Wprowadzenie

Każda technika mikroskopowa, w której cała próbka jest wystawiona na działanie światła, jest znana jako obrazowanie „szerokiego pola”. Odpowiednikiem widefield jest konfokalne, gdzie otwory są używane do blokowania większości światła do i z próbki. W tym artykule omówione zostanie obrazowanie szerokopolowe i najczęściej stosowane techniki szerokopolowe w mikroskopii.

Mikroskopy szerokopolowe

W mikroskopach szerokopolowych cała próbka jest oświetlana przez źródło światła z dołu (mikroskop pionowy) lub z góry (mikroskop odwrócony). Mikroskopy pionowe są często używane z nieruchomymi próbkami, takimi jak komórki lub tkanki, które zostały poddane obróbce i zamontowane na szkiełkach mikroskopowych, podczas gdy mikroskopy odwrócone są często lepsze do obrazowania próbki zanurzonej w cieczy, ponieważ zwykle opadają na dno i są łatwiejsze do oglądania od dołu za pomocą obiektywów mikroskopowych. Pozwala to na obrazowanie komórek w zawiesinie, ponieważ komórki badane w naukach przyrodniczych są zazwyczaj albo przylegające (rosną przytwierdzone do powierzchni) albo rosną w zawiesinie (komórki zawieszone w płynie). Przykłady mikroskopu pionowego i odwróconego można zobaczyć na Rys. 1.

Mikroskopy szerokopolowe zazwyczaj wykorzystują źródło białego światła (takie jak lampa) jest wystarczające z niektórymi filtrami do pracy z fluorescencją. To również sprawia, że obrazowanie prostsze i rozmiary plików obrazu mniejsze, co ułatwia pracę z szerokim polem do zastosowań takich jak dokumentacja komórki.

Techniki szerokiego pola

Przykłady technik mikroskopii szerokiego pola to jasne pole, różnicowy kontrast interferencyjny (DIC), kontrast fazowy i szerokie pole fluorescencji.

Mikroskopia jasnego pola jest dostępną formą mikroskopii, gdzie cała próbka jest oświetlona jasnym światłem. Takie podejście wymaga niewielkiego przygotowania próbki i może być stosowane do szybkiego i łatwego sprawdzenia żywych komórek lub do uzyskania dodatkowych danych. Jednakże, użycie środka kontrastowego jest wysoce zalecane, ponieważ większość próbek komórek jest przezroczysta i trudno będzie je uwidocznić bez barwnika. Komórki składają się głównie z wody i kiedy są obrazowane na przezroczystym szkle lub plastiku, może być trudno wyodrębnić mniejsze struktury bez dodatkowego kontrastu.

W przypadku różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC), próbka jest oświetlana światłem rozszczepionym na dwie spolaryzowane wiązki światła, kiedy te wiązki ponownie się łączą, różnice w przesunięciu fazowym pojawiają się jako kontrast w obrazie końcowym. Podobnie jak kontrast fazowy, technika ta nie jest odpowiednia dla grubszych próbek i wymaga więcej konfiguracji technicznej niż inne techniki.

Mikroskopia kontrastu fazowego zapewnia lepszy kontrast niż jasne pole poprzez wykorzystanie światła rozproszonego z próbki. Oświetlając próbkę pierścieniem światła i mając inny pierścień przed wizjerem mikroskopu, części próbki, które rozpraszają światło w różny sposób pojawiają się jako ciemniejsze lub jaśniejsze na obrazie, dając więcej kontrastu niż standardowa mikroskopia jasnego pola. Ten ulepszony kontrast nie jest widoczny na grubszych próbkach, ponieważ powoduje artefakty, ale sprawdza się dobrze w przypadku hodowli komórkowych. Przykład tych pierścieni można zobaczyć na Rys. 2.

Mikroskopia fluorescencyjna szerokiego pola jest podobna do mikroskopii jasnego pola, ale specyficzne długości fal światła są używane w celu wzbudzenia cząsteczek fluorescencyjnych, którymi próbka została wstępnie potraktowana (chociaż niektóre próbki są naturalnie autofluorescencyjne). Próbki mogą być barwione markerami fluorescencyjnymi dla specyficznych białek lub składników komórki, a następnie światło emisji fluorescencji z tych markerów tworzy obraz. Sygnał fluorescencji oznacza, że istnieje lepszy kontrast w porównaniu z innymi technikami, ponieważ dzięki zastosowaniu światła o określonej długości fali tylko cząsteczki fluorescencyjne emitują światło, w przeciwieństwie do całego obrazu, który jest oświetlony. Jednakże, ponieważ cała próbka jest oświetlana przy użyciu tego światła, sygnały fluorescencji spoza obszaru widzenia mogą powodować fluorescencję tła i zamazane obrazy.

Out-Of-Focus Light

Główną wadą jest to, że ponieważ cała próbka jest oświetlana, podczas gdy płaszczyzna ogniskowa otrzymuje światło i może generować obraz, płaszczyzny powyżej i poniżej płaszczyzny ogniskowej również otrzymują światło, co skutkuje nieostrym światłem powodującym degradację obrazu. Szczególnie w przypadku wzbudzania fluorescencji, rozdzielczość systemu szerokopolowego jest ograniczona z powodu fluorescencji tła, która jest również rejestrowana przez kamerę i zmniejsza stosunek sygnału do szumu.

Niektóre techniki szerokopolowe unikają tego problemu, takie jak mikroskopia strukturalnego oświetlenia (SIM), która wykorzystuje wzory światła w celu wygenerowania złożonego wzoru, obrazowanie oparte na interferencji wzoru pozwala na super-rozdzielcze poziomy szczegółów, rozwiązując obiekty tak małe jak 200 nm. Więcej na temat SIM można przeczytać w przypisie do SIM na naszej stronie internetowej.

Podsumowanie

Obrazowanie szerokiego pola jest podstawą większości badań komórkowych, pozwalając badaczom na szybkie i łatwe obrazowanie próbek przy niskim poziomie przygotowania próbki lub wymaganej wiedzy technicznej. Od jasnego pola do fluorescencji, obrazowanie szerokopolowe jest potężną i zróżnicowaną techniką, z którą wielu badaczy jest zaznajomionych. Chociaż technika ta może nie mieć odpowiedniej rozdzielczości w porównaniu z mikroskopią konfokalną lub innymi zaawansowanymi aplikacjami mikroskopowymi, obrazowanie w polu szerokim ma ugruntowaną pozycję w badaniach i z czasem będzie się nadal rozwijać.