Global bla KPC-E. coli są zróżnicowane, nawet w obrębie najbardziej rozpowszechnionego ST, ST131, z dowodami na lokalną transmisję

45 izolatów uzyskano z 21 miast w 11 krajach na czterech kontynentach (2010-2013; poprzednie wyniki typowania laboratoryjnego podsumowane w Tabeli S1). Jeden izolat był bla KPC-ujemny w sekwencjonowaniu całego genomu (WGS; ecol_252), potencjalnie utracił bla KPC podczas przechowywania lub subkultury w okresie między pierwotnym typowaniem a późniejszą ekstrakcją DNA i przygotowaniem do WGS. W przypadku jednego izolatu dane WGS były niezgodne z wynikami typowania laboratoryjnego (ecol_451), co prawdopodobnie stanowiło pomyłkę laboratoryjną; ecol_252 i ecol_451 zostały zatem wyłączone z dalszych analiz. Pozostałe 43 izolaty zostały z powodzeniem zsekwencjonowane (metryki jakości patrz Tabela S1). Wśród tych 43 izolatów reprezentowanych było dwadzieścia jeden różnych ST E. coli (Tabela 1; przewidywane in silico na podstawie WGS), w tym: ST131 , ST410 , ST38 , ST10, ST69 (pozostałe izolaty singleton STs).

Z 16 053 anotowanych otwartych ramek odczytu (ORF) zidentyfikowanych we wszystkich izolatach KPC-E. coli, tylko 2 950 (18,4%) było wspólnych we wszystkich izolatach („rdzeń”), a dalsze 222 (1,4%) w 95- < 100% izolatów („miękki rdzeń „27). Na poziomie nukleotydów w genomie rdzeniowym występowały 213 352 warianty pojedynczych nukleotydów (SNVs), co jest zgodne z wcześniej obserwowaną różnorodnością gatunkową28. Profile genów oporności również znacznie różniły się między szczepami, niektóre z nich posiadały kilka mechanizmów oporności na beta-laktamy, aminoglikozydy, tetracykliny i fluorochinolony (np. ecol_224), a inne zawierały tylko bla KPC (np. ecol_584; ryc. 1). Dla 16 szczepów KPC-ST131, 4,071/7,910 (51%) ORF były rdzeniowe, z 6,778 SNV w całym genomie rdzeniowym tych izolatów, ponownie zgodne z poprzednimi globalnymi badaniami różnorodności ST13123, 24 (Figura S1). Genomy akcesoryjne były wysoce zgodne dla niektórych (np. ecol_356/ecol_276/ecol_875), ale nie wszystkich (np. ecol_AZ159/ecol_244) izolatów, które były blisko spokrewnione w swoich genomach rdzeniowych, wspierając wysoce zmienną dynamikę ewolucyjną między genomami rdzeniowymi i akcesoryjnymi (ryc. 1). Geograficzna dystrybucja izolatów blisko spokrewnionych zarówno w genomie rdzeniowym jak i akcesoryjnym przemawia za lokalną (np. ecol_AZ166, ecol_AZ167 ) transmisją poszczególnych szczepów KPC-E. coli. Homologia genetycznych motywów flankujących wokół genów bla KPC w tych blisko spokrewnionych parach izolatów również byłaby zgodna z tą hipotezą, a mniej zgodna z wielokrotnymi przypadkami nabycia bla KPC w tym samym tle genetycznym, zwłaszcza biorąc pod uwagę różnorodność sekwencji flankujących bla KPC obserwowaną w pozostałej części zbioru danych (patrz poniżej).

Fylogeneza KPC-Escherichia coli zidentyfikowanych z globalnych schematów nadzoru oporności na karbapenemy, 2008-2013. Panele po prawej stronie filogenezy reprezentują wspólne mechanizmy genów oporności (pełne szczegóły typowania genów oporności w Tabeli S2), elementy genomu rdzeniowego i akcesoryjnego. Dla panelu genomu akcesoryjnego, kolor niebieski reprezentuje regiony z adnotacjami, które są obecne, a biały te, które są nieobecne.

Geny bla KPC wydają się obecnie ograniczone do kontekstów plazmidowych u E. coli, ale mogą istnieć w wielu kopiach na pojedynczych strukturach plazmidowych lub w plazmidach o wysokiej liczbie kopii

Trzydzieści cztery izolaty (80%) zawierały bla KPC-2, a dziewięć izolatów (20%) bla KPC-3. Chromosomalna integracja bla KPC została opisana u innych pałeczek Enterobacteriaceae, Pseudomonas i Acinetobacter spp. ale pozostaje rzadka5, 29, 30. Nie było dowodów na chromosomalną integrację bla KPC ani w 18 strukturach chromosomalnych zrekonstruowanych na podstawie sekwencjonowania długich odczytów, ani na podstawie przeglądu adnotacji w kontigach zawierających bla KPC (pochodzących z asemblacji de novo Illumina) dla pozostałych 25 izolatów. Allele bla KPC nie były segregowane według ST.

Oszacowania liczby kopii bla KPC na chromosom bakteryjny wahały się między <1 (ecol_879, ecol_881) a 55 (ecol_AZ152). W dziewięciu przypadkach szacunek ten wynosił ≥10 kopii bla KPC na chromosom bakteryjny (ecol_276, ecol_356, ecol_867, ecol_869, ecol_870, ecol_875, ecol_AZ150, ecol_AZ152, ecol_AZ159, Tabela S2). Sześć z tych izolatów zawierało bla KPC w kontekście plazmidowym podobnym do col, w dwóch przypadkach typ rep plazmidu był nieznany, a w jednym przypadku był to replikon IncN. Liczba kopii plazmidu jest związana z wyższym poziomem oporności na antybiotyki, jeśli odpowiedni gen jest zlokalizowany na jednostce o wysokiej liczbie kopii. Co ciekawe, postuluje się, że plazmidy o wysokiej liczbie kopii mają większe szanse na utrwalenie się w komórkach potomnych, ponieważ rozprzestrzeniają się bardziej adekwatnie przez przypadek i bez wymogu stosowania systemów podziału31 , a także na przeniesienie w każdym zdarzeniu koniugacji, bezpośrednio lub pośrednio32,33,34.

Populacje plazmidów bla KPC i non-bla KPC w globalnych szczepach KPC-E. coli są niezwykle zróżnicowane

Opisywanie plazmidów Inc ujawniło obecność mediany czterech typów replikonów plazmidowych na izolat (zakres: 1-6; IQR: 3-5), reprezentujących szeroką różnorodność (Tabela 1). Jednakże, replikony IncN, col, IncFIA i IncI1 były nieproporcjonalnie nadreprezentowane w niektórych ST (p < 0,05; Tabela 1). Wśród 18 izolatów, które poddano sekwencjonowaniu PacBio, zidentyfikowaliśmy 53 zamknięte, nie-bla KPC plazmidy, o długości od 1 459 bp do 289 903 bp (Tabela S1; co najmniej cztery dodatkowe, częściowo kompletne struktury plazmidowe były obecne). Spośród tych plazmidów KPC innych niż Bla KPC, 10 (rozmiar: 2,571-150,994 bp) miało <70% podobieństwo (określone przez procent identyczności sekwencji pomnożony przez proporcję długości zapytania wykazującego homologię) do innych sekwencji dostępnych w GenBank, podkreślając, że część „plazmidomu” w KPC-E. coli pozostaje niekompletnie scharakteryzowana. Dla pozostałych 43 plazmidów, najwyższym dopasowaniem w GenBank był plazmid z E. coli w 35 przypadkach, K. pneumoniae w 5 przypadkach oraz Citrobacter freundii, Shigella sonnei, Salmonella enterica w 1 przypadku każdy (Tabela S3).

Dwadzieścia dwie struktury plazmidu bla KPC zostały w pełni rozwiązane (17 tylko z danych Pacbio, cztery tylko z danych Illumina, 1 zarówno z danych PacBio jak i Illumina), w zakresie od 14,029 bp do 287,067 bp (mediana = 55,590 bp; IQR: 23,499-82,765 bp). Te plazmidy zawierające bla KPC oraz sześć dodatkowych przypadków, w których bla KPC zidentyfikowano na kontigu zawierającym replikon, były bardzo zróżnicowane w oparciu o typowanie Inc (Tabela S1). Najczęściej występującym typem był IncN (n = 8/28 możliwych do typowania struktur bla KPC; 29%), a następnie małe, podobne do col plazmidy (n = 6/28 ; 21%). Innymi, rzadziej występującymi typami były: A/C2, FII(k), U (wszystkie n = 2); oraz L/M, P, Q1 i R (wszystkie n = 1). Cztery (14%) plazmidy bla KPC były konstruktami wieloreplikonowymi, a mianowicie: col/repA, FIB/FII, FIA/FII i FIA/FII/R.

Wspólne szkielety plazmidów IncN uległy globalnemu rozproszeniu w obrębie E. coli

Z bazy GenBank wybraliśmy do porównania wszystkie unikalne, w pełni zsekwencjonowane sekwencje plazmidu IncN-bla KPC (Tabela S4), pochodzące już z 2005 roku, czyli mniej więcej z czasu najwcześniejszych doniesień o E. coli wytwarzającej KPC. Szkielety plazmidów i sekwencje otaczające bla KPC w tych 16 referencjach plazmidów i podzbiorze 12 badanych sekwencji (patrz „Metody”) były zgodne z wielokrotnym przejęciem dwóch znanych kompleksów IncN-Tn4401-bla KPC w rozbieżnych ST E. coli: po pierwsze, w tle podobnym do plazmidu-9 (FJ223607, 2005, USA) i po drugie, w elemencie podobnym do Tn2/3 w tle podobnym do plazmidu-12 (FJ223605, 2005, USA).

W pierwszym przypadku zidentyfikowano podobieństwa genetyczne między plazmidem-9, pKPC-FCF/3SP, pKPC-FCF13/05, pCF8698, pKP1433 (reprezentującym hybrydę IncN) i plazmidami bla KPC z izolatów ecol_516, ecol_517, ecol_656 i ecol_736 (niniejsze badanie). Plazmid-9 zawiera zduplikowane elementy Tn4401b w odwrotnej orientacji z czterema różnymi sekwencjami 5 bp flankującymi w nietypowym układzie w obrębie intronu grupy II35. Struktury szkieletowe pozostałych plazmidów z tej grupy są zgodne z oddzielnym zdarzeniem nabycia elementu Tn4401b pomiędzy regionami pld i traG w ramach ancestralnej wersji struktury plazmidu-9, z wytworzeniem flankującej duplikacji miejsca docelowego TTCAG (TSD) (oznaczonej jako plazmid 9-like plasmid (hipotetyczny), Rys. 2). Międzynarodowe rozprzestrzenianie się, po którym nastąpiła lokalna ewolucja zarówno w obrębie gatunku, jak i pomiędzy gatunkami, mogłoby tłumaczyć różnice pomiędzy plazmidami, w tym: (i) zmienność na poziomie nukleotydów (obserwowana we wszystkich plazmidach); (ii) małe zdarzenia insercji/delecji (obserwowane we wszystkich plazmidach); (iii) większe zdarzenia insercji/delecji, w których pośredniczą elementy transpozycyjne (np. pCF8698_KPC_2); oraz (iv) prawdopodobną rekombinację homologiczną, skutkującą skupiskami zmienności w obrębie podobnego szkieletu plazmidu (np. ecol_656/ecol_736), jak również bardziej wyraźne rearanżacje, w tym tworzenie plazmidów „hybrydowych” (np. PKP1433) (Rys. 2).

Schemat porównawczy plazmidów IncN podobnych do FJ223607 (plazmid 9-like) (publicznie dostępne; niniejsze badania), oraz ich pochodzenie geograficzne/daty izolacji. Nazwy sekwencji plazmidów w kolorze czerwonym pochodzą z tego badania, uzyskane z danych PacBio oraz zamknięte (ecol_517, ecol_656) lub niekompletne struktury plazmidów (ecol_516, ecol_736) uzyskane z danych Illumina. Wyrównane słupki przy nazwach plazmidów reprezentują sekwencje plazmidów: jasnoszare oznaczają regiony o 100% identyczności sekwencji; czarne reprezentują zróżnicowanie nukleotydów między sekwencjami; cienkie linie reprezentują indeksy. Sekwencje kodujące są reprezentowane przez grube strzałki poniżej słupków poszczególnych sekwencji i są oznaczone kolorami zgodnie z kluczem kolorów. Wstawiony schemat opisujący zmienność genetyczną między sekwencjami przedstawia przykłady zidentyfikowanych zdarzeń ewolucyjnych: (a) zmiana na poziomie pojedynczego nukleotydu, (b) małe indele (≤100 bp), (c) duże indele (>100 bp), (d) zdarzenia rekombinacyjne.

W plazmid-12 (FJ223605), Tn4401b wstawił się do hybrydowego elementu Tn2-Tn3-podobnego (z powiązanymi genami oporności na leki, w tym bla TEM-1, bla OXA-9 i kilkoma genami oporności na aminoglikozydy), aczkolwiek przy braku duplikacji sekwencji docelowej, prawdopodobnie w wyniku wewnątrzcząsteczkowego, replikacyjnego zdarzenia transpozycyjnego generującego niedopasowane sekwencje miejsca docelowego (L TSS = TATTA; R TSS = GTTCT). Kompleks ten jest z kolei zlokalizowany pomiędzy dwoma elementami IS15DIV (IS15Δ)/IS26, flankowanymi przez 8 bp odwróconych powtórzeń, i znajduje się pomiędzy loci traI (891 bp od 3′ końca) i pld (~28 Kb; Rys. 3A). Elementy szkieletu plazmidu IncN 12 są zgodne z tymi, które zaobserwowano w ognisku w NIH5 oraz w wersji przearanżowanej w ognisku na Uniwersytecie Wirginii (CAV1043; 2008)6. Z tego badania wynika, że plazmidy ecol_224, ecol_881, ecol_AZ159, ecol_422 oraz rusztowania ecol_AZ151, ecol_744, ecol_AZ150 mają prawie identyczną strukturę jak plazmid-12, z klastrowymi zmianami na poziomie nukleotydów w genach traJ-traI, co jest zgodne z homologicznym zdarzeniem rekombinacyjnym dotyczącym tego regionu, oraz dowodami na sporadyczne zdarzenia insercji/delecji (ryc. 3A). Jednakże struktury bla KPC-Tn4401 w tych izolatach są prawie całkowicie degradowane przez obecność innych ruchomych elementów genetycznych (MGE), w tym elementów podobnych do Tn2/Tn3, ISKpn8/27 i Tn1721. W ecol_224, bla KPC-2 została wstawiona do szkieletu IncN jako część dwóch powtarzających się, odwróconych struktur Tn3-podobnych, flankowanych przez TTGCT TSD, i bliżej traI (136 bp od końca 3′) niż wspomniany wcześniej kompleks IS15DIV (IS15Δ)/IS26-podobny w plazmidzie-12 (Rys. 3B). Chociaż dokładne prześledzenie historii ewolucyjnej tego regionu genomowego nie jest możliwe, biorąc pod uwagę dostępne dane, obecność wspólnych sygnatur tej struktury w ecol_422, ecol_744, ecol_881, ecol_AZ159, ecol_AZ150 i ecol_AZ151 sugeruje wspólne nabycie i wielokrotne późniejsze rearanżacje, w których pośredniczyła obecność dużej liczby MGE flankujących bla KPC-2.

Schemat porównawczy plazmidów FJ223605-like (Plasmid-12-like) IncN KPC z tego badania. Panel 3A. Pochodzenie geograficzne, daty izolacji i ogólne wyrównanie struktur plazmid/contig. Nazwy sekwencji plazmidów w kolorze czerwonym to te z tego badania, pochodzące z danych PacBio i zamknięte (ecol_224, ecol_422, ecol_881, ecol_AZ159) lub niekompletne struktury plazmidów (ecol_744, ecol_AZ151, ecol_AZ150) pochodzące z danych Illumina. Wyrównane słupki przy nazwach plazmidów reprezentują sekwencje plazmidowe: jasnoszare oznaczają regiony o 100% homologii sekwencji; czarne reprezentują zróżnicowanie nukleotydowe między sekwencjami; cienkie linie reprezentują indeksy. Sekwencje kodujące są reprezentowane przez grube strzałki poniżej słupków poszczególnych sekwencji i są oznaczone kolorami zgodnie z kluczem kolorów. Wstawiony schemat opisujący zmienność genetyczną między sekwencjami przedstawia przykłady zidentyfikowanych zdarzeń ewolucyjnych: (a) zmiana na poziomie pojedynczego nukleotydu, (b) małe indeksy (≤100 bp), (c) duże indeksy (>100 bp), (d) zdarzenia rekombinacyjne. Panel 3B. Zbliżenie regionu pomiędzy traI i pld zawierającego bla KPC-2 tylko w badanych izolatach. Sekwencje kodujące są oznaczone kolorem jak na Rys. 3A; regiony sekwencji, o których mowa w tekście, są opatrzone adnotacjami.

Plazmidy kolopodobne mogą stanowić ważny wektor transmisji dla bla KPC w E.

Małe plazmidy podobne do coli były drugim najczęstszym typem plazmidu przenoszącego bla KPC w E. coli (n = 5 ), ale trzy z nich były identyczne (bla KPC-2, 16,559 bp), wszystkie wyizolowane w Pittsburghu, USA, z izolatów ST131 w ciągu dwóch lat (ecol_276 , ecol_356 , ecol_875 ). Te trzy izolaty dodatkowo zawierały replikony FIA, FIB, FII, X3 i X4, sugerując stabilne utrzymywanie się klonalnego szczepu + plazmidów w czasie, zgodne z analizami SNV/rdzenia i genomu akcesoryjnego (Fig. 1, Figura S1).

Pozostałe dwa plazmidy podobne do col skutecznie reprezentują krótkie odcinki DNA kodujące różne geny mobilizacji (mbeA/mbeC/mbeD) zaprzęgnięte do modułów Tn4401/bla KPC. Sekwencje 5 bp flankujące Tn4401 były zgodne z bezpośrednią, międzycząsteczkową transpozycją w obu przypadkach (ecol_870: TGTT-TGTT; ecol_867: TGTGA-TGTGA). W tym zestawie danych zaobserwowano również plazmid z kointegratem col/repA (ecol_AZ161), w którym Tn4401b został wstawiony pomiędzy sekwencje sygnaturowe colE3 i element Tn3 (Tn4401 TSS: AGATA-GTTCT). Powstawanie takich współintegrujących struktur plazmidowych u E. coli została również wcześniej opisana36, w tym struktura plazmidu podobna do fuzji col/pKpQIL (PKpQIL jest historycznie związana z bla KPC)37.

Plazmidy podobne do col były związane z producentami KPC w innych mniejszych, regionalnych badaniach21, 38. Niepokojące jest to, że wykazano, iż te małe wektory są odpowiedzialne za międzygatunkową dyfuzję genów qnr pośredniczących w oporności na fluorochinolony, nawet przy braku jakiejkolwiek oczywistej presji selekcyjnej na środki przeciwdrobnoustrojowe39. Znaczące powiązanie plazmidów typu col-like z określonymi ST E. coli (głównie ST131) w tym badaniu może być jednym z wyjaśnień nieproporcjonalnej reprezentacji bla KPC w tej linii.

Zróżnicowane sekwencje miejsc docelowych (TSSs) Tn4401 5 bp wspierają wysoką mobilność transpozonów

Kompletne izoformy Tn4401 flankujące bla KPC-2 lub bla KPC-3 obserwowano tylko w 24/43 (56%) izolatach, w tym Tn4401a/a-like (n = 10; jeden izolat z przerwą w kontigu upstream bla KPC), Tn4401b (n = 12) i Tn4401d (n = 2). Zidentyfikowano jedenaście różnych par 5 bp sekwencji miejsca docelowego (TSS), z których 7 (64%) nie było obserwowanych w żadnym plazmidzie porównawczym pobranym z GenBank (Tabela S5). Tn4401a miał trzy różne 5 bp TSS, Tn4401b siedem, a Tn4401d jedną. Większość reprezentowała TSD, ale w trzech przypadkach różne 5 bp TSSs flankowały Tn4401, co jest zgodne zarówno z bezpośrednimi zdarzeniami transpozycji międzycząsteczkowej, jak i replikacyjnej wewnątrzcząsteczkowej.

Z pełnego zestawu plazmidów GenBank i eksperymentów transpozycji in vitro przeprowadzonych przez innych, scharakteryzowano 30 różnych typów par 5 bp TSS, z czego siedem tylko w warunkach eksperymentalnych40. Pobrane plazmidy pochodzą z różnych gatunków i punktów czasowych (2005-2014), chociaż mogą nie reprezentować szerszej różnorodności miejsc insercji Tn4401 w wyniku błędu pobierania próbek. Nasze dane są jednak zgodne ze znaczną mobilnością Tn4401 w obrębie E. coli po nabyciu różnych izoform Tn4401 i/lub reprezentują wielokrotne przypadki importu do E. coli z innych gatunków.

Tradycyjne powiązanie bla KPC z Tn4401 uległo znacznej erozji w plazmidach KPC w E. coli

W szczególności, w pozostałych 19/43 (44%) izolatach struktura Tn4401 uległa degradacji poprzez zastąpienie jej MGE, z których tylko niektóre zostały wcześniej opisane41, 42. Dwa izolaty miały nowe struktury Tn4401Δb (skrócenie w górę łańcucha przez IS26 lub IS26-ΔIS5075 ). Struktura Tn4401e-podobna (delecja 255 bp upstream bla KPC) była obecna w trzech izolatach (ecol_227, ecol_316, ecol_583): została ona scharakteryzowana w jednym kompletnym plazmidzie PacBio (ecol_316) i stanowiła rearanżację w miejscu L TSS elementu ISKpn7. W tym plazmidzie obecny był drugi, częściowy element Tn4401 bez bla KPC, co byłoby zgodne z niepełnym, replikacyjnym, wewnątrzcząsteczkowym zdarzeniem transpozycyjnym (GGGAA = L TSS i R TSS na dwóch elementach Tn4401b, w odwrotnej orientacji). Inne motywy flankujące bla KPC obejmowały: hybrydowe elementy Tn2/Tn3-ISKpn8/27-bla KPC (n = 1; ecol_224); IS26-ΔtnpR(Tn3)-ISKpn8/27- bla KPC-ΔTn1721-IS26 (n = 5; ecol_AZ153-AZ155, ecol_AZ166, ecol_AZ167); ISApu2-tnpR(Tn3)-ΔblaTEM -bla KPC- korC-klcA-ΔTn1721-IS26 (n = 1; ecol_542); IS26-tnpR(Tn3)-ΔblaTEM -bla KPC-korC-IS26 (n = 1; ecol_545); hybrydowe elementy Tn2/Tn3 + ΔblaTEM-bla KPC-ΔTn1721 (n = 2; ecol_744, ecol_422), elementy Tn3-Δbla TEM-bla KPC- ΔTn1721 (n = 4; ecol_881, ecol_AZ151, ecol_AZ159, ecol_AZ150) i ΔTn3-Δ -ΔIS3000 (Tn3-like) (n = 1; ecol_AZ152). Nie byliśmy w stanie ocenić kontekstu flankującego bla KPC w ecol_452 z powodu ograniczeń montażu.

Ta oczywista różnorodność niezależnie nabytych MGE wokół genu bla KPC rozszerza środki, za pomocą których bla KPC może być mobilizowany. Co ciekawe, jak zaobserwowano wcześniej43, wszystkie zdegradowane sekwencje Tn4401 w tym zbiorze danych były związane ze zmiennymi odcinkami flankujących sekwencji Tn2/3-podobnych, co sugeruje, że wstawienie Tn4401 do kontekstu Tn2/Tn3-podobnego mogło umożliwić temu ostatniemu działanie jako hotspot dla wstawienia innych MGE6. Na szczególną uwagę zasługuje związek z IS26, który został powiązany z rozprzestrzenianiem kilku innych genów oporności u E. coli, w tym CTX-M ESBLs24, 44; jest w stanie zwiększyć ekspresję blisko położonych genów oporności45; uczestniczy w tworzeniu kointegratów, a tym samym w rearanżacji plazmidu46; i zwiększa występowanie innych zdarzeń związanych z transferem IS26 do plazmidów zawierających IS26 46.

.