Factor Xa: Structuur en bindingsplaatsenEdit

3D-structuur van factor Xa

Factoren IIa, Xa, VIIa, IXa en XIa zijn allemaal proteolytische enzymen die een specifieke rol spelen in de stollingscascade. Factor Xa (FXa) is het meest veelbelovend vanwege zijn positie op het kruispunt van de intrinsieke en extrinsieke pathway en omdat het voor elke Xa-molecule ongeveer 1000 trombinemoleculen genereert, hetgeen resulteert in een krachtig anticoagulerend effect. FXa wordt uit FX gegenereerd door splitsing van een 52 aminozuren tellend activeringspeptide, aangezien de “a” in factor Xa staat voor geactiveerd. FXa bestaat uit een katalytisch domein van 254 aminozuren en is tevens gekoppeld aan een lichte keten van 142 aminozuren. De keten bevat zowel GLA-domeinen als twee epidermale groeifactor domeinen (EGF-achtige domeinen).

De actieve site van FXa is gestructureerd om de splitsing van fysiologische substraten te katalyseren en klieft PhePheAsnProArg-ThrPhe en TyrIleAspGlyArg-IleVal in protrombine. FXa heeft vier zogeheten pockets die als doelwit dienen voor substraten om zich aan factor Xa te binden. Deze pockets zijn omgeven door verschillende aminozuren en Xa-remmers richten zich op deze pockets wanneer zij aan factor Xa binden. De twee meest relevante pockets wat betreft affiniteit en selectiviteit voor de Xa-remmers zijn S1 en S4.

S1: De S1 pocket is een hydrofobe pocket en bevat een asparaginezuur residu (Asp-189) dat kan dienen als een herkenningsplaats voor een basische groep. FXa heeft een restruimte in de S1-zak en wordt bekleed door residuen Tyr-228, Asp-189 en Ser-195.

S2: De S2-zak is een kleine en ondiepe zak. Het versmelt met de S4 zak en heeft ruimte voor kleine aminozuren. Tyr-99 lijkt de toegang tot deze zak te blokkeren, dus deze zak is niet zo belangrijk als S1 en S4.

S3: De S3-zak bevindt zich op de rand van de S1-zak en is plat en blootgesteld aan het oplosmiddel. Deze zak is niet zo belangrijk als S1 en S4.

S4: De S4-zak is hydrofoob van aard en de bodem van de zak wordt gevormd door Trp-215 residu. De residuen Phe-174 en Tyr-99 van FXa vormen samen met Trp-215 een aromatische doos die in staat is om alifatische, aromatische en positief geladen fragmenten te binden. Vanwege de binding aan positief geladen entiteiten, kan het worden beschreven als een kationgat.

Chemische structuur en eigenschappen van directe Xa-remmersEdit

De structuur van apixaban, edoxaban en rivaroxaban. Momenteel bestaande directe Xa-remmers

Binding van Xa-remmers aan factor XaEdit

De Xa-remmers binden zich allemaal op een zogenaamde L-vormige manier binnen de actieve site van factor Xa. De belangrijkste bestanddelen van de factor Xa zijn de bindingsplaatsen S1 en S4. Eerst werd vastgesteld dat de natuurlijke verbindingen, antistasine en TAP, die sterk polaire en dus geladen componenten bezitten, zich met enige specificiteit aan het doel binden. Daarom werden nieuwere geneesmiddelen ontworpen met positief geladen groepen, maar die leidden tot een slechte biologische beschikbaarheid. De tegenwoordig op de markt gebrachte Xa-remmers bevatten daarom een aromatische ring met daaraan verschillende verbindingen voor verschillende interacties met de S1- en S4-bindingsplaatsen. Dit zorgt ook voor een goede biologische beschikbaarheid, terwijl de bindingssterkte stevig blijft. De Xa-remmers die momenteel op de markt zijn, berusten daarom op hydrofobe en waterstofbruggen in plaats van op sterk polaire interacties.

Binding van antistasine aan factor XaEdit

Antistasine bevat een N- en een C-terminaal domein die in hun aminozuursequenties vergelijkbaar zijn met ~40% identiteit en ~56% homologie. Elk van hen bevat een korte β-sheet structuur en 5 disulfide bindingen. Alleen het N-terminale domein is nodig om Xa te remmen, terwijl het C-terminale domein niet bijdraagt aan de remmende eigenschappen als gevolg van verschillen in de 3-dimensionale structuur, ook al heeft het C-terminale domein een sterk analoog patroon met de eigenlijke actieve site.

Bij de interactie van antistasine met FXa zijn zowel de actieve site als het inactieve oppervlak van FXa betrokken. De reactieve plaats van antistasine gevormd door Arg-34 en Val-35 in het N-terminale domein past bij de bindingsplaats van FXa, hoogstwaarschijnlijk de S1 pocket. Tegelijkertijd past Glu-15, gelegen buiten de reactieve plaats van antistasine, bij positief geladen residuen op het oppervlak van FXa. De meervoudige binding is thermodynamisch voordelig en leidt tot sub-nanomolaire remming (Ki = 0,3-0,6 nM).

DX-9065a binding aan factor XaEdit

DX-9065a, de eerste directe Xa-remmer op basis van kleine moleculen, is een amidinoarylderivaat met een molecuulgewicht van 571,07g/mol. De positief geladen amidinonaphtaleengroep vormt een zoutbrug naar het Asp-189-residu in de S1-zak van FXa. De pyrrolidine ring past tussen Tyr-99, Phe-174 en Trp-215 in de S4 pocket van FXa.

In tegenstelling tot oudere geneesmiddelen, bijvoorbeeld heparine, is DX-9065a selectief voor FXa in vergelijking met trombine, ook al zijn FXa en trombine vergelijkbaar in hun structuur. Dit wordt veroorzaakt door een verschil in het aminozuurresidu op homologe positie 192. Terwijl FXa op die positie een glutamine residu heeft, heeft trombine een glutaminezuur dat elektrostatische afstoting veroorzaakt met de carboxylgroep van DX-9065a. Bovendien vermindert een zoutbrug tussen Glu-97 van trombine en de amidinegroep die vastzit in de pyrrolidine ring van DX-9065a de flexibiliteit van het DX-9065a molecuul, dat nu niet genoeg kan roteren om de elektrostatische botsing te vermijden. Daarom is de IC50-waarde voor trombine >1000µM terwijl de IC50-waarde voor FXa 0,16µM is.

De binding van rivaroxaban aan pockets S1 en S4 van Factor Xa. Er worden twee waterstofbruggen gevormd die een belangrijke rol spelen bij de geleiding van rivaroxaban naar de S1- en S4-subruimte. Door deze waterstofbruggen vormt rivaroxaban een L-vorm en past het in de pockets. De chloorsubstituent van het geneesmiddel heeft een wisselwerking met Tyr-228 in de S1-pocket, waardoor rivaroxaban een goede orale biologische beschikbaarheid en werkzaamheid kan bereiken.

Rivaroxaban bindt aan factor XaEdit

Rivaroxaban bindt aan FXa door middel van twee waterstofbruggen met het aminozuur Gly-219. Deze twee waterstofbruggen hebben een belangrijke functie bij het binden van rivaroxaban aan factor XaEdit

Rivaroxaban bindt aan FXa door middel van twee waterstofbruggen met het aminozuur Gly-219. Deze twee waterstofbruggen spelen een belangrijke rol bij het leiden van het geneesmiddel naar de S1- en S4-subsites van FXa. De eerste waterstofbrug is een sterke interactie die afkomstig is van de carbonylzuurstof van de oxazolidinon kern van rivaroxaban. De tweede waterstofbrug is een zwakkere interactie en is afkomstig van de aminogroep van het clorothiofeencarboxamidegedeelte.

Deze twee waterstofbruggen hebben tot gevolg dat het geneesmiddel een L-vorm vormt en in de S1- en S4-zakken past. De aminozuurresiduen Phe-174, Tyr-99, en Trp-215 vormen een smal hydrofoob kanaal dat de S4-bindingszak vormt. Het morfolinon gedeelte van rivaroxaban is “ingeklemd” tussen de aminozuren Tyr-99 en Phe-174 en de aryl ring van rivaroxaban is loodrecht georiënteerd over Trp-215. De morfolinon-carbonylgroep heeft geen directe interactie met de FXa-ruggengraat, maar draagt bij tot een planarisering van de morfolinonring en ondersteunt daardoor rivaroxaban om tussen de twee aminozuren te worden ingeklemd.

De interactie tussen de chloorsubstituent van het thiofeengedeelte en de aromatische ring van Tyr-228, die zich onderaan de S1 bevindt, is zeer belangrijk omdat hierdoor sterk basische groepen niet nodig zijn voor een hoge affiniteit voor FXa. Hierdoor kan rivaroxaban, dat niet-basisch is, een goede orale biologische beschikbaarheid en potentie bereiken.

De binding van apixaban aan pockets S1 en S4 van Factor Xa. Het pyrazool N-2-stikstofatoom van apixaban interageert met het aminozuur Gln-192 in de S4-zak. De carbonylzuurstof heeft een wisselwerking met Gly-216 van de S1-pocket en met een watermolecuul.

Apixaban bindt aan factor XaEdit

Apixaban vertoont een soortgelijke bindingswijze als rivaroxaban en vormt een hecht remmer-enzymcomplex wanneer het aan FXa wordt gekoppeld. De p-methoxygroep van apixaban verbindt zich met de S1-zak van FXa, maar lijkt geen interactie te hebben met residuen in deze regio van FXa. Het pyrazool N-2 stikstofatoom van apixaban heeft een wisselwerking met Gln-192 en de carbonylzuurstof heeft een wisselwerking met Gly-216. De fenyllactamgroep van apixaban is gepositioneerd tussen Tyr-99 en Phe-174 en door zijn oriëntatie is het in staat tot interactie met Trp-215 van de S4-zak. De carbonylzuurstofgroep van de lactamgroep interageert met een watermolecuul en lijkt met geen enkel residu in de S4-zak te interageren.

De SAR van rivaroxaban met inbegrip van de laatste moieties. Tijdens de SAR-tests werd R1 gedefinieerd als de belangrijkste groep voor de potentie. Pyrrolidinon was de eerste functionele groep R1 die de potentie significant verhoogde, maar uit verder onderzoek bleek een nog hogere potentie met een morfolinon-groep in de plaats. Aan de groepen R2 en R3 was waterstof of fluor toegevoegd en al snel bleek dat waterstof de hoogste potentie opleverde

Structuur-activiteitsrelatie (SAR)

Een belangrijk onderdeel van het ontwerpen van een verbinding die een ideale remmer is voor een bepaald doelwit, is het begrijpen van de aminozuursequentie van de doelplaats waaraan de verbinding moet binden. Modellering van zowel protrombine als FXa maakt het mogelijk het verschil af te leiden en de aminozuren op elke bindingsplaats te identificeren. Onderaan de S1-zak op FXa is het bindende aminozuur Asp-189 waaraan amidinegroepen kunnen binden. Na röntgenopnamen van de bindingsplaats van FXa bleek dat de S1-zak een vlakke vorm had, wat betekent dat een vlakke amidinoarylgroep zich er zonder sterische hinder aan zou moeten binden.

Moderne directe Xa-remmers zijn L-vormige moleculen waarvan de uiteinden perfect in de S1- en S4-zakken passen. De lange zijde van de L-vorm moet zich voegen naar een zeer specifieke tunnel in de actieve plaats van het doelwit. Om dat te bereiken is dit deel van de moleculen zo ontworpen dat er in dat gebied weinig formele interacties met FXa zijn. Aangezien er geen specifieke binding is, verhoogt de passing van deze middelen tussen de pockets van FXa de totale specificiteit van de geneesmiddelen voor het FXa-molecuul. De interactie tussen de S1-pocket van FXa en de remmer kan zowel ionisch als niet-ionisch zijn, wat belangrijk is omdat het ontwerp van de molecule daardoor kan worden aangepast om de orale biologische beschikbaarheid te verhogen. Eerder ontworpen verbindingen waren geladen moleculen die niet goed worden geabsorbeerd in het maagdarmkanaal en daardoor geen hoge serumconcentraties bereikten. De nieuwere geneesmiddelen hebben een betere biologische beschikbaarheid omdat zij niet geladen zijn en een niet-ionische interactie hebben met de S1 pocket.

Rivaroxaban

Tijdens de SAR-ontwikkeling van rivaroxaban realiseerden onderzoekers zich dat door toevoeging van een 5-chloorthiofeen-2-carboxamidegroep aan de oxazolidoninekern de potentie met een factor 200 kon worden verhoogd, die voorheen te zwak was voor medisch gebruik. Naast deze ontdekking werd een duidelijke voorkeur voor de (S)-configuratie bevestigd. Deze verbinding had een veelbelovend farmacokinetisch profiel en bevatte geen sterk basische amidinegroep, die eerder als belangrijk werd beschouwd voor de interactie met de S1-zak. Deze bevindingen leidden tot uitgebreid SAR (structuur-activiteitsrelatie) onderzoek. Tijdens de SAR-tests werd R1 gedefinieerd als de belangrijkste groep voor potentie. Pyrrolidinon was de eerste functionele groep R1 die de potentie significant verhoogde, maar verder onderzoek toonde een nog hogere potentie met een morfolinon-groep in de plaats. Aan de groepen R2 en R3 was waterstof of fluor toegevoegd en al snel bleek dat waterstof de hoogste potentie opleverde. De groepen R2 en R3 werden vervolgens gesubstitueerd door verschillende groepen, die alle minder potent waren dan de waterstof, zodat waterstof het eindresultaat was. Aangezien het chloorthiofeengedeelte onvoldoende oplosbaar was in water, werd geprobeerd het te vervangen door een andere groep, maar zonder succes. Het chloorthiofeengedeelte bindt aan Tyr-228 onderaan de S1-zak, waardoor het een sleutelfactor is voor de binding aan FXa. Rivaroxaban heeft zowel een hoge affiniteit als een goede biologische beschikbaarheid.

De structuur van apixaban, voor het aanpassen van de moiety’s voor maximale potentie

Apixaban

De 13F moiety intermediair voordat apixaban volledig was ontwikkeld

Tijdens de SAR-ontwikkeling van apixaban waren er drie groepen die getest moesten worden om maximale potentie en biobeschikbaarheid te bereiken. De eerste groep die moest worden getest was de niet-werkzame plaats, omdat deze moet worden gestabiliseerd voordat de SAR-tests op de p-methoxyfenylgroep (het S1-bindende deel) kunnen worden uitgevoerd. Er zijn verschillende groepen die de potentie van de verbinding verhogen, voornamelijk amiden, amines en tetrazolen, maar ook methylsulfonyl- en trifluormethylgroepen. Van deze groepen heeft carboxamide de grootste binding en had een vergelijkbare stollingsactiviteit als de verbindingen.

In proeven met honden vertoonde deze verbinding met een carboxamidegroep, 13F genaamd, een geweldig farmacokinetisch profiel, een lage klaring en een adequate halfwaardetijd en distributievolume. Vanwege het succes van het vinden van een stabiliserende groep, werd het SAR-onderzoek voor S1-bindende groep (p-methoxyphenyl) stopgezet. In de S4-bindende groep bleken N-methylacetyl- en lactam-analogen een zeer hoge bindingsaffiniteit te hebben voor FXa, vertoonden een grote stolling en selectiviteit ten opzichte van andere proteasen. Oriëntatie bleek belangrijk te zijn aangezien N-methylacetyl, in vergelijking met acetamide, een 300 maal lager bindend vermogen aan FXa had als gevolg van ongunstige planariteit dicht bij de S4 regio bindingsplaats.

SyntheseEdit

RivaroxabanEdit

Rivaroxaban behoort chemisch tot de groep van n-aryloxazolidinonen. Andere geneesmiddelen van die groep zijn linezolid en tedizolid, die beide antibiotica zijn. Een synthese van n-aryloxazolidinonen beginnend met een door O-silyl beschermd ethyl(2,3-dihydroxypropyl)-carbamaat werd in 2016 gepubliceerd. In een één-pot-reactie cycliseert het carbamaat tot een 2-oxazolidon-ring onder licht basische omstandigheden, terwijl tegelijkertijd de oxazolidon-stikstof wordt gearyleerd door koper-katalisatie. Voor rivaroxaban in het bijzonder vervangt 3-morfolinon het jood in de p-positie van de benzeenring door koper-katalisatie. Daarna wordt de beschermende silylgroep verwijderd en wordt de resulterende alcohol vervangen door een aminogroep die vervolgens in de laatste stap wordt gecyleerd.

Een industriële bereiding van rivaroxaban is in 2005 als octrooi geregistreerd door Bayer Healthcare. Het begint met N-(4-aminofenol)-morfolinon dat wordt gealkyleerd door een propyleenoxidederivaat dat ook een primair amine bevat dat betrokken is bij een ftalimidebeschermingsgroep. Vervolgens wordt een fosgeen-equivalent toegevoegd om de 2-oxazolidonring te vormen en wordt het ftalimide verwijderd. Het vrije amine kan nu worden gecyleerd, wat leidt tot rivaroxaban.

De synthese heeft volgens het octrooi echter “verschillende nadelen in het reactiemanagement, wat bijzonder ongunstig is voor de bereiding”. Het octrooi geeft ook uitleg over een andere synthese uitgaande van een chloorthiofeenderivaat die meer geschikt zou zijn voor het industriële proces, maar wijst erop dat giftige oplosmiddelen of reagentia uit het eindproduct moeten worden verwijderd. Daarom is deze manier geen alternatief.

Verschillende andere synthesetrajecten van rivaroxaban zijn beschreven.

Synthese van rivaroxaban zoals gepatenteerd door Bayer Healthcare in 2005.
1e stap: Alkylering van het primaire aromatische amine
2e stap: Vorming van de 2-oxazolinidonring, met behulp van een fosgenequivalent
3e stap: Verwijdering van de ftalimide-beschermgroep
4e stap: Acylering van het primaire amine

ApixabanEdit

De eerste volledige synthese van apixaban werd in 2007 gepubliceerd. De belangrijkste stap van deze reactie is een (3+2)cycloadditie van een p-methoxyfenylchloorhydrazon derivaat en een p-iodofenyl-morfolin-dihydropyridin derivaat. Na de daaropvolgende eliminatie van HCl en morfoline wordt het jood gesubstitueerd door 2-piperidinon door koper-katalisatie en wordt de ethylester omgezet in een amide (aminolyse). Deze reactie werd in 2009 als octrooi geregistreerd.

Synthese van apixaban, zoals gepubliceerd door Pinto, et al. in 2007. De belangrijkste stap is een (3+2)cycloadditie van het p-methoxyfenylchloorhydrazon derivaat en het p-iodofenyl-morfolin-dihydropyridin derivaat in de eerste reactie.