Projekt badania i uczestnicy

Przeprowadziliśmy prospektywne badanie dokładności diagnostycznej badania Ultra zarówno na tkance pochodzącej z FNA, jak i z biopsji rdzeniowej węzłów chłonnych u pacjentów z podejrzeniem gruźliczego zapalenia gruczołów. Badanie przeprowadzono w Groote Schuur Hospital, trzeciorzędowym ośrodku akademickim w Kapsztadzie, w Republice Południowej Afryki. Do badania kwalifikowano osoby dorosłe (≥18 lat), zarówno pacjentów hospitalizowanych, jak i ambulatoryjnych, zgłaszających się z powiększonymi węzłami chłonnymi o średnicy >20 mm w najszerszym miejscu, zlokalizowanymi w okolicy szyjnej, pachowej lub pachwinowej. Do badania włączano chorych leczonych przeciwgruźliczo, pod warunkiem, że byli leczeni <1 miesiąca (podanalizowano chorych leczonych przeciwgruźliczo <24 h). Wykluczano chorych z przeciwwskazaniami do biopsji rdzeniowej (niski poziom płytek krwi, inne czynniki ryzyka koagulopatii i krwawienia, niestabilność kliniczna, niebezpieczne miejsce biopsji). Od wszystkich uczestników uzyskano pisemną, świadomą zgodę. Human Research Ethics Committee of the Faculty of Health Sciences, University of Cape Town, approved the study.

Pacjenci pochodzili z Groote Schuur oraz ze szpitali drugiego stopnia i klinik dziennych w obszarze referencyjnym. Rejestrowano wyniki wcześniejszych badań w kierunku gruźlicy (Xpert plwociny lub hodowla gruźlicy z dowolnego miejsca w ciągu 3 miesięcy od skierowania lub lipoarabinomannan (LAM) w moczu). Uzyskano szczegóły dotyczące statusu HIV, leczenia gruźlicy i ART.

Zbieranie danych

Informacje demograficzne, objawy, czas trwania objawów, wynik testu na HIV i inne wykonane badania gruźlicy zostały zarejestrowane przy zapisie. Stan sprawności oceniano zgodnie z klasyfikacją Eastern European Cooperative Group (ECOG). Zanotowano miejsce biopsji oraz inne miejsca występowania limfadenopatii. Obecność i czas trwania objawów konstytucjonalnych (kaszel, utrata wagi, nocne poty) były szczegółowo pytane o czas, w którym pacjent zauważył powiększenie węzłów chłonnych. Pobrano krew w celu wykonania pełnej morfologii krwi z różnicowaniem, oznaczenia dehydrogenazy mleczanowej i statusu HIV oraz, jeśli wynik był dodatni, oznaczenia liczby CD4 i wiremii u osób stosujących ART.

Procedury badawcze i pobieranie próbek

FNA wykonano przy użyciu igły 22G i strzykawki o pojemności 5 mL; dalsze procedury badawcze zależały od objętości uzyskanej próbki aspiratu, jak pokazano na rycinie 1. Biopsję rdzeniową wykonywano tylko wtedy, gdy z aspiratu uzyskano < 0,5 mL materiału kazuistycznego, ze względu na ryzyko wywołania drenażu zatoki klinowej. Początkowo, gdy u uczestnika wykonywano zarówno FNA, jak i biopsję, Ultra była wykonywana tylko na tkance, ale po 25 pacjentach zmieniono protokół i Ultra była wykonywana zarówno na FNA, jak i na tkance u tego samego pacjenta. Jeśli u pacjenta wykonano zarówno FNA, jak i biopsję rdzeniową, hodowla gruźlicy była wykonywana tylko na próbce tkanki. W przypadku Ultra na FNA, igła i strzykawka zostały przepłukane do sterylnego pojemnika zawierającego 2 mL soli fizjologicznej. Wymaz powietrzno-suchy na obecność AFBs był wykonywany przy łóżku chorego z drugiego FNA. W celu wykonania posiewu z FNA, aspirat był przepłukiwany na podłoże do hodowli prątków (Middlebrook 7H9 broth medium). Biopsja rdzeniowa była wykonywana za pomocą automatycznego pistoletu biopsyjnego (BARD Magnum™, CR Bard Inc., Covington, GA, USA) z igłą 14G. Jeśli węzeł chłonny nie był wyraźnie wyczuwalny palpacyjnie, biopsję wykonywano pod kontrolą ultrasonograficzną. Dwa lub trzy rdzenie wysyłano w formalinie do badania histologicznego (10-15 mm długości), dodatkowy rdzeń przecinano na pół sterylnym ostrzem i wysyłano na posiew i Ultra, oba w 2 ml 0,9% soli fizjologicznej. Jeśli wszystkie wykonane testy były niejednoznaczne, pacjent przechodził powtórną biopsję rdzeniową lub biopsję wycinającą, według uznania klinicysty prowadzącego leczenie.

Procedury badawcze

Badania laboratoryjne

FNA i próbki tkanek były transportowane w ciągu 2 godzin od pobrania do scentralizowanego laboratorium i przetwarzane indywidualnie przy użyciu standardowych protokołów przez przeszkolony personel laboratoryjny. Szkiełko wymazu wykonane przy łóżku pacjenta było badane metodą Ziehl-Neelsena (ZN) na obecność AFBs. Tkanka uzyskana w wyniku biopsji rdzeniowej została rozdrobniona przy użyciu tłuczka i moździerza. Niewielką jej część rozmazano na szkiełku i zbadano barwnikiem ZN na obecność AFBs. Hodowla prątków była wykonywana przy użyciu automatycznego systemu do hodowli prątków w płynie (BACTEC™ MGIT™ 960; Becton, Dickinson and Company, New Jersey, USA). Węzły chłonne uważane są za miejsce sterylne i nie przeprowadzano dekontaminacji przed biopsją płynną. Jeśli wynik MGIT był pozytywny, jedną kroplę inokulowano na 2% agarze z krwią i inkubowano przez 24 godziny w celu sprawdzenia wzrostu bakterii. Jeśli nie stwierdzono wzrostu bakterii, wynik MGIT był pozytywny dla prątków, próbka była odkażana wodorotlenkiem sodu (1%) i N-acety-L-cysteiną, a następnie wykonywano powtórną MGIT. Pozytywne izolaty z podłoża hodowlanego były identyfikowane przez barwienie metodą acid-fast, a następnie test MRTBDRplus (Hain LifeScience, Hehren, Niemcy) w celu potwierdzenia obecności M. tuberculosis oraz wrażliwości na rifampicynę i izoniazyd.

Dla testu Ultra, 1,4 mL odczynnika dodawano do 0,7 mL aspiratu lub rozdrobnionej próbki tkanki. Wyniki były raportowane jako: nieważne (nie wykryto wewnętrznej kontroli testu); niewykryte; lub wykryte (z półilościowym określeniem: śladowe, bardzo niskie, niskie, średnie lub wysokie) i oporność na rifampicynę (wykryta, niewykryta lub nieokreślona). Personel wykonujący Ultra był zaślepiony na kliniczne i inne wyniki mikrobiologiczne.

Przegląd histologiczny został wykonany przez wykwalifikowanego patologa anatomicznego, który był zaślepiony na wyniki ULTRA i nie miał dostępu do kultury, ale byłby w stanie zobaczyć wyniki AFBs na mikroskopii. Jeśli zidentyfikowano ziarniniaki, patolog wykonał oddzielne barwienie ZN i wykonano barwienie Periodic acid-Schiff (PAS) dla grzybów.

Definicje przypadków i analiza statystyczna

Przypisaliśmy uczestników do jednej z trzech kategorii diagnostycznych na podstawie badań klinicznych, histologicznych i mikrobiologicznych. Gruźlica definitywna (dodatni wynik hodowli na FNA/tkance dla M. tuberculosis LUB AFBs zidentyfikowane na FNA/tkance) Gruźlica prawdopodobna (brak innego rozpoznania, które tłumaczyłoby powiększenie węzłów chłonnych z jednym lub więcej z: makroskopowym złuszczaniem na FNA/tkance LUB gruźlicą potwierdzoną mikrobiologicznie w miejscu innym niż węzeł chłonny (np. płucny) LUB ziarniniakami na FNA/tkance). Trzecia kategoria nie była gruźlicą (nie spełniała kryteriów pozostałych dwóch kategorii). Dokładność diagnostyczna Ultra została również zgłoszona oddzielnie przy użyciu tylko dodatniej kultury jako standardu odniesienia.

Oszacowanie wielkości próby w badaniach dokładności diagnostycznej zależy od częstości występowania choroby. Spodziewaliśmy się wysokiej częstości występowania gruźlicy na podstawie przeprowadzonego przez nas badania pilotażowego biopsji rdzeniowej u pacjentów zakażonych HIV, z których 92% miało gruźlicze zapalenie węzłów chłonnych, ale odsetek pacjentów z gruźlicą w naszym badaniu był niższy niż oczekiwano (40%) w fazie pilotażowej naszego badania. Oszacowaliśmy, że czułość i swoistość Ultra wyniosłyby około 90% w oparciu o metaanalizę Cochrane . Przy 40% częstości występowania gruźlicy wielkość próby 87 jest potrzebna dla 95% CI o szerokości 10% oraz przy czułości i swoistości 90%. Zawyżyliśmy wielkość próby do 100 z powodu niepewności co do dokładności diagnostycznej Ultra.

Obliczyliśmy czułość, swoistość, ujemną wartość predykcyjną (NPV), dodatnią wartość predykcyjną (PPV) i racje prawdopodobieństwa, określając prawdziwe lub fałszywe wyniki dodatnie i prawdziwe lub fałszywe wyniki ujemne w stosunku do złożonego standardu referencyjnego prawdopodobnej lub definitywnej gruźlicy dla naszej analizy pierwotnej. Jako analizę drugorzędową określiliśmy również dokładność Ultra przy użyciu samej hodowli prątków jako standardu odniesienia. Dane wprowadzono do bazy danych REDCap® i analizowano przy użyciu pakietu oprogramowania STATAv14 (StataCorp, College Station, Texas, USA). Podstawowe charakterystyki kliniczne porównywano za pomocą testu chi-squared lub dokładnego testu Fishera dla zmiennych kategorycznych i testu Kruskala-Wallisa dla zmiennych ciągłych. Nieprawidłowe testy (tj. Ultra-error) liczono jako wyniki negatywne. Badanie to zostało przedstawione zgodnie z wytycznymi Standards for Reporting of Diagnostic Accuracy Studies .

.