.

3.2. Cell Proliferation Assays

Aby zbadać wpływ białek Wnt na wzrost komórek, komórki HEK293T hodowano w 96-dołkowych płytkach przez 24 godziny, zanim poddano je działaniu stężeń białka Wnt3a odpowiednio 0, 10, 50, 100, 150 lub 200 ng/mL. Po 24, 48 i 72 godzinach inkubacji przeprowadzono oznaczenia MTT i BrdU. Badania BrdU wykazują wyraźną tendencję; wraz ze wzrostem stężenia Wnt3a wzrastał związany z tym odczyt (Rysunek 4(a)), w którym Wnt3a wskazuje najwyższą szybkość wzrostu po 48 godzinach i stężeniu 200 ng/mL.

(a)

(b)

(a)
(b)

Rysunek 4

Wyniki badań proliferacji. Komórki HEK293T poddano działaniu różnych stężeń Wnt3a. Wartości testów mierzono po 24 h, 48 h i 72 h. Słupki pokazują liczbę komórek na studzienkę wyrażoną jako procent w porównaniu do nietraktowanej kontroli (oś pionowa), która została znormalizowana do 100%. Wszystkie oznaczenia wykonano w trzech powtórzeniach. (a) Oznaczenie BrdU. (b) Test MTT.

W przeciwieństwie do testów BrdU, testy MTT nie wykazały korelacji pomiędzy stężeniem Wnt a liczbą komórek. Liczba komórek pozostała taka sama lub zmniejszyła się w porównaniu z odpowiednimi kontrolami (patrz Figura 4(b)).

3.3. Aktywność mitochondrialna

Aby dodatkowo uzasadnić rolę Wnt3a w odniesieniu do aktywności mitochondrialnej w komórkach HEK293T, ilości białka SDHA określono metodą western blot, jak również analizą immunocytochemiczną. Dehydrogenaza bursztynianowa (SDH) ze swoją podjednostką SDHA jest kluczowym składnikiem cyklu kwasu cytrynowego, który jest zaangażowany w kompleks II mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów i jest odpowiedzialny za przenoszenie elektronów z bursztynianu do ubichinonu. Komórki były traktowane tak samo jak w przypadku eksperymentów analizy proliferacji i inkubowane z przeciwciałem SDHA, jak opisano powyżej. Wyniki (Rysunek 5) wykazały wzrastający sygnał fluorescencji, a także bardziej intensywny sygnał na Western Blot w stosunku do kontroli po 24 godzinach traktowania Wnt3a. Po 48 godzinach poziom białka zarejestrowany w mikroskopii immunofluorescencyjnej lub w analizie western blot nie wykazywał istotnych zmian. Po 72 godzinach leczenia Wnt3a w obu eksperymentach obserwowano nawet zmniejszanie się sygnału. Najwyższy sygnał mierzony był po 24 godzinach przy zastosowaniu 50 ng/mL Wnt3a.

(a)

(b)

(c)

.
(a)
(b)
(c)

Rysunek 5

Aktywność mitochondrialna komórek HEK293T traktowanych Wnt3a. (a) Eksponencjalnie rosnące komórki HEK293T poddano działaniu różnych stężeń Wnt3a przez wskazany czas. Przygotowano ekstrakty białkowe i wykorzystano je do analizy western blot. Frakcje membranowe inkubowano z przeciwciałem przeciwko SDHA lub, jako kontrolę ładunku, przeciwko β-aktynie. (b i c) Komórki HEK293T poddano analizie immunocytochemicznej. Białko SDHA wykrywano za pomocą zielonej fluorescencji w mikroskopie fluorescencyjnym przy 200-krotnym powiększeniu. Słupki przedstawiają intensywność pasm wyrażoną w procentach w porównaniu do nietraktowanej kontroli (oś pionowa), która została znormalizowana do 100%.

4. Dyskusja

Białka Wnt są zaangażowane w różne funkcje komórkowe, w tym regulację ekspresji genów dla cyklu komórkowego i proliferacji. Wnt3a jest znany jako promotor proliferacji i migracji ludzkich komórek nabłonka soczewki, również dla proliferacji fibroblastów lub jako regulator proliferacji komórek beta NIT-1 trzustki. MYC i CCND1 są genami docelowymi szlaku sygnałowego Wnt w komórkach ssaków. Na przykład Yoon i wsp. wykazali, że sygnalizacja Wnt aktywuje biogenezę mitochondrialną, przeprowadzając zakrojony na szeroką skalę screen RNAi; zidentyfikowali oni geny, które wpływają na funkcję mitochondrialną, między innymi MYC .

W niniejszej pracy określiliśmy wpływ Wnt3a na proliferację komórek HEK293T. W tym celu zastosowaliśmy dwa główne testy, które są powszechnie stosowane do analizy wskaźników proliferacji hodowanych komórek, a mianowicie testy MTT i BrdU. W ten sposób wykryliśmy i bezpośrednio porównaliśmy specyficzny wpływ ligandów Wnt na syntezę DNA i aktywność mitochondrialną.

W celu ustanowienia naszego systemu i udowodnienia wpływu Wnt3a na ścieżkę Wnt w komórkach HEK293T wykazaliśmy indukcję β-kateniny po 24 godzinach traktowania Wnt3a i przeanalizowaliśmy poziom ekspresji MYC i CCND1. Poziom obu genów docelowych również wzrósł po 24 godzinach ekspozycji na Wnt3a. C-Myc odgrywa kluczową rolę w progresji fazy G1; reguluje cyklinę D1 i hamuje p21 i p27. Cyklina D1 z kolei promuje fosforylację i hamowanie kompleksu retinoblastoma (Rb), który sam podwyższa poziom cykliny E. Wzbogacenie cykliny E prowadzi do przejścia punktu kontrolnego fazy G1/S .

Podczas fazy G1 mitochondria muszą dostarczyć dużą ilość energii . Po tej fazie oksydacyjnej następuje okres redukcyjny podczas fazy S-/G2-/M cyklu komórkowego, w którym zachodzi replikacja DNA i proliferacja mitochondriów .

Szybkości proliferacji HEK293T traktowanych Wnt3a były różne, gdy mierzone przez dwa testy używane w tym badaniu. Wyjaśniamy tę różnicę odmiennymi mechanizmami detekcji tych metod. Test MTT mierzy aktywność mitochondriów; z drugiej strony test BrdU wykrywa względną ilość nowo zsyntetyzowanego DNA. Wagner i wsp. powołują się na wysoce istotną zależność pomiędzy BrdU i MTT w swoich wynikach dotyczących proliferacji limfocytów psich, chociaż wykazano, że test BrdU jest bardziej czuły niż MTT. Pozornie negatywny wpływ Wnt3a na liczbę komórek można wytłumaczyć spadkiem aktywności mitochondrialnej. Test BrdU wykazał jednak promujący wpływ na syntezę DNA w tych komórkach. Eksperymenty z aktywnością mitochondrialną wykazały, że dopiero po 24 godzinach leczenia Wnt3a poziom SDHA uległ podwyższeniu. Aktywacja rekombinowanym Wnt3a prawdopodobnie nie ma wpływu na aktywność mitochondrialną po 48 godzinach lub później. Świadczy o tym ograniczony czasowo efekt, jaki wykazuje malejący sygnał podczas testu MTT po 48 i 72 godzinach. Potwierdza to również zmniejszająca się akumulacja β-kateniny przez Wnt3a po 24 godzinach. Inne publikacje potwierdzają to przypuszczenie, że komórki traktowane Wnt3a wykazują podwyższony poziom β-kateniny tylko w okresie 24 godzin. Wyjaśniamy nasze wyniki, które są sprzeczne z opublikowanym efektem proliferacyjnym Wnt3a faktem, że większość badań używała komórek z nadekspresją Wnt3a, Wnt3a-conditioned medium, lub komórek pozbawionych surowicy z rekombinowanym białkiem Wnt do aktywacji szlaku sygnałowego Wnt/β-aktyna.

Podsumowując, wyniki z BrdU i testów MTT są prawie nieporównywalne podczas pomiaru wpływu Wnt3a na tempo proliferacji komórek HEK293T. Różnice mogą być wyjaśnione przez różne punkty ich zastosowania, mianowicie, aktywność mitochondrialną i syntezę DNA. W celu uzyskania ostatecznych dowodów na tempo proliferacji komórkowej, interpretacja wyników jednej metody może być myląca. Dla oceny proliferacji komórek bezpośrednie liczenie komórek metodami optycznymi najlepiej odzwierciedlałoby rzeczywistą sytuację. Interesujące byłoby porównanie odpowiednich wyników z wynikami testów biochemicznych, takich jak BrdU i MTT.

Konflikt interesów

Autorzy deklarują, że nie ma konfliktu interesów w związku z publikacją tej pracy.

Podziękowania

Praca ta była wspierana finansowo przez Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych (BMBF) .

Przypisy