7.2 Architektura jąder

Lue i wsp. (2005, 2010a) podali, że dorosłe myszy 41,XXY miały małe, twarde jądra zawierające kanaliki SCO o zmniejszonej średnicy ze zwiększoną liczbą komórek Leydiga w śródmiąższu. Wyniki te są identyczne jak w przypadku alternatywnego modelu KS, myszy 41,XXY* (Lewejohann i in., 2009a; Wistuba i in., 2010, ryc. 24.2) i doskonale przypominają fenotyp jąder obserwowany u zdecydowanej większości dorosłych mężczyzn z KS (ryc. 24.3). Dodatkowo myszy 41,XXY wykazywały aberrantny wzór ekspresji receptora androgenowego (AR), nie obserwowany dotychczas w KS (Lue i in., 2005).

Ryc. 24.2. Fenotyp jąder 41,XXY* mysiego modelu KS.

(A) Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) chromosomów płciowych w jądrach interfazowych uzyskanych z próbek krwi obwodowej samców myszy szczepu B6Ei.Lt-Y*. Po lewej stronie: jądra leukocytów z 40,XY*, po prawej: jądra leukocytów z 41,XXY* samców myszy. (a) chromosomy Y* (groty strzałek) wykryte przez zieloną fluorescencyjną sondę specyficzną dla myszy; (b) chromosom X (strzałki) wykryty przez czerwoną fluorescencyjną sondę specyficzną dla myszy; (c) barwienie jądra DAPI; (d) nakładanie a-c. Należy zwrócić uwagę na dwa sygnały chromosomu X w leukocytach 41,XXY*. Jeden chromosom X jest zawsze położony w bliskim sąsiedztwie sygnału Y*. Częściowe nakładanie się tych chromosomów może być wykryte przez żółtawe zabarwienie. (B) Porównanie masy bitesticularnej między dorosłymi samcami 41,XXY* (n = 98) i ich odpowiednikami z miotu 40,XY* (n = 91). Utrata komórek rozrodczych u samców z supernumerarnym chromosomem X spowodowała znaczne zmniejszenie rozmiarów jąder. Wartości są średnie ± SEM. (C i D) Reprezentatywne mikrografy histologii nabłonka seminiferalnego jąder. (C) Mysz kontrolna 40,XY* wykazująca pełną spermatogenezę. (D) Jądro myszy 41,XXY*. Wszystkie komórki zarodkowe zostały usunięte z nabłonka nasiennego, pozostawiając jedynie zespół komórek Sertoliego. Komórki Sertoliego wykazują początek wakuolizacji. (E i F) Reprezentatywne mikrografy histologii jąder przestrzeni śródmiąższowej. (E) U myszy kontrolnych 40,XY* komórki Leydiga są normalnie rozmieszczone w przestrzeniach śródmiąższowych między ścianami kanalików. (F) Z kolei u myszy 41,XXY* liczba komórek Leydiga jest zwiększona, tworząc hiperplazję. Słupki reprezentują 20 μm. Symbole: X, komórki Sertoliego; *, różnicujące się komórki zarodkowe; #, komórki Leydiga. Barwienie: Hematoksylina-Eozyna.

Rysunek 24.3. Histologia tkanki ludzkich jąder: Porównanie normalnej spermatogenezy i zespołu SCO typowo obserwowanego u pacjentów Klinefeltera.

(A, C, i E) Reprezentatywne mikrografy histologii normalnego ludzkiego jądra wykazujące pełną spermatogenezę. (B, D, i F) Reprezentatywne mikrografy histologii jąder pacjenta KS z zespołem SCO. (A i B) przegląd przekrojów kanalików: podczas gdy tkanka kontrolna wykazuje normalną dystrybucję obszarów śródmiąższowych i kanalików, sytuacja SCO wykazuje całkowitą utratę komórek zarodkowych i hialinizację ścian kanalików. Kanaliki seminiferalne zawierają jedynie komórki Sertoliego. (C i D) Szczegóły nabłonka seminiferalnego: W kontroli obecne są wszystkie stadia komórek płciowych aż do dojrzałych plemników. Typowy dla dorosłych mężczyzn z KS brak wszystkich komórek płciowych. Komórki Sertoliego wykazują początek wakuolizacji. (E i F) Szczegóły przestrzeni śródmiąższowej. W jądrze kontrolnym komórki Leydiga są normalnie rozmieszczone w przestrzeniach śródmiąższowych pomiędzy ścianami kanalików. W przeciwieństwie do tego w tkance uzyskanej od pacjenta z KS liczba komórek Leydiga jest podwyższona, wykazując typową hiperplazję. Słupki reprezentują 20 μm. Symbole: X, komórki Sertoliego; *, różnicujące się komórki zarodkowe; #, komórki Leydiga. Barwienie: Hematoxylin-Eosin.

Komórki Sertoliego znajdują się w kanalikach nasiennych, gdzie wspierają różnicowanie spermatogenetyczne poprzez dostarczanie pożywienia i pośredniczenie w sygnalizacji endokrynologicznej (Wistuba i in., 2007). W związku z tym wszelkie zmiany w tych istotnych komórkach mają głęboki wpływ na funkcje jąder. Znaleziono dowody na wczesną apoptozę komórek Sertoliego w KS, co prowadzi do tezy, że utrata wsparcia i komunikacji pomiędzy komórkami Sertoliego i komórkami zarodkowymi może być związana ze zubożeniem komórek zarodkowych obserwowanym w tym zespole (Aksglaede i in., 2006; Wistuba i in., 2010). Komórki Sertoliego wykazują ekspresję receptora androgenowego (AR) i produkują białko wiążące androgeny oraz inhibinę. Jakiekolwiek zaburzenia w funkcjonowaniu tych komórek mogą zatem wpływać na ilość ITT w przestrzeniach śródmiąższowych, a w konsekwencji na endokrynne sprzężenie zwrotne w osi podwzgórze-przysadka-gonady. Nie udało się uzyskać empirycznie solidnych dowodów na zmienioną obecność, rozwój i/lub funkcję komórek Sertoliego, dopóki nie pojawiły się pierwsze systematyczne wyniki badań przeprowadzonych na modelach eksperymentalnych. Wyniki pierwszych badań (Lue i in., 2005) były szczególnie interesujące i ważne, ponieważ wykazały ekspresję AR w komórkach Sertoliego u dorosłych myszy kontrolnych XY, ale nie u myszy XXY. Stało się tak pomimo tego, że oba zwierzęta miały podobny wzorzec do 20 dnia po porodzie (pp), co wskazuje, że utrata ekspresji AR u myszy XXY następuje około okresu dojrzewania i sugeruje, że u tych zwierząt dojrzewanie komórek Sertoliego może być zmienione, wskazując, że mogą one wpływać lub być pod wpływem nieprawidłowego rozwoju komórek zarodkowych. Pewne uwiarygodnienie tej koncepcji zostało dostarczone przez ocenę histologiczną jąder modelu 41,XXY*, która wykazała, że liczba komórek Sertoliego jest zmniejszona w porównaniu do kontroli.

Badania przeprowadzone do tej pory dostarczają wystarczających dowodów, aby przypuszczać, że komórki Sertoliego są zmienione u mężczyzn z supernumerarnym chromosomem X. Aby zrozumieć podłoże interakcji komórek Sertoliego z komórkami zarodkowymi, apoptozy komórek Sertoliego, dojrzewania i różnicowania, potrzebne są bardziej dogłębne oceny; badania, które wymagają znacznej ilości materiału i kronikarskiego zapisu proliferacji, różnicowania i dojrzewania w rozległym okresie czasu. Badania te nie są możliwe do przeprowadzenia u ludzi. Tylko z pomocą modeli mysich można podjąć jakiekolwiek znaczące badania zmian w tej kluczowej komórce somatycznej jądra.

Donoszono, że podczas degeneracji jąder obserwowanej w KS również komórki Sertoliego degenerują się w czasie (Aksglaede i Juul, 2013; Aksglaede i in., 2006), obserwacja, która jest zgodna z danymi w naszym modelu mysim wykazującym, że liczba komórek Sertoliego jest zmieniona podczas rozwoju postnatalnego (Werler i in., 2014). Podsumowując, zmieniona fizjologia komórek Sertoliego wymaga bardziej szczegółowych analiz tego typu komórek somatycznych już podczas rozwoju prenatalnego. Rozmnażanie i różnicowanie linii zarodkowej jest w szczególności dotknięte konsekwencjami aberracji chromosomalnej. Dlatego też, główne punkty kontrolne i w konsekwencji procesy zachodz±ce specyficznie w linii zarodkowej mog± być zmienione przez chromosomaln± nierównowagę, czyli rozwój systemu pierwotnych i spermatogonialnych komórek macierzystych (PGC, SSC). Jak już wspomniano, badania in vitro wykazały, że aneuploidalne niezróżnicowane komórki zarodkowe ginęły po wyizolowaniu z gonad embrionalnych i tylko te z losowo skorygowanym kariotypem przeżywały w hodowli (Hunt i in., 1998; Mroz i in., 1999). Tak więc SSC z aberracyjnym kariotypem musiały wejść na domyślną ścieżkę podczas fazy wewnątrzmacicznej, ale najpóźniej w okresie perinatalnym. Kiedy tylko komórki zarodkowe o prawidłowym kariotypie przeżywają in vitro po ich wyizolowaniu z gonady zarodkowej, podczas gdy aberrantne komórki zarodkowe z czasem obumierają, pojawia się pytanie, dlaczego in vivo utrata komórek zarodkowych postępuje postnatalnie, jak wykazano ostatnio (Werler i in., 2014). Nawet jeśli kilka aberrantnych komórek płciowych jest nadal obecnych w perinatalnym jądrze, pewna część z tych obecnych w momencie narodzin powinna mieć prawidłowy kariotyp, a populacja komórek spermatogonialnych powinna przynajmniej pozostać stabilna, jeśli nie rozmnażać się. Z tej częściowo sprzecznej obserwacji i przyjmując najbardziej prawdopodobne założenie, że korekcja przez losowe napędzanie wyjaśnia przetrwanie zredukowanej populacji pierwotnych komórek zarodkowych (PGCs; Mroz i in., 1999; Sciurano i in., 2009), a następnie gonocytów w okresie postnatalnym, niektóre z tych, które przeżyły, mogą utracić swoje właściwości komórek macierzystych już przed urodzeniem. Najwyraźniej giną one podczas różnicowania okołomenopauzalnego, podczas gdy bardzo nieliczne mogą sporadycznie przetrwać, wykazując prawidłową ekspresję wszystkich istotnych markerów i napędzając ogniska spermatogenezy. Systematyczna ocena zmian fenotypowych podczas rozwoju in utero jest per se możliwa jedynie w modelu mysim.

Zaburzenia osi HPG, które powodują hipogonadyzm hipergonadotropowy powszechnie obserwowany u pacjentów z KS wraz z sugerowaną zwiększoną liczbą komórek Leydiga w biopsjach jąder doprowadziły do hipotezy, że funkcja i/lub dojrzewanie komórek Leydiga może być zaburzone przez chromosomalną nierównowagę płci. Komórki Leydiga są steroidogenne, stanowiąc źródło testosteronu, który jest niezbędny dla rozwoju zdrowego fenotypu męskiego i kluczowy dla kontynuacji i zakończenia normalnej spermatogenezy.

Jak w przypadku innych aspektów KS, czynnikiem ograniczającym jakiekolwiek dogłębne badania jest ograniczony dostęp do tkanki jąder. Dzięki dostępności samców myszy 41,XXY* badania nad komórkami Leydiga pochodzącymi od samców z supernumerarnym chromosomem X stały się możliwe do przeprowadzenia. Używając tego modelu potwierdziliśmy obecność hiperplazji komórek Leydiga stwierdzoną za pomocą mikroskopii stereologicznej, a także stwierdziliśmy, że poziomy ITT były podobne do tych u myszy kontrolnych (Wistuba i in., 2010). Było to zaskakujące, biorąc pod uwagę niski poziom T w surowicy krwi obserwowany zarówno u pacjentów z KS, jak i u myszy 41,XXY* (Lanfranco i in., 2004; Smyth i Bremner, 1998; Wistuba, 2010). W zgodzie z niskim poziomem krążących T było odkrycie, że gdy komórki Leydiga z modelu KS zostały wyjęte ze środowiska jąder, wyhodowane in vitro i znormalizowane pod względem liczby komórek, ich funkcja była rzeczywiście zmieniona. Jednakże, nie była ona upośledzona, jak można by sądzić, ale nadaktywna. Gdy zbadano profile ekspresji mRNA genów markerowych Tsp2 (trombospondin 2: białko matrykularne pochodzenia płodowego, które ulega ekspresji głównie w młodocianych komórkach Leydiga), Rlf (relaxin-like factor: marker dojrzałych komórek Leydiga), Est (estrogen sulfotransferase: marker dojrzałych komórek Leydiga), i LHR (receptor LH: badany pod kątem korelacji z eksperymentami stymulującymi komórki Leydiga, patrz dalej) zostały oznaczone, wyizolowane komórki Leydiga XXY* wykazały dojrzały profil ekspresji mRNA i znacząco wyższą aktywność transkrypcyjną w porównaniu do kontroli (Wistuba i in., 2010; O’Shaughnessy i wsp., 2002). Analiza ekspresji genów wykazała ogólny wzrost ekspresji genów specyficznych dla komórek Leydiga XXY*, przy czym ekspresja Est była około 20-krotnie, Rlf 8-krotnie, Tsp2 5-krotnie, a LHR 3-krotnie wyższa niż w komórkach Leydiga typu dzikiego. Stymulacja komórek Leydiga XXY* in vitro wykazała obecność dojrzałego receptora LH, który reagował nawet silniej na stymulację ludzką gonadotropiną kosmówkową (hCG, substytut LH) niż komórki z grupy kontrolnej. Co więcej, aktywność steroidogenna komórek Leydiga XXY* była podwyższona, w tym sensie, że więcej T na komórkę było produkowane w odpowiedzi na hCG.

Te ekscytujące wyniki nie tylko prowadzą do nowej koncepcji pochodzenia hipogonadyzmu hipergonadotropowego, ale także pokazują ważność modelu mysiego KS, z jego bezpośrednimi konsekwencjami przekładającymi się na nasze zrozumienie pacjentów z KS. Wyniki uzyskane na modelu mysim wskazują, że funkcja komórek Leydiga nie jest zaburzona per se, co sugeruje, że inne czynniki w środowisku jąder są odpowiedzialne za zaburzoną endokrynologię androgenową obserwowaną u pacjentów z KS. Zwłaszcza, że również u pacjentów mogliśmy potwierdzić, że wartości ITT nie różniły się od kontroli (Tüttelmann i in., 2014). Prawdopodobnie zmieniona architektura jąder związana z tym zaburzeniem może utrudniać transport endokryn do krążenia, co zostało poparte odkryciem, że pacjenci z KS mają również zmniejszoną średnicę naczyń krwionośnych (Foresta i in., 2012). Biorąc to pod uwagę, staraliśmy się znaleźć możliwe „naczyniowe” wyjaśnienie braku uwalniania T do krwiobiegu jąder. W biopsjach jąder od pacjentów wiarygodna analiza naczyń nie jest jednak możliwa z powodu błędu wynikającego z techniki dysekcji wymagającej unikania większych naczyń krwionośnych, aby zapobiec krwawieniu. W związku z tym oceniano budowę naczyń krwionośnych w całych wycinkach jąder pochodzących od dorosłych samców myszy 41,XXY* i 40,XY*. Rzeczywiście, stosunek naczyń krwionośnych do powierzchni jądra, korygujący mniejsze jądra myszy XXY*, był znacząco niższy u tych myszy w porównaniu do kontroli XY*. Podsumowując, produkcja T w jądrach nie wydaje się być upośledzona u mężczyzn z KS. Dane z modelu mysiego pozwalają spekulować, że zmniejszone zaopatrzenie naczyniowe może być związane z mniejszym uwalnianiem T do krwiobiegu.