W tym badaniu, aby zrozumieć rolę ścieżki IRE1a-XBP1, naszą podstawową strategią było użycie modelu różnicowania Th2 in vitro (Fig. 1b). Naiwne komórki T helpera były aktywowane przez aktywację TCR w płytkach pokrytych anty-CD3e/CD28 w warunkach różnicowania Th2 przez 72 h, odpoczywały przez 42 h i były ponownie stymulowane przez aktywację TCR przy użyciu płytek pokrytych anty-CD3e/CD28. Aby zaburzyć szlak IRE1a-XBP1, użyliśmy dobrze znanego leku 4μ8c, który specyficznie blokuje szlak poprzez hamowanie aktywności endonukleazy IRE1a. Lek dodawano do podłoża hodowlanego w stężeniu 15μM na początku hodowli oraz podczas przechodzenia z płytki aktywacyjnej do spoczynkowej. O wyborze stężenia leku decydowała jego najwyższa skuteczność inhibicji IRE1a przy najniższej toksyczności komórkowej (plik dodatkowy 1: Figura S1). Porównaliśmy transkryptomy limfocytów Th2 naiwnych i restymulowanych (leczonych lekiem i nieleczonych) za pomocą sekwencjonowania RNA, zidentyfikowaliśmy miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego XBP1 w reaktywowanych Th2 za pomocą ChIPmentacji (sekwencjonowanie ChIP) i zintegrowaliśmy dane obejmujące cały genom, aby przewidzieć bezpośrednie cele i ich rolę regulacyjną.

Komórki T helpera włączają szlak IRE1a-XBP1 podczas aktywacji in vitro

Aktywowane i zróżnicowane komórki T helpera wydzielają dużą ilość cytokin. Dlatego dobrze rozwinięta maszyneria wydzielnicza jest warunkiem koniecznym, aby komórki mogły przystosować się do tego stresu wydzielniczego. Aby przewidzieć udział szlaku ER-stress/UPR podczas aktywacji komórek T helper, porównano transkryptom komórek naiwnych i zróżnicowanych Th2 (restymulowanych Th2). Różnicowo wyrażone geny uzyskane w wyniku tego porównania zostały włączone do ścieżki KEGG „Protein Processing in the Endoplasmic Reticulum”, aby zobrazować elementy, które ulegają zwiększonej lub zmniejszonej ekspresji. Analiza pokazuje, że kiedy naiwne komórki T helper są aktywowane i różnicują się w komórki Th2, zwiększają ekspresję genów zaangażowanych w ścieżkę stresu ER (plik dodatkowy 1: Figura S2). Kilka czynników, które wcześniej scharakteryzowano jako kontrolery fałdowania i wydzielania białek, w tym sam XBP1, są podwyższone podczas różnicowania komórek T helper.

Aby potwierdzić to przewidywanie, a szczególnie zbadać zaangażowanie ścieżki IRE1a-XBP1, zmierzyliśmy ekspresję mRNA i białka IRE1a w limfocytach Th2 zróżnicowanych i reaktywowanych in vitro (ryc. 1b). Komórki były analizowane przez qPCR i Western blot, aby porównać odpowiednio mRNA i białko. Stwierdziliśmy, że zarówno poziom mRNA jak i białka był podwyższony w aktywowanych komórkach T helper (Rys. 1c, lewy i środkowy panel). Wiadomo, że fosforylacja IRE1a wskazuje na jego stan funkcjonalny. Zaobserwowaliśmy, że białko to jest fosforylowane w aktywowanych limfocytach Th2 (ryc. 1c, prawy panel). Ten zwiększony fosfo-IRE1a może być wyjaśniony przez zwiększoną syntezę białka, chociaż nie możemy wykluczyć możliwości zwiększonej aktywności kinazy i autofosforylacji. Analiza densytometryczna pasm Western blot sugeruje, że oba mechanizmy, wzrost syntezy białka i zwiększona fosforylacja, są zaangażowane. Upregulacja białka wzrosła trzykrotnie, ale fosfoproteina wzrosła 4,5-krotnie (ryc. 1c).

Aktywowany IRE1a splicuje unspliced XBP1 (XBP1u) mRNA i wytwarza spliced XBP1 (XBP1s) izoformę mRNA. Zaobserwowaliśmy wzrost splicowanej formy XBP1 (XBP1s), zarówno na poziomie mRNA, jak i białka, po aktywacji komórek pomocniczych T (Fig. 1d, e). Jako kontrolę pozytywną zastosowano tunikamycynę. Jest to lek, który hamuje N-linked glikozylację i w ten sposób powoduje akumulację białek nieuformowanych (tj. stres retikulum endoplazmatycznego (ER)) i zwiększa XBP1s poprzez zwiększenie aktywności IRE1a. Specyficzne zahamowanie aktywności endonukleazy IRE1a przez traktowanie komórek 4μ8c zniosło zarówno mRNA, jak i izoformy białkowe XBP1s, potwierdzając, że tworzenie formy spliced było zależne od aktywności IRE1a (Fig. 1d, e).

Wyniki te potwierdzają, że szlak IRE1a-XBP1 jest zakonserwowany w limfocytach Th2 i ulega regulacji podczas aktywacji komórek pomocniczych T in vitro. Następnie postanowiliśmy zbadać, czy dzieje się tak również in vivo.

In vivo activated T helper cells upregulate the IRE1a-XBP1 pathway

Aby sprawdzić, czy ścieżka IRE1a-XBP1 działa w komórkach T CD4+ in vivo, zainfekowaliśmy myszy C57BL/6 pasożytem Nippostrongylus brasiliensis, dobrze poznanym modelem odpowiedzi immunologicznej napędzanej przez Th2. Po 7 dniach od zakażenia, analizowaliśmy ekspresję białka XBP1s w komórkach T helper za pomocą cytometrii przepływowej. Stwierdziliśmy, że komórki T helper myszy zarażonych robakiem wyrażają znacznie więcej XBP1s w porównaniu z niezarażonymi myszami kontrolnymi, co sugeruje upregulacji szlaku (ryc. 2).

Komórki T helper upregulate IRE1a-XBP1 pathway in vivo podczas infekcji. Splenocyty myszy zarażonej nicieniem (Nippostrongylus brasiliensis) (7 dni po zarażeniu) barwiono przeciwciałem anty-XBP1s sprzężonym z PE i analizowano metodą cytometrii przepływowej (strategia bramkowania: singlet > żywe komórki > CD4+CD3e+ > XBP1s+). Jeden reprezentatywny profil FACS jest wyświetlany (lewy panel), a wykres zawierający wszystkie wyniki (n = 4) jest pokazany w „prawym panelu”

Wyniki te potwierdzają, że szlak jest aktywny in vivo. W związku z tym postanowiliśmy prześledzić ścieżkę za pomocą podejścia genomowego w limfocytach Th2.

Genomowa analiza transkryptomiczna różnicowej ekspresji genów ujawnia geny regulowane przez IRE1a-XBP1

Aby uchwycić globalną rolę regulacyjną genów ścieżki IRE1a-XBP1, porównaliśmy aktywowane in vitro komórki Th2 z komórkami z zahamowaną aktywnością endonukleazy IRE1a przez dodanie 4μ8c do pożywki hodowli komórkowej. Następnie porównaliśmy transkryptomy aktywowanych limfocytów Th2 z lub bez inhibicji szlaku IRE1a-XBP1. Transkryptomy komórek Th2 leczonych i nieleczonych 4μ8c uzyskano metodą sekwencjonowania mRNA (RNA-seq). Kontrola jakości danych sekwencjonowania RNA jest przedstawiona w pliku dodatkowym 1: Figura S3. Porównując transkryptomy naiwnych i aktywowanych limfocytów Th2, stwierdziliśmy, że 10995 genów było różnie regulowanych podczas aktywacji Th2. Zahamowanie szlaku IRE1a-XBP1 przez leczenie 4μ8c spowodowało zróżnicowanie ekspresji 3144 genów w porównaniu z nieleczoną kontrolą Th2 (Figura 3a, Dodatkowy plik 1: Figura S3 prawy panel). Dwa tysiące sześćset siedemdziesiąt z tych genów było zaangażowanych w różnicowanie Th2 (ryc. 3a). Hierarchiczne grupowanie genów ujawnia grupy genów zwiększonej i zmniejszonej regulacji po leczeniu 4μ8c (Dodatkowy plik 1: Figura S3, po prawej). Szczegółowa analiza tych genów ujawniła, że wiele z nich jest związanych z odpowiedzią na białko rozwinięte i stresem ER, wskazując na istotny wpływ szlaku IRE1a-XBP1 (Fig. 3b) na te procesy biologiczne. Pełna lista różnie wyrażonych genów znajduje się w pliku dodatkowym 2: Tabela S1. Analiza Gene Ontology (GO) tych różnie wyrażonych genów po traktowaniu komórek Th2 4μ8c (tj. Geny regulowane przez ścieżkę IRE1a-XBP1) wykazała, że są one wzbogacone w następujące procesy biologiczne: „odpowiedź na stres ER” (GO:0006950), „regulacja transdukcji sygnału” (GO:0009966), „produkcja cytokin” (GO:0001816), „proliferacja komórek” (GO:0008283), „cykl komórkowy” (GO:0007049) i odpowiedź immunologiczna (GO:0006955) (Ryc. 3c). Te zmiany we wzorcach ekspresji genów po zahamowaniu IRE1a sugerują szerokie zaangażowanie czynnika transkrypcyjnego XBP1 w aktywację i proliferację Th2, jak również w różnicowanie. Dlatego postanowiliśmy znaleźć wzorce zajmowania chromatyny w całym genomie przez czynnik transkrypcyjny XBP1.

XBP1 ChIPmentation ujawnia bezpośrednie geny docelowe XBP1 w komórkach Th2

Aby zidentyfikować genomową okupację chromatyny XBP1, przeprowadziliśmy ChIPmentację, niedawno opracowaną metodę, która okazała się być szybsza, bardziej czuła i wytrzymała niż tradycyjne metody ChIP-seq, używając przeciwciała ChIP-grade przeciwko XBP1. In vitro zróżnicowane i reaktywowane komórki Th2 były używane do XBP1 ChIP. Przeprowadzono dwie niezależne replikacje biologiczne. Uzyskaliśmy odpowiednio 19,3 mln i 22,4 mln par-endów dla każdej replikacji. Używając MACS2 z wartością q mniejszą niż 0,01 i wzbogaceniem ponad 5-krotnym, zidentyfikowaliśmy 9031 i 7662 pików, odpowiednio, w dwóch replikacjach. Analiza nakładania przy użyciu bedtools zasugerowała, że 5892 piki były obecne w obu replikacjach. W związku z tym, skupiliśmy się tylko na tych 5892 szczytach do dalszej analizy.

Jak oczekiwano, szczyty wiązania zostały zidentyfikowane wokół regionów promotorowych w znanych genach docelowych XBP1, takich jak Hspa5, który koduje białko przyzwoitki ER BiP znane również jako Grp78; zdarzenie wiązania zaobserwowano również wokół promotora samego XBP1 (Rys. 4a), wskazując na potencjalną autoregulację XBP1. Aby poznać cechy genomowe związane z miejscami wiązania XBP1, porównaliśmy ich szczytową lokalizację z genami RefSeq za pomocą programu HOMER . Większość szczytów wiązania XBP1 zlokalizowana była w obrębie promotora (zdefiniowanego jako upstream 1000 bp i downstream 500 bp względem anotowanych miejsc startu transkrypcji) (36%) i regionów intronowych (35%), często obserwowano również dystalne wiązanie międzygenowe (25%) (Rys. 4b). Genomowa dystrybucja pików XBP1 wskazuje, że wiąże on zarówno promotory jak i potencjalne enhancery.

Aby dokładniej scharakteryzować regulom XBP1, przeprowadziliśmy odkrywanie motywów de novo przy użyciu HOMER w celu zidentyfikowania wzbogaconych motywów DNA w obrębie regionów wiązania XBP1. Najważniejszym zidentyfikowanym motywem jest sekwencja konsensusowa GCCACGT, która jest prawie identyczna z ludzkim motywem wiążącym XBP1 zdefiniowanym w liniach komórkowych raka piersi (Rys. 4c). Wskazuje to na wysoce konserwatywną specyficzność wiązania XBP1 pomiędzy ludźmi i myszami oraz pomiędzy typami komórek. Najwyżej wzbogacony motyw w naszych danych dotyczących myszy również przypomina motyw XBP1 z bazy danych JASPAR, co ponownie potwierdza wysoką jakość naszych danych dotyczących ChIPmentacji. Drugim najbardziej wzbogaconym motywem jest motyw wiążący NF-Y (plik dodatkowy 1: Figura S4C). Co ciekawe, motyw NF-Y był często znajdowany wokół regionów promotorowych genów cyklu komórkowego, zwłaszcza genów zaangażowanych w regulację cyklu komórkowego G2/M . Zarówno motyw XBP1, jak i motyw NF-Y współwystępują wokół podzbioru 258 szczytów wiązania XBP1 (ryc. 4d), wskazując na potencjalną współpracę między XBP1 i czynnikami transkrypcyjnymi NF-Y w celu regulacji podzbioru genów docelowych. Lista genów docelowych, które są potencjalnie współregulowane przez XBP1 i NF-Y jest przedstawiona w pliku dodatkowym 3: Tabela S2, a pełna lista genów docelowych XBP1 jest również przedstawiona w pliku dodatkowym 3: Tabela S2. Pięć najlepszych wzbogaconych motywów jest wyświetlanych w pliku dodatkowym 1: Figura S4C. Aby zbadać funkcje genów związanych z XBP1, użyliśmy GREAT do scharakteryzowania szczytów wiązania XBP1. Większość znaczących terminów GO jest związana z fałdowaniem białka i stresem ER (Figura 4e), co jest zgodne ze znaną biologiczną rolą XBP1.

W sumie, eksperymenty ChIPmentation przewidują rolę XBP1 w zwiększaniu fałdowania i wydzielania białka, a także aktywacji limfocytów Th2.

Integracja danych transkryptomicznych i danych ChIP-seq w celu ujawnienia sieci regulacyjnej genów kontrolowanej przez XBP1

Aby ujawnić regulowane przez XBP1 bezpośrednie geny docelowe i jego transkrypcyjną sieć regulacyjną, zintegrowaliśmy dane transkryptomiczne obejmujące cały genom i dane ChIPmentacji. Bezpośredni gen docelowy jest definiowany przez jego zróżnicowaną ekspresję po inhibicji IRE1a (tj. leczenie 4μ8c) i zajęcie czynnika transkrypcyjnego XBP1 w locus genu. Znaleźliśmy 1143 bezpośrednie geny docelowe w Th2, z których 122 cele były wcześniej zgłaszane jako bezpośrednie cele XBP1 w innych typach komórek (tj. mięśniach, komórkach β trzustki i komórkach plazmatycznych) (ryc. 5a). W tym kontekście 1021 genów można uznać za specyficzne dla Th2. Działanie XBP1 na jego bezpośrednie cele nie ma określonego kierunku, zawiera geny podlegające i nie podlegające regulacji. Na ryc. 5b pokazano 38 genów, których lista znajduje się w pliku dodatkowym 4: Tabela S3. Najbardziej znaczące zidentyfikowane procesy biologiczne i szlaki są związane ze składaniem białek i stresem ER (plik dodatkowy 1: Figura S5), które są zgodne z jego znanymi rolami biologicznymi, a także zawierają nowe cele specyficzne dla Th2.

Integracja danych ChIPmentacji i RNA-seq ujawnia bezpośrednie geny docelowe XBP1 i jego sieć regulacyjną. a Diagram Venn porównujący wcześniej zgłoszone geny docelowe XBP1 innych typów komórek wydzielniczych z bezpośrednimi genami docelowymi Th2 w tym badaniu. Bezpośrednie geny docelowe XBP1 w tym badaniu to te, które występują zarówno w kategorii „Geny zajmowane przez XBP1 w Th2”, jak i „Geny ulegające ekspresji różnicowej (Th2 → Th2+4μ8c)”. Bezpośrednie geny docelowe XBP1 komórek B/komórek plazmatycznych, komórek mięśni szkieletowych i komórek β trzustki zostały zaobserwowane przez Acosta-Alvear i wsp. i zostały użyte tutaj do porównania. b Mapa cieplna przedstawiająca wzór ekspresji bezpośrednich genów docelowych XBP1. Wyświetlono 38 genów, które wykazują wyraźny wzorzec. c Sieć regulacji transkrypcji: czynniki transkrypcyjne, które są bezpośrednim celem XBP1. Geny w sieci ulegają różnej ekspresji (upregulated-red; downregulated-blue) pod wpływem leczenia 4μ8c. The transcription factors that are not differentially expressed but have a XBP1 ChIPseq peak are shown in the right-hand-hand side list

Despite the preponderance of XBP1’s role in controlling this pathway, other transcription factors are also found to be involved. Aby zbadać kaskadę regulacyjną, która następuje po regulacji XBP1, zbudowaliśmy transkrypcyjną sieć regulacyjną poprzez wyodrębnienie opisanych czynników transkrypcyjnych z pików ChIP-seq promotora lub egzonicznych/intronowych (Rys. 5c). Pełna lista czynników transkrypcyjnych znajduje się w pliku dodatkowym 5: Tabela S4. Sieć ta została dodatkowo uzupełniona przez dodanie różnie wyrażonych genów, które mają adnotowane interakcje z docelowymi czynnikami transkrypcyjnymi w bazie danych STRING (plik dodatkowy 6: Tabela S5).

Czynniki transkrypcyjne, które są bezpośrednio regulowane przez XBP1, można podzielić na trzy szerokie kategorie funkcjonalne zaangażowane w następujące procesy: rozwiązywanie stresu ER wydzielania białek, regulacja cyklu komórkowego i proliferacji oraz kontrola funkcji efektorowych komórek odpornościowych. Czynniki transkrypcyjne zaangażowane w stres ER mogą ułatwiać wydzielanie cytokin w limfocytach Th2. Przewidywanie to opiera się na wcześniejszych doniesieniach dotyczących komórek wydzielniczych, takich jak komórki acinarne trzustki i komórki plazmatyczne. Te czynniki transkrypcyjne, mianowicie Bhlha15, Atf3, Atf6, Atf6b, Atf4 i Creb3l2, okazały się być zaangażowane w adaptację stresu wydzielniczego ER .

Celem czynników proliferacji komórkowej i czynników transkrypcyjnych związanych z cyklem komórkowym może być ułatwienie kontrolowanej szybkiej ekspansji aktywowanych komórek Th2. Czynniki związane z odpowiedzią immunologiczną są prawdopodobnie zaangażowane w różnicowanie Th2 i produkcję cytokin. Dlatego chcieliśmy przetestować efekt downregulacji XBP1s w wydzielaniu cytokin, proliferacji komórek i produkcji cytokin.

Scieżka IRE1a-XBP1 kontroluje wydzielanie cytokin w komórkach T helper

Porównanie genomowe genów regulowanych przez XBP1s przewiduje, że czynnik ten jest zaangażowany w wydzielanie cytokin. Aby zwalidować to przewidywanie, zablokowaliśmy aktywność endonukleazy IRE1a w komórkach Th2 i przeanalizowaliśmy supernatant hodowli komórkowej w celu ilościowego określenia poziomu IL4 metodą ELISA. Wybraliśmy IL4 jako testowalną cytokinę kandydującą, ponieważ jej mRNA i białko są niezmienione przez downregulację XBP1 (Dodatkowy plik 1: Figura S6A lewy panel, Figura 6 lewy i środkowy panel górnego rzędu). Stwierdziliśmy, że wydzielanie IL4 jest znacznie zahamowane w komórkach traktowanych 4μ8c (Figura 6, prawy panel górnego rzędu). Zgodnie z oczekiwaniami, wynik ten wspiera udział szlaku IRE1a-XBP1 w ułatwianiu wydzielania cytokin w komórkach Th2 zgodnie z przewidywaniami. Zahamowanie szlaku podczas fazy restymulacji nie ma znaczącego efektu hamującego na wydzielanie IL4 (plik dodatkowy 1: Figura S6B). Wynik ten sugeruje, że XBP1s jest wymagany podczas różnicowania Th2, prawdopodobnie do rozwoju wydajnej maszyny wydzielniczej.

Ścieżka IRE1a-XBP1 jest wymagana do ekspresji cytokin i wydzielania w limfocycie Th2. Naiwne komórki T helpera hodowano w warunkach aktywacji Th2 w obecności inhibitora IRE1a 4μ8c przez 3 dni, odpoczywano przez 2 dni, reaktywowano przez opłaszczoną płytkę i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej w celu wykrycia wewnątrzkomórkowej ekspresji cytokin IL4, IL5 i IL13. Reprezentatywne profile FACS są wyświetlane w pierwszych dwóch kolumnach. Wewnątrzkomórkowa ekspresja cytokin jest porównywana w kolumnie 3, przy trzech do siedmiu niezależnych powtórzeniach biologicznych. Kolumna czwarta: supernatanty hodowli komórkowej z Th2 poddanych działaniu 4μ8c lub DMSO analizowano metodą ELISA w celu pomiaru stężenia cytokin. FACS bramkowanie: limfocyty > pojedyncze > żywe komórki > cytokiny

Scieżka IRE1a-XBP1 kontroluje ekspresję cytokin IL13 i IL5

IL5 i IL13 są dwiema ważnymi cytokinami typu 2, które są zaangażowane w eozynofilię, alergie i infekcje helmintami. Stwierdziliśmy, że zahamowanie szlaku IRE1a-XBP1 znacząco hamuje ekspresję i wydzielanie białek IL5 i IL13 do podłoża hodowlanego (ryc. 6 prawy panel środkowego i dolnego rzędu). Analiza bioinformatyczna transkryptomu Th2 przewiduje, że szlak IRE1a-XBP1 pozytywnie kontroluje ekspresję genów IL5 i IL13, ponieważ oba te geny zostały zidentyfikowane jako geny ulegające różnej ekspresji po zahamowaniu IRE1a (Dodatkowy plik 2: Tabela S1). Zatwierdziliśmy to przewidywanie za pomocą analizy ekspresji genów metodą RT-qPCR (Dodatkowy plik 1: Figura S6A, środkowy i prawy panel) i cytometrii przepływowej (Figura 6). Wyniki te sugerują transkrypcyjne zaangażowanie szlaku regulującego IL5 i IL13. Co ważne, poziomy mRNA i białka IL4 nie uległy zmianie, wskazując na specyficzną regulację IL5 i IL13.

Ścieżka IRE1a-XBP1 ułatwia zależną od aktywacji proliferację komórek T helpera

Stopień proliferacji komórek jest wynikiem interakcji pozytywnych i negatywnych regulatorów. Zaobserwowaliśmy, że geny kodujące zarówno pozytywne, jak i negatywne regulatory proliferacji komórek ulegają różnej ekspresji, gdy szlak IRE1a-XBP1 został zablokowany przez 4μ8c (Fig. 7a, lewy panel, plik dodatkowy 7: Tabela S6), z których wiele genów okazało się być bezpośrednimi celami XBP1 (Fig. 7a, prawy panel, plik dodatkowy 8: Tabela S7). Ta obserwacja przewiduje zmianę tempa proliferacji po zahamowaniu IRE1a. Dlatego też byliśmy zainteresowani sprawdzeniem wpływu inhibicji IRE1a-XBP1 na proliferację komórek. Przeprowadziliśmy test proliferacji komórek przy użyciu komórek Th2. Naïve splenic CD4+ T komórki były znakowane fioletem CellTrace i aktywowane w warunkach różnicowania Th2 w obecności lub nieobecności 4μ8c. Rozpad barwnika fluorescencyjnego był monitorowany za pomocą cytometrii przepływowej. Stwierdziliśmy, że downregulacja XBP1s znacznie hamuje proliferację komórek (Fig. 7b), ale nie indukuje śmierci komórek (Dodatkowy plik 1: Figura S7).

Scieżka IRE1a-XBP1 promuje zależną od aktywacji proliferację komórek Th2 i cykl komórkowy. a Lewy panel: hierarchiczne grupowanie różnie wyrażonych genów związanych z proliferacją komórek w transkryptomie Th2 poddanym działaniu 4μ8c i nie poddanym działaniu. Panel prawy: hierarchiczne grupowanie genów będących bezpośrednim celem XBP1, o których wiadomo, że są zaangażowane w proliferację komórek. Mapa cieplna pokazuje skalowane wartości ekspresji oznaczone jako rząd Z-score, w czerwono-niebieskiej skali kolorów, z czerwonym wskazującym na zwiększoną ekspresję i niebieskim wskazującym na zmniejszoną ekspresję. b Splenic naïve T helper cells były barwione barwnikiem CellTrace Violet i aktywowane przez 72 h w warunkach różnicowania Th2 i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej. Generacje komórek Th2 są w kolorze „czerwonym”, a komórki traktowane 4μ8c są w kolorze „niebieskim” na histogramie proliferacji komórek (lewy panel, jeden reprezentatywny eksperyment). Graficzna reprezentacja indeksu podziału, jak uzyskano z pięciu niezależnych replik biologicznych (prawy panel)

Proliferacja komórek pomocniczych T jest związana z różnicowaniem i produkcją cytokin. Zmniejszona ekspresja IL5 i IL13 (ryc. 6) może być potencjalnie wyjaśniona przez fakt, że proliferacja komórek jest opóźniona. Gdyby jednak obniżona proliferacja była główną przyczyną braku sekrecji, produkcja IL4 również byłaby zahamowana. Jednak nie zaobserwowaliśmy żadnej znaczącej zmiany w ekspresji IL4 po zahamowaniu IRE1a (Fig. 6, Dodatkowy plik 1: Figura S6A). Aby dokładniej zbadać tę rozbieżność, przeprowadziliśmy testy proliferacji komórek przy użyciu linii mysich reporterów IL13-GFP i IL4-GFP. W komórkach Th2 wyrażających IL4-GFP zaobserwowaliśmy zahamowanie produkcji IL4 w pierwszych kilku pokoleniach podziału komórek do 72 h po leczeniu 4μ8c (Dodatkowy plik 1: Figura S8). Ale po 96 godzinach różnica w ekspresji IL4 staje się nieistotna, niezależnie od tego, w którym pokoleniu podziału komórkowego znajdują się komórki. Ta obserwacja sugeruje, że opóźnienie proliferacji spowodowane inhibicją IRE1a nie jest wystarczające do zahamowania ekspresji IL4. W przeciwieństwie do tego, w IL13-GFP, obserwowaliśmy spadek ekspresji IL13 od pierwszego pokolenia i trwa to przez późniejsze pokolenia (plik dodatkowy 1: Figura S9).

IRE1a inhibicja opóźnia progresję cyklu komórkowego przez fazę S i G2/M

Analiza bioinformatyczna różnie wyrażonych genów (Th2 vs 4μ8c-treated Th2) i bezpośrednich genów docelowych XBP1 ujawnia kilka genów, które są zaangażowane w kontrolowanie progresji cyklu komórkowego przez różne etapy (tj, G1, S, G2/M) zostały pogrupowane w dwie grupy ulegające ekspresji w górę lub w dół (ryc. 8a). Wzięliśmy geny ulegające różnej ekspresji w Th2 poddanym działaniu 4μ8c w porównaniu do Th2 nie poddanego działaniu 4μ8c (skorygowana wartość p < 0,05) (ryc. 8a, po lewej, plik dodatkowy 9: Tabela S8) i geny ulegające różnej ekspresji w bezpośrednich celach XBP1 (ryc. 8a, po prawej, plik dodatkowy 10: Tabela S9), i sprawdziliśmy pod kątem znanych ról na różnych etapach cyklu komórkowego, używając ręcznie stworzonej listy opartej na danych RNA-seq lub opublikowanej bazy danych. Stwierdziliśmy, że wiele genów ze wszystkich etapów cyklu komórkowego (tj. G1, S i G2/M) było dotkniętych tym problemem. Aby zidentyfikować etapy cyklu komórkowego regulowane przez szlak IRE1a-XBP1, stworzyliśmy i wykorzystaliśmy transgeniczny szczep myszy FUCCI (fluorescencyjny ubikwitynowy wskaźnik cyklu komórkowego), który wyraża mCherry-tagged Cdt1 i mVenus-tagged Geminin. Szczep ten jest podobny do tego użytego w . Komórki G1 to mCherry+ mVenus- (Q3; ryc. 8b), komórki G1-S to mCherry+ mVenus+ (Q2; ryc. 8b), a komórki SG2M to mCherry- mVenus+ (Q1; ryc. 8b), natomiast komórki w mitozie i wchodzące w G1 to mCherry- mVenus- (Q4; ryc. 8b). Porównaliśmy profile cyklu komórkowego komórek Th2 traktowanych pojazdem i 4μ8c podczas aktywacji komórek T. Stwierdziliśmy, że komórki gromadzą się w fazie S i/lub G2/M, gdy szlak IRE1a-XBP1 jest zablokowany (Fig. 8b). Podobne wyniki uzyskano w innym podejściu przy użyciu testu inkorporacji BrdU z barwieniem DAPI (plik dodatkowy 1: Figura S10).

Zahamowanie IRE1a opóźnia progresję cyklu komórkowego poprzez fazę S i G2/M. a Lewy panel: mapa cieplna różnie wyrażonych genów związanych z fazą cyklu komórkowego w transkryptomie Th2 poddanym i nie poddanym działaniu 4μ8c. Panel prawy: mapa cieplna genów będących bezpośrednim celem XBP1, o których wiadomo, że są zaangażowane w cykl komórkowy. Mapa cieplna przedstawia skalowane wartości ekspresji oznaczone jako rząd Z-score, w czerwono-niebieskiej skali kolorystycznej, gdzie kolor czerwony wskazuje na zwiększoną ekspresję, a niebieski na zmniejszoną. b Analiza cyklu komórkowego limfocytów Th2 po 72 h aktywacji, przy użyciu linii myszy FUCCI, które wyrażają CDT1 znakowane mCherry i GEMININ znakowane Venus. U góry po lewej: schematyczne przedstawienie etapów cyklu komórkowego u myszy FUCCI. Górna prawa: porównanie komórek (% ogółu) uzyskanych z różnych etapów cyklu komórkowego u Th2 i Th2 poddanych działaniu 4μ8c (n = 6). Dolne panele: jeden reprezentatywny profil FACS Th2 i Th2 poddanego działaniu 4μ8c, pokazujący komórki wyrażające CDT1 i GEMININ

Transgeniczna ekspresja XBP1s uzupełnia hamowanie aktywności endonukleazy IRE1a przez 4μ8c

Aby sprawdzić, czy obserwowane fenotypy poddane działaniu 4μ8c wynikały z utraty XBP1s, przeprowadziliśmy testy komplementarności poprzez transdukcję wektora ekspresji XBP1s do komórek Th2 in vitro. Wektor ten kodował splicedowaną formę XBP1 (XBP1s), której funkcja jest niezależna od funkcji IRE1a. Stwierdziliśmy, że stabilna ektopowa ekspresja XBP1s neguje efekt leczenia 4μ8c i nie ma znaczącej zmiany w transkryptomie po leczeniu 4μ8c, gdy komórki Th2 nadekspresjonują XBP1s (plik dodatkowy 1: Figura S11A). Komórki Th2 wykazujące nadekspresję XBP1s proliferują i różnicują się normalnie w obecności 4μ8c (plik dodatkowy 1: Figura S11B i S11C, odpowiednio). Wyniki te silnie sugerują, że fenotypy obserwowane po leczeniu 4μ8c są spowodowane utratą XBP1s.

.