Isolation, Culture, and Functional Characterization of Human Embrionalne komórki macierzyste: Current Trends and Challenges
Abstract
Human embryonic stem cells (hESCs) have great potential for the treatment of various degenerative diseases. Pluripotencjalne hESC mają wielką zdolność do nieograniczonej samoodnowy w hodowli i różnicowania się we wszystkie typy komórek w organizmie. Droga badań nad hESC nie jest jednak tak gładka, ponieważ napotkały one na kilka wyzwań, które ograniczają się nie tylko do tworzenia guzów i immunoregulacji, ale także do aspektów społecznych, etycznych i politycznych. Izolacja hESC z ludzkiego embrionu jest uważana za wysoce kontrowersyjną, ponieważ wymaga zniszczenia ludzkiego embrionu. Kwestia ta była przedmiotem debat i dyskusji zarówno na platformach publicznych, jak i rządowych, co doprowadziło do zakazu prowadzenia badań nad hESC w wielu krajach na całym świecie. Zakaz ten negatywnie wpłynął na postęp badań nad hESC, ponieważ wiele rządów federalnych na całym świecie wstrzymało finansowanie badań. Następnie niektóre kraje zniosły zakaz i zezwoliły na finansowanie badań nad hESC, ale szkoda została już wyrządzona na postępie badań. W tych niesprzyjających warunkach udało się osiągnąć pewien postęp w izolacji, hodowli i charakterystyce ludzkich zarodkowych komórek macierzystych przy użyciu różnych strategii. W tym przeglądzie podsumowaliśmy różne strategie stosowane w celu skutecznej izolacji, hodowli i charakterystyki ludzkich zarodkowych komórek macierzystych. Wreszcie, hESCs mają wielką obietnicę dla zastosowań klinicznych z odpowiednimi strategiami minimalizującymi tworzenie teratoma i immunorejection oraz lepszymi strategiami transplantacji komórek.
1. Embryonic Stem Cells: Early Discovery and Isolation Procedure
Embryonic stem cells (ESCs) were first isolated from mouse embryos in 1981, and the word „embryonic stem cell” was first coined by Gail R. Martin. Niemniej jednak, świat dowiedział się o ESCs dzięki przełomowemu odkryciu w 1998 roku, kiedy to Thomson i jego zespół po raz pierwszy pokazali technikę izolacji hESCs z ludzkich embrionów. Następnie naukowcy wykazali, że hESC mają zdolność do różnicowania się we wszystkie komórki ciała, w tym komórki beta wysepek Langerhansa, komórki nerwowe, kardiomiocyty i komórki podobne do hepatocytów. Pluripotencjalne możliwości hESCs dały nadzieję milionom pacjentów cierpiących na cukrzycę, chorobę Parkinsona, choroby sercowo-naczyniowe i choroby wątroby. Biorąc pod uwagę ogromny potencjał terapeutyczny hESC, na całym świecie wygenerowano wiele linii hESC. Jednym z wyzwań związanych z hESCs była metoda izolacji komórek macierzystych z ludzkiego embrionu, ponieważ hESCs można uzyskać jedynie z wewnętrznej masy komórkowej (ICM) ludzkich embrionów. Naukowcy donieśli, że ICM można uzyskać zarówno ze świeżych, jak i zamrożonych ludzkich embrionów. Następnie opracowano kilka metod izolacji ICM z pojedynczego ludzkiego zarodka, które obejmują mechaniczną dysekcję, gdzie ICM jest izolowana przez nacisk mechaniczny . ICM można również wyizolować za pomocą dysekcji laserowej oraz za pomocą procedur immunochirurgii . Istnieją różne korzyści z zastosowania procedury immunochirurgii do izolacji ICM, ale to również niesie ze sobą pewne wady. Na przykład, procedura immunochirurgii wymaga zastosowania pożywek hodowlanych zawierających surowicę świnki morskiej; w związku z tym stosowanie surowicy zwierzęcej sprawia, że technika immunochirurgii nie nadaje się do generowania linii hESC klasy klinicznej. W innej metodzie linie hESC można wyizolować z ICM poprzez mikrodyssekcję ludzkich blastocyst przy użyciu cienkich igieł. Biopsja wspomagana laserem jest również najbardziej obiecującą techniką do izolacji ICM bez użycia ksenonów. Po wyizolowaniu ICM, komórki macierzyste są hodowane w celu wygenerowania ESCs przy użyciu warstw odżywczych, macierzy zewnątrzkomórkowych, białek, peptydów i polimerów syntetycznych. Zalety i wady różnych metod izolacji ICM są podsumowane w tabeli 1.
|
|||||||||||||||||||||||||||||
Izolacja ICM wymaga zniszczenia ludzkich embrionów, co wzbudziło poważne obawy etyczne. Aby rozwiązać ten problem etyczny, badacze zademonstrowali alternatywne podejście do izolacji hESCs z pojedynczego blastomeru bez zabijania lub niszczenia ludzkiego embrionu. Na przykład, podczas preimplantacyjnych badań genetycznych, biopsja zarodka zawierająca pojedynczy blastomer może być uzyskana od pacjentów (; Klimanskaya i in., 2009). Odnotowano, że z jednej biopsji blastomerów udało się uzyskać 5 linii hESC. Sukces w uzyskaniu dobrej jakości hESCs zależy od jakości blastocyst oraz procedur izolacyjnych i warunków hodowli. Odnotowano, że 2 linie hESC uzyskano z 4 blastocyst, podczas gdy z 13 blastocyst można było wyizolować tylko 3 linie hESC, a w niektórych przypadkach tylko 3 linie hESC można było wyizolować z 58 blastocyst . Te różnice w izolacji linii hESC z różnych blastocyst wynikają głównie z jakości zarodków, a także zależą od metody izolacji zarodków i protokołów hodowli . Na przykład, jeśli zarodek uzyskuje się metodą zapłodnienia in vitro, istnieje duże prawdopodobieństwo, że zarodki będą charakteryzowały się wysoką częstością występowania postzygotycznych nieprawidłowości chromosomalnych, co może ostatecznie dać niską jakość hESCs .
W myszach, pluripotencjalne komórki macierzyste można również uzyskać z epiblastu zarodków w fazie poimplantacyjnej, powszechnie znanych jako komórki macierzyste epiblastu. Te pluripotencjalne komórki macierzyste wykazują cechy primed i są wysoce zależne od aktywacji szlaków sygnalizacyjnych FGF i aktywiny dla ich samoodnawiania. W związku z tym u myszy zdefiniowano trzy odrębne stany pluripotencji, mianowicie naiwny, pierwotny i gruntowy stan pluripotencji
2. Hodowla hESCs z komórkami podścieliska lub bez nich
Po pobraniu blastomerów są one zwykle hodowane razem z rodzicielskim zarodkiem z biopsji w podłożu zawierającym fibronektynę i lamininę. Dodatek lamininy w podłożu hodowlanym jest istotny dla tworzenia się agregatów przypominających embrionalne komórki macierzyste (ESC-). Ponadto, istnieją doniesienia, które sugerują, że dodatek pożywki bez surowicy i czynników wzrostu fibroblastów zwiększa proliferację komórek macierzystych i zapobiega ich różnicowaniu. W skrócie opisaliśmy różne warunki hodowli, które były stosowane w celu poprawy zarówno jakości, jak i ilości generowanych hESCs.
2.1. Komórki podścieliska mysiego do hodowli hESC
Komórki mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) lub komórki podścieliska mysiego są uważane za najważniejsze dla hESC, ponieważ MEF zapewniają korzystne warunki do wzrostu i ekspansji hESC (rysunek 1). Stwierdzono, że MEF są bardzo ważne dla pomyślnego generowania linii hESC. Ponadto wszystkie wczesne linie hESC były hodowane w podłożu zawierającym czynniki wzrostu i cytokiny wydzielane przez komórki MEF, a te czynniki wzrostu i cytokiny są niezbędne do utrzymania pluripotencji komórek macierzystych. Ponieważ MEF pochodzi od myszy, stanowi to poważny problem etyczny lub zdrowotny dla hESCs. Co więcej, wykorzystanie komórek pochodzenia zwierzęcego może spowodować przeniesienie patogenów zakaźnych pochodzących od zwierząt na hESC, co sprawia, że nie nadają się one do wykorzystania u ludzi. Stwierdzono, że komórki MEF zawierają cząsteczki wirusów, które są zdolne do zakażania hESC podczas hodowli. Ponadto niektórzy badacze stosowali surowicę bydlęcą do hodowli hESC, ale stosowanie surowicy pochodzenia zwierzęcego może powodować przenoszenie prionów i wirusów zwierzęcych w hodowli zarodkowych komórek macierzystych. Stwierdzono, że komórki i surowice pochodzenia zwierzęcego mogą przenosić wirusy i inne patogeny do zarodkowych komórek macierzystych poprzez interakcję komórka-komórka podczas hodowli in vitro . Co więcej, te patogenne cząsteczki mogą zanieczyścić całą hodowlę hESC. W przypadku, gdy hESC są zanieczyszczone takimi patogenami, problem zanieczyszczenia może utrzymywać się nawet wtedy, gdy hESC zostaną później przeniesione do hodowli bez udziału zwierząt. Innym problemem związanym z mysimi komórkami macierzystymi oraz surowicą/białkami pochodzenia zwierzęcego jest to, że zawierają one również kwas sialowy pochodzenia innego niż ludzkie (Neu5GC), który również może stanowić poważny problem związany z zanieczyszczeniem hESC. Na przykład, stwierdzono, że kwas sialowy pochodzenia zwierzęcego metabolicznie przedostawał się na powierzchnię komórek hESCs i zanieczyszczał embrionalne komórki macierzyste.
2.2. Nonanimal Feeder Cells to Grow hESCs
Aby uniknąć produktów pochodzenia zwierzęcego i zanieczyszczeń międzygatunkowych, badacze opracowali podłoża hodowlane, które nie zawierają składników pochodzenia zwierzęcego, a jednocześnie wspomagają wzrost i ekspansję zarodkowych komórek macierzystych. Stwierdzono, że komórki ludzkie mogą być wykorzystywane do hodowli hESC; na przykład, ludzkie komórki jajowodu, napletek płodu, mięśnie i skóra płodu, transgeniczne komórki zrębu wątroby płodu, szpik kostny, pępowina, komórki łożyska i komórki endometrium zostały zgłoszone do wspierania hodowli i ekspansji komórek macierzystych. Wśród tych ludzkich komórek, ludzkie komórki zrębu pępowiny oferują lepsze źródło komórek zasilających, które mogą być również zbierane przy użyciu nieinwazyjnej metody, podczas gdy użycie warstw zasilających pochodzących z napletka, płodu lub szpiku kostnego budzi pewne obawy etyczne.
Poza komórkami zasilającymi, ludzkie linie komórkowe również stanowią alternatywę dla komórek zasilających myszy. Ostatnio kilka linii hESC zostało wyprowadzonych i rozmnożonych przy użyciu komercyjnie dostępnej linii fibroblastów ludzkiego napletka. Komórki endometrialne również okazały się skuteczne w hodowli in vitro komórek macierzystych. Innym sposobem na wyeliminowanie ryzyka skażenia patogenami zwierzęcymi jest zastosowanie warstw odżywczych pochodzących z ludzkiej linii komórek macierzystych. Wykazano, że podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) jest endogennie produkowany przez ludzkie komórki podporowe stosowane w hodowli hESC (; Liu i in., 2014). Te komórki feederowe wydzielają również TGFβ i aktywinę A, które są zaangażowane w utrzymanie pluripotencji ICM . Pomimo posiadania różnych korzyści, hodowla hESC zależna od komórek podajnikowych ma wiele ograniczeń; na przykład utrzymanie warstw podajnikowych jest pracochłonne ze zbyt dużą zmiennością między populacjami komórek podajnikowych. Ta rozbieżność może negatywnie wpłynąć na roszczenie hESC do zastosowania u ludzi.
2.3. Hodowla bez podawania komórek macierzystych w celu wyhodowania ludzkich zarodkowych komórek macierzystych
Ponieważ zarówno zwierzęce, jak i ludzkie komórki macierzyste mają ograniczenia, naukowcy zbadali i z powodzeniem zaprojektowali chemicznie zdefiniowane pożywki do hodowli ludzkich zarodkowych komórek macierzystych, a najlepszą cechą zdefiniowanych pożywek jest to, że nie zawierają one żadnych komórek macierzystych. Jednym z pierwszych podejść wypróbowanych w celu uzyskania podłoży do hodowli bez podłoży było zastosowanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej wraz z czynnikami wzrostu w celu stworzenia warunków hodowli in vitro umożliwiających proliferację i odnowę komórek macierzystych (rysunek 2). Spośród tych białek, Matrigel był najczęściej używany w połączeniu z czynnikami wzrostu lub podłożem kondycjonowanym do hodowli hESCs. Pomimo różnych korzyści, okazało się, że Matrigel ma zbyt wiele różnic w swoim składzie, co stwarzało problemy w hodowli hESC. Stosowanie Matrigelu wiąże się również z problemami klinicznymi, ponieważ kilka partii Matrigelu zostało zgłoszonych jako zanieczyszczone jednoniciowym wirusem RNA myszy – wirusem podwyższającym poziom dehydrogenazy mleczanowej . Oprócz Matrigelu, fibronektyna, laminina i kolagen typu IV są również dobrymi kandydatami do hodowli wolnych od ksenoestrogenów hESC, a komórki mogą rosnąć nawet do 20 pasaży. Referenci donieśli, że ICM pochodzący z łożyska ludzkiego był wykorzystywany do hodowli hESCs, i stwierdzili silną stabilność genetyczną przez 40 pasaży. Co więcej, hESC hodowano również w podłożu wolnym od ksenonów do 80 pasaży
Niewątpliwie zastosowanie chemicznie zdefiniowanych mediów wraz z białkami znacznie poprawiło hodowlę hESCs. Dodatkowo, w celu usprawnienia hodowli hESC w warunkach wolnych od ksenonów, stosowano również różne białka i białka rekombinowane. Wśród nich znalazły się E-kadheryna, E-kadheryna/lamina 521 oraz inhibitory kinaz wraz z bFGF, które są znane z tego, że powodują silną proliferację komórek macierzystych w warunkach wolnych od ksenonu. Syntetycznie zaprojektowana powierzchnia łóżka została również wykorzystana do stymulacji hodowli komórek macierzystych (Melkoumian i in., 2010); na przykład Corning Synthemax Surface, syntetyczna powierzchnia akrylowa sprzężona z vitronektyną, wykazano, że zwiększa nie tylko kolonie hESC, ale także ekspansję komórek macierzystych (Kawase i in., 2014). Wu i wsp. opisali niedawno zastosowanie nowego materiału syntetycznego wyizolowanego z białek jedwabiu pajęczego jako odpowiedniego podłoża do stymulacji hodowli hESC (Wu i wsp., 2014). Opisano również liczne powierzchnie syntetyczne na bazie polimerów, które wspierają wzrost i ekspansję linii hESC (Melkoumian i in., 2010; Brafman i in., 2010; Villa-Diazet i in., 2013). Lista różnych substancji chemicznych stosowanych do wspomagania hodowli hESCs została przedstawiona w Tabeli 2.
|
|||||||||||||||||||||||||||
3. Potencjał wieloliniowości hESC
Jedną z najważniejszych cech hESC jest możliwość różnicowania się we wszystkie trzy linie rozwojowe: ektodermę, mezodermę i endodermę (rysunek 3). Ponieważ hESC są pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi, mają unikalną zdolność do różnicowania się we wszystkie rodzaje komórek ciała; na przykład, hESC mogą być różnicowane w neurony, komórki serca, hepatocyty i komórki mięśniowe. Stwierdzono, że hESC najpierw tworzą ciała embrionalne, które są zbudowane z trzech warstw zarodkowych. Te ciała embrionalne są tworzone przez pluripotencjalne hESC hodowane w kulturze trójwymiarowej (3D) i wykazujące ekspresję markerów genetycznych dla wszystkich trzech warstw zarodkowych. Pluripotencjalne hESC mają ogromną zdolność do różnicowania się (Tabela 3) w komórki nadnerczy i keratynocyty, komórki produkujące insulinę, komórki neuronalne, komórki mięśnia sercowego, komórki wątroby oraz organoidy przypominające wysepki. Niektóre czynniki wzrostu, takie jak kwas retinowy i czynniki wzrostu nerwów są wykorzystywane do indukowania hESCs do różnicowania się w funkcjonalne neurony. Ponadto, niektóre czynniki wzrostu specyficzne dla danej linii rozwojowej są wykorzystywane do różnicowania w kardiomiocyty, hepatocyty, mięśnie szkieletowe, komórki trzustki i komórki nerek. Te zróżnicowane komórki są również testowane w celu zbadania ich funkcjonalności zarówno w warunkach in vitro jak i in vivo. Ten wielopostaciowy potencjał hESCs okazał się kluczowy dla terapii opartej na komórkach w leczeniu różnych chorób degeneracyjnych. O ile łatwo jest różnicować różne typy komórek z hESCs, o tyle trudno jest uzyskać dużą liczbę zróżnicowanych, dojrzałych komórek do zastosowań terapeutycznych. Aby uzyskać duże, dojrzałe i funkcjonalne zróżnicowane komórki, pożywki hodowlane powinny zawierać czynniki wzrostu specyficzne dla danej linii rozwojowej. Ważne jest również generowanie dużych ilości komórek z hESCs, ponieważ są one wymagane do przeszczepu komórek, a to można osiągnąć poprzez hodowlę hESCs i zróżnicowanych komórek w bioreaktorze w kontrolowanych warunkach.
|
||||||||||||||||||||||
4. Testowanie hESCs przy użyciu modeli In Vitro i In Vivo
Po udanym zróżnicowaniu hESCs w różne typy komórek, kolejnym logicznym krokiem jest zbadanie, czy uzyskane zróżnicowane komórki mają jakąś funkcjonalność, czy nie. Funkcjonalność komórek macierzystych i zróżnicowanych komórek prekursorowych lub dojrzałych była szeroko badana zarówno w warunkach in vitro jak i in vivo. Funkcjonalność zróżnicowanych neuronów, kardiomiocytów, hepatocytów i innych typów komórek testowano w różnych modelach zwierzęcych. Stwierdzono, że transplantacja neuronów w zwierzęcym modelu choroby Parkinsona spowodowała częściowe przywrócenie funkcji. Przeszczepianie hESCs i ich zróżnicowanych komórek testowano w zwierzęcych modelach chorób układu krążenia, udaru mózgu, cukrzycy i uszkodzenia rdzenia kręgowego. Wśród zwierząt, małe gryzonie, takie jak szczury i myszy były gatunkiem z wyboru do badania transplantacji komórek. Ponadto, małe gryzonie są łatwo dostępne i mogą być łatwo manipulowane zarówno chirurgicznie jak i genetycznie. Pomimo wielu zalet małych gryzoni, zdolność eksperymentów na myszach/szczurach do przewidywania skuteczności terapii opartej na komórkach macierzystych pozostaje sporna, ponieważ wiele modeli myszy/szczurów nie reprezentuje fenotypów ludzkich chorób. Aby przezwyciężyć ten problem, badacze zaczęli pracować na dużych zwierzętach, których anatomia i fizjologia jest zbliżona do ludzkiej. Wśród dużych zwierząt, psy, kozy, owce i naczelne są uważane za lepsze modele niż myszy/szczury do testowania komórek macierzystych. Jedną z głównych zalet stosowania dużych zwierząt jest ich dłuższa żywotność, a wiele parametrów anatomicznych, fizjologicznych jest znacznie bliższych człowiekowi. Chociaż te modele zwierzęce wykazują skuteczne dostarczanie komórek macierzystych do tkanek gospodarza, nadal nie osiągnięto pełnej funkcjonalnej i behawioralnej regeneracji. Konieczne są dalsze badania w celu opracowania modeli zwierzęcych, które są zbliżone do chorób ludzkich.
Mimo postępu w badaniach nad hESC, jednym z ważnych wyzwań terapii komórkowej opartej na hESC jest allogeniczne odrzucenie immunologiczne komórek pochodzących z hESC przez biorców. Stwierdzono, że w ciągu tygodnia wszystkie przeszczepione komórki macierzyste umierają z powodu silnej odpowiedzi immunologicznej gospodarza generowanej u zwierząt. Aby zatrzymać śmierć przeszczepionych komórek macierzystych, zwierzętom wstrzykiwano immunosupresory, aby stłumić odporność wywołaną przeszczepem komórek macierzystych. Co zaskakujące, kiedy zwierzętom podawano immunosupresory lub leki takie jak takrolimus i sirolimus, komórki macierzyste mogły przetrwać tylko 28 dni, a następnie zaczęły umierać. Chociaż nie znamy przyczyny tego zjawiska, jedną z nich może być brak zrozumienia interakcji komórka-komórka. Ważne jest, aby testować hESCs lub zróżnicowane komórki w warunkach in vitro przed testami na zwierzętach. Modele in vitro zapewniają lepsze możliwości badania interakcji komórka-komórka, migracji komórek lub integracji komórek w bardzo szczegółowy sposób, co być może jest bardzo trudne do zbadania u zwierząt. Problem ten może zostać złagodzony dzięki niedawnemu przełomowi w technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs) poprzez jądrowe przeprogramowanie specyficznych dla pacjenta komórek somatycznych za pomocą zdefiniowanych czynników, które mogą stać się odnawialnym źródłem autologicznych komórek do terapii komórkowej. Jedną z kluczowych zalet iPSC dla terapii komórkowej jest to, że specyficzne dla pacjenta iPSC są autologiczne, a zatem zakłada się, że uzyskane z nich komórki mogą być przeszczepiane temu samemu pacjentowi bez obaw o odrzucenie immunologiczne. Jednak ostatnie badania ujawniające nieprawidłową epigenetykę, stabilność genomową i immunogenność iPSC wzbudziły obawy co do bezpieczeństwa terapii opartej na iPSC .
5. Zastosowania terapeutyczne hESCs
Jako że hESCs niosą ze sobą wiele obietnic dla pacjentów cierpiących na choroby degeneracyjne, podjęto różne próby zbadania ich potencjału terapeutycznego u ludzi. Głównym celem terapii opartej na komórkach macierzystych jest przywrócenie lub naprawa utraconych lub uszkodzonych komórek ciała lub tkanek. Aby hESC nadawały się do zastosowań klinicznych, uzyskane komórki macierzyste muszą być produkowane zgodnie z wytycznymi United States Food Drug Administration (USFDA), Current Good Manufacturing Practices (cGMP) oraz Guidelines for the Clinical Transplantation of Stem Cells, odpowiednio. Chemikalia, odczynniki, komórki oraz maszyny i oprzyrządowanie stosowane w hodowli komórek macierzystych powinny być poddawane kontroli bezpieczeństwa i higieny, a wszystkie procesy produkcyjne muszą być monitorowane i dokumentowane zgodnie z wytycznymi cGMP. Jeśli przeanalizujemy, jak wiele obecnie stosowanych linii hESC spełnia wytyczne cGMP, okaże się, że wiele z nich nie spełnia wytycznych cGMP, ponieważ wiele hESC jest narażonych na kontakt z immunogennymi lub patogennymi składnikami zwierzęcymi na etapie ich izolacji i rozmnażania. Innym powodem niespełnienia wytycznych cGMP jest fakt, że większość prac nad hodowlami hESC była prowadzona w laboratoriach uniwersyteckich, a wiele z tych laboratoriów badawczych nie spełnia wytycznych cGMP. Do dziś tylko kilku badaczy może być w stanie produkować linie hESC zgodnie z wytycznymi cGMP .
Rozważając potencjalne korzyści handlowe z hESC, kilka firm biotechnologicznych były również zaangażowane w finansowanie badań komórek macierzystych z jedynym celem komercjalizacji produktów komórek macierzystych. Firmy te rozpoczęły produkcję hESCs w warunkach cGMP i rozpoczęły testowanie komórek macierzystych w warunkach klinicznych. W 2009 r. Geron Corporation (firma biotechnologiczna z siedzibą w Kalifornii) złożyła wniosek do FDA o rozpoczęcie pierwszego badania klinicznego z wykorzystaniem komórek pochodzących z hESC. Badanie kliniczne rozpoczęto w październiku 2010 roku, gdzie 3 pacjentom cierpiącym na uraz kręgosłupa wstrzyknięto 1,5 miliona komórek prekursorowych oligodendrocytów pochodzących z hESCs. Badanie zostało nieoczekiwanie przerwane i nie znamy przyczyny, prawdopodobnie dlatego, że wstępne wyniki badania wykazały, że komórki pochodzące z hESCs nie spowodowały żadnej zauważalnej poprawy w uszkodzeniu rdzenia kręgowego. Ponadto, FDA zatwierdziła również inną próbę zastosowania hESCs w chorobie zwyrodnieniowej plamki żółtej. Inna firma, Advanced Cell Technology z siedzibą w Marlborough, Massachusetts, rozpoczęła badania kliniczne z wykorzystaniem hESCs. Komórki były wstrzykiwane pacjentom cierpiącym na dystrofię mięśniową Stargardta oraz na związane z wiekiem suche zwyrodnienie plamki żółtej. Użyto komórek nabłonka pigmentu siatkówki (RPE) pochodzących z hESCs. W badaniu komórki RPE podawano pacjentom, a po 4 miesiącach po przeszczepie stwierdzono, że pacjenci wykazywali niewielką poprawę funkcji wzrokowych bez oznak odrzucenia immunologicznego lub jakichkolwiek oznak tworzenia się teratoma. Komórki macierzyste były również testowane u pacjentów z cukrzycą typu I, gdzie podawano pacjentom komórki prekursorowe trzustki .
6. Podsumowanie i wnioski
Ludzkie embrionalne komórki macierzyste mają duży potencjał terapeutyczny w leczeniu różnych chorób, takich jak nowotwory, choroba Parkinsona, choroba Alzheimera i cukrzyca. Zarówno badania in vitro jak i in vivo sugerują, że wciąż istnieje nadzieja, że w przyszłości embrionalne komórki macierzyste dostarczą leków na różne choroby. Sukces terapii opartej na komórkach macierzystych zależy jednak od dostępności dojrzałych i funkcjonalnych komórek. Aby uzyskać dojrzałe i funkcjonalne komórki, lepiej byłoby, gdyby komórki macierzyste były hodowane w warunkach kultury trójwymiarowej (3D). Większość linii hESC uzyskiwana jest w warunkach hodowli dwuwymiarowej (2D). Istnieje kilka ograniczeń stosowania hodowli 2D, ponieważ hESC hodowane w warunkach 2D nie reprezentują komórek ludzkiego ciała, a większość hodowanych w 2D hESC obumiera natychmiast po przeszczepieniu komórek; te komórki, które przeżyły, nadal nie są w stanie naprawić tkanek organizmu. Problem ten można rozwiązać, hodując hESC w warunkach 3D, gdzie komórki mogą rosnąć w trzech kierunkach, a szanse na ich przeżycie po transplantacji będą większe. Innym ważnym punktem, który należy rozważyć w celu osiągnięcia sukcesu w terapii opartej na komórkach macierzystych, jest rygorystyczna ocena komórek pochodzących z komórek macierzystych w modelach zwierzęcych przed przeprowadzeniem testów na ludziach. Integracja komórka-komórka, komunikacja komórka-komórka, migracja komórek i funkcjonalność komórek muszą być dokładnie ocenione w modelach zwierzęcych przy użyciu zarówno krótkoterminowych jak i długoterminowych metod badawczych. Problem związany z powstawaniem urazów i odrzucaniem immunologicznym musi być również rozwiązany poprzez opracowanie linii komórek macierzystych, które nie powodują odrzucania immunologicznego i nie tworzą guzów po transplantacji. Można to osiągnąć poprzez wyciszenie szlaków genowych/molekularnych, które wywołują odpowiednio powstawanie guzów i immunoregresję. Ponadto, terapia oparta na komórkach wymaga również wielu dojrzałych komórek, a wysiłki powinny być skierowane na izolację dużej ilości komórek macierzystych i ich prekursorów poprzez wprowadzenie nowego, innowacyjnego podejścia i metodologii. Wreszcie, ludzkie embrionalne komórki macierzyste nadal mają wielką obietnicę dla leczenia różnych chorób zwyrodnieniowych, jak również zastosowań diagnostycznych.
Konflikty interesów
Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów.
Wkład autorów
Ten manuskrypt został zatwierdzony przez wszystkich autorów do przedłożenia.
Podziękowania
Autorzy są wdzięczni całemu kierownictwu Institute for Research and Medical Consultations (IMRC), Imam Abdulrahman Bin Faisal University, Dammam, Królestwo Arabii Saudyjskiej, za wsparcie i zachętę.