3.06.4.1.1 Saccharomyces yeast

I primi studi avevano dimostrato che il lievito Saccharomyces può fermentare lo xylulose in etanolo, anche se non in modo efficiente. Quindi, teoricamente, al lievito Saccharomyces manca solo l’enzima (o gli enzimi) per convertire lo xilosio in xilulosio. Come descritto sopra, i batteri convertono lo xilosio in xilulosio con un singolo enzima che non richiede cofattori (Figura 3). Al contrario, il sistema xilosio-xilulosio del lievito richiedeva due enzimi che non sono metabolicamente ideali come descritto sopra. Inizialmente, quasi 10 diversi laboratori in tutto il mondo hanno tentato di clonare un gene della xilosio isomerasi batterica nel lievito. Ho et al. della Purdue University sono stati il primo gruppo a realizzare la clonazione del gene della xilosio isomerasi da Escherichia coli. Tuttavia, la proteina sintetizzata nel lievito dal gene batterico clonato non aveva attività di xilosio isomerasi.

Un secondo approccio fu quello di clonare i geni XR e XD di P. stipitis nel lievito Saccharomyces. Tuttavia, la cinetica di questi enzimi e l’equilibrio termodinamico della reazione favoriscono la produzione di xilitolo invece di etanolo. All’inizio degli anni ’90, tre gruppi (Kotter, Ciriacy e colleghi dell’Università di Dusseldorf, Tantirungkij e colleghi dell’Università di Osaka, e Hahn-Hägerdal e colleghi dell’Università di Lund) hanno riportato la riuscita clonazione dei geni XR e XD nel lievito Saccharomyces per renderlo capace di fermentare lo xilosio. Tuttavia, il lievito ricombinante sviluppato da questi gruppi fermentava lo xilosio molto lentamente e produceva poco etanolo; il principale prodotto metabolico era lo xilitolo.

Il gruppo di Ho ha ipotizzato che la sovraespressione della xilulokinasi nativa (XK) insieme a XR e XD da P. stipitis avrebbe migliorato il flusso di xilosio attraverso il metabolismo in etanolo, abbassando la concentrazione intracellulare di xilulosio. Poiché la xilulokinasi catalizza una reazione irreversibile verso la produzione di etanolo (Figura 3), un’elevata attività della xilulokinasi risulterà in basse concentrazioni di xilulosio. Questo è auspicabile perché l’equilibrio della reazione catalizzata XD favorisce lo xilitolo, e basse concentrazioni di xilulosio allo stato stazionario sono necessarie per dirigere il flusso metabolico nella direzione della produzione di etanolo. Inoltre, la clonazione di questi tre geni ha permesso di controllare la loro espressione nella cellula. Sotto il sistema nativo di controllo dell’espressione della cellula, la loro espressione è indotta dalla presenza di xilosio ed è inibita dal glucosio. Il lievito ricombinante risultante potrebbe essere in grado di co-fermentare simultaneamente glucosio e xilosio in etanolo senza il lungo periodo di ritardo tra la fermentazione del glucosio e dello xilosio, il che sarebbe estremamente auspicabile per la produzione industriale di etanolo.

Nel 1989, il gruppo Ho di Purdue ha riportato per la prima volta la clonazione del gene della xilulokinasi del lievito Saccharomyces. Successivamente, il gruppo di Ho ha sostituito le sequenze di DNA a monte dei geni strutturali XR, XD e XK con sequenze a monte dei geni glicolitici contenenti promotori costitutivi efficaci. I geni XR, XD e XK risultanti sono stati clonati su un plasmide ad alto numero di copie 2μ e il plasmide risultante, pLNH32, è stato utilizzato per trasformare un ceppo di lievito Saccharomyces industriale wild-type noto per essere superiore per la produzione di etanolo utilizzando amido (glucosio) come materia prima. Nel 1993, lo stesso gruppo ha riportato il successo dello sviluppo del lievito ricombinante Saccharomyces 1400 (pLNH32) che potrebbe fermentare alte concentrazioni di xilosio quasi completamente in etanolo con pochissimo xilitolo come sottoprodotto. Inoltre, il lievito risultante potrebbe co-fermentare glucosio e xilosio in etanolo senza un gran periodo di ritardo tra la fermentazione di questi due zuccheri, anche se la velocità di fermentazione dello xilosio è più lenta di quella del glucosio (Figura 4). Successivamente, sono stati riportati i dettagli della costruzione e dello sviluppo del 1400 (pLNH 32). Da allora, il gruppo Ho ha continuato a migliorare il lievito con vari approcci innovativi come descritto di seguito.

Figura 4. (A sinistra) Ceppo di lievito Saccharomyces 1400 trasformato con il plasmide padre di pLNH32 che non contiene i geni XR, XD o XK o che contiene solo XR e XD, ma non XK, usato per fermentare una miscela di glucosio e xilosio. (A destra) Lievito 1400 trasformato con il plasmide pLNH32, contenente i geni XR, XD e XK clonati. Il lievito è stato usato per fermentare glucosio e xilosio in condizioni identiche ai risultati descritti nella figura di sinistra. I geni clonati in questi plasmidi sono stati modificati e costruiti in modo identico come descritto in riferimento 9.

Il plasmide 2 μ, pLNH32, contenente il gene clonato XR-XD-XK è un plasmide ospite ampio progettato per essere in grado di trasformare qualsiasi ceppo di lievito Saccharomyces, compreso il lievito industriale wild-type Saccharomyces. Un tale plasmide può essere usato per selezionare ospiti migliori per la produzione di etanolo cellulosico. Il gruppo Ho ha anche sviluppato una nuova tecnica unica di integrazione genica che facilita l’effettiva integrazione di più geni nel cromosoma del lievito in copie multiple. Questa tecnica è facile da eseguire e garantisce quasi che i geni clonati sul plasmide di integrazione e trasformati nelle cellule di lievito ospite possano essere integrati nel genoma ospite in tante copie quante desiderate per fornire le migliori attività (Figura 5). Questa tecnica di integrazione è stata utilizzata per sviluppare il ceppo 1400 stabile che fermenta lo xilosio, 1400 (LNH-ST), integrando prima i geni XR-XD-XK insieme come una cassetta nel cromosoma del lievito in copie sufficienti fino a quando il lievito risultante ha fermentato lo xilosio alla massima efficienza (Figura 6). L’attuale miglior ceppo sviluppato dal gruppo Ho, 424A (LNH-ST), è stato selezionato tra 10 diversi ceppi di lievito Saccharomyces trasformando prima ogni ceppo con il plasmide 2 μ pLNH32 per assicurarsi che questi ceppi fossero in grado di fermentare lo xilosio e di co-fermentare efficacemente il glucosio/xilosio in presenza di pLNH32, seguito dall’integrazione dei geni nei cromosomi dei ceppi di lievito selezionati per sviluppare il “lievito stabile” con questa nuova tecnica di integrazione. La co-fermentazione di glucosio/xilosio da parte del 424A (LNH-ST) è mostrata nella Figura 7.

Figura 5. Dimostrazione dell’integrazione graduale di copie multiple dei geni XR-XD-XK nei cromosomi del ceppo 259 del lievito Saccharomyces con il metodo descritto in Ho et al. Lievito a diversi stadi di integrazione sono stati utilizzati per fermentare glucosio e xilosio in condizioni identiche per dimostrare il progresso di integrazione di questi geni: a) Allo stadio iniziale di integrazione, b) 25% di completamento, c) 50-75% di completamento, d) dopo il completamento di integrazione. Il completamento dell’integrazione si riflette nelle cellule del processo di integrazione che producono gli stessi risultati di fermentazione per un periodo di tempo sufficientemente lungo.

Figura 6. Co-fermentazione di glucosio e xilosio con 1400 (LNH-ST) contenente copie multiple dei geni XR-XD-XK integrati nei cromosomi del lievito con il metodo di Ho et al.

Figura 7. Co-fermentazione di glucosio e xilosio con 424A (LNH-ST) ceppo Saccharomyces ricombinante contenente copie multiple di XR-XD-XK geni integrati nei cromosomi di lievito Saccharomyces ceppo 424A con metodo di Ho et al. Questo è il miglior lievito Ho-Purdue sviluppato alla Purdue University prima del 2007 e attualmente fornito all’industria per la produzione di etanolo cellulosico.

Se un microrganismo ricombinante viene utilizzato per la produzione industriale su larga scala, come per la produzione di etanolo, è necessario integrare i geni da clonare nei cromosomi dell’ospite per due ragioni fondamentali. Uno è che se i geni clonati sono integrati nei cromosomi dell’ospite con un metodo affidabile, i geni clonati possono essere mantenuti sul cromosoma dell’ospite senza richiedere l’uso di prodotti chimici speciali, media, antibiotici e additivi. Il requisito di prodotti chimici o antibiotici per mantenere i tratti non solo aggiunge il costo dei prodotti chimici, ma aggiunge anche il costo e la difficoltà nel processo di approvazione normativa e la pulizia di eventuali effluenti. Anche in presenza di un agente selettivo, i plasmidi ad alto numero di copie, come pLNH32, usati per clonare i geni nelle cellule ospiti, potrebbero non essere in grado di sostenere operazioni industriali su larga scala. Il gruppo di Ho ha dimostrato che il lievito stabile sviluppato utilizzando il nuovo sistema di integrazione, 1400 (LNH-ST), era in grado di sostenere la fermentazione continua di idrolizzati di stover di mais in etanolo in un impianto pilota, mentre lo stesso ceppo di lievito contenente il plasmide, 1400 (pLNH32), non era in grado di farlo.

Il ceppo 424A (LNH-ST) e altri ceppi stabili, 1400 (LNH-ST) e 259 (LNH-ST), sviluppati con la nuova tecnica di integrazione, sono stati tutti convalidati da altri e hanno dimostrato di essere sostenibili ed efficaci per la produzione di etanolo cellulosico con idrolizzati da diverse materie prime lignocellulosiche. Il ceppo 424A (LNH-ST) è stato anche utilizzato industrialmente per la produzione di etanolo cellulosico da residui agricoli in un impianto dimostrativo dal 2004.

Il lievito ricombinante sviluppato da Hahn-Hägerdal è stato ampiamente migliorato con la clonazione di diversi geni aggiuntivi, compresa la clonazione del gene della xilulokinasi dopo che il gruppo Ho della Purdue University ha dimostrato che una maggiore espressione di questo gene nativo migliora la resa di etanolo dallo xilosio.

Il lievito sviluppato dal gruppo Ho della Purdue è disponibile per la produzione industriale di etanolo cellulosico. Probabilmente avrà buone possibilità di successo, poiché è un lievito industriale che produce etanolo, ed è stato ampiamente testato. Recentemente, il gruppo di Purdue ha continuato a migliorare il ceppo facendolo co-fermentare l’arabinosio con gli altri quattro zuccheri (glucosio, xilosio, mannosio e galattosio), e rendendolo più resistente all’etanolo e all’acido acetico.

Anche se il primo tentativo di sviluppare un lievito Saccharomyces xilosio-fermentante a base di isomero di xilosio non ha avuto successo ed è stato sviluppato un efficace lievito xilosio-fermentante ingegnerizzato a base di XR/XD, l’interesse nello sviluppo di un lievito xilosio-fermentante a base di isomero di xilosio è continuato negli anni, in parte, perché questo percorso non ha uno squilibrio redox. Nel 2009, Brat et al. hanno costruito S. cerevisiae xilosio-fermentanti usando xilosio isomerasi da Closteidium phytofermentans. Sempre nel 2009, Cargill ha riportato lo sviluppo di un ceppo di lievito non-Saccharomyces che esprime la xilosio isomerasi ed è in grado di fermentare in modo efficiente una miscela di glucosio e xilosio a basso pH e in presenza dell’1% di acido acetico.

Anche se l’arabinosio è presente solo in piccole quantità nella biomassa delle erbe come parte dell’emicellulosa GAX, alcune fonti speciali di biomassa come la fibra di mais contengono quantità relativamente grandi di arabinosio. Tuttavia, è ideale avere i microbi produttori di etanolo cellulosico in grado di fermentare tutte e cinque le diverse molecole di zucchero presenti nella biomassa cellulosica, in quanto il riciclaggio dei flussi di processo all’interno di un processo industriale può aumentare la concentrazione di componenti minori.

Il meccanismo del metabolismo dell’arabinosio nei microrganismi è complicato come quello dello xilosio. Di nuovo, il meccanismo del metabolismo dell’arabinosio nel lievito è diverso da quello dei batteri. Simile al metabolismo dello xilosio, il meccanismo metabolico del lievito non favorisce il metabolismo anaerobico. Recentemente, Hahn-Hägerdal e collaboratori hanno ulteriormente ingegnerizzato il loro lievito Saccharomyces xilosio-fermentante per co-fermentare l’arabinosio con xilosio e altri zuccheri attraverso il percorso fungino l-arabinosio. Tuttavia, il lievito ingegnerizzato risultante non era ancora in grado di fermentare l’arabinosio in una quantità significativa di etanolo, ma era in grado di convertire una piccola quantità di arabinosio in arabitolo.