Per colmare la grande distanza evolutiva tra i vertebrati attuali e il cordato ancestrale con un genoma non duplicato, Sacerdot e colleghi hanno prima ricostruito il genoma ancestrale degli amnioti. Per farlo, hanno prima applicato l’algoritmo AGORA (Algoritmo per la ricostruzione dell’ordine dei geni negli antenati) che avevano precedentemente sviluppato agli ordini dei geni, agli orientamenti e agli alberi genici di 61 genomi di animali estinti dal database Ensembl. Questi includevano 40 mammiferi, 3 uccelli, 2 rettili, 1 anfibio, 8 teleostei, 1 celacanto, 2 tunicati, 1 nematode e 1 mosca. Sfortunatamente, Ensembl non include il genoma di nessun pesce cartilagineo (per esempio lo squalo elefante, Callorhinchus milii, un chimera, che ha il genoma di vertebrato a più lenta evoluzione conosciuto), o quelli di emicordati, echinodermi o cefalochordati – deuterostomi invertebrati i cui genomi non hanno subito la considerevole perdita e compattazione genica caratteristica dei genomi di tunicati.

Sacerdot et al. hanno poi identificato coppie di geni ohnolog putativi in questo genoma ancestrale di amnioti e hanno prodotto serie di Regioni Ancestrali Contigue (CAR). Gli ohnologs sono geni omologhi all’interno di una specie risultanti da WGDs. Infine, hanno raggruppato questi CARs in un insieme di 51 che sono caduti significativamente in 17 gruppi di quattro, o tetradi; il risultato atteso di due cicli di WGD. Per distinguere il modello di fusioni e fissioni cromosomiche durante l’evoluzione, hanno voluto confrontare queste 17 tetradi con l’organizzazione dei geni in un genoma pre-vertebrato non duplicato. Tuttavia, i genomi dei tunicati si stanno evolvendo molto rapidamente e sono abbastanza divergenti da quelli di altri deuterostomi invertebrati, mentre l’insieme del genoma pubblicato del cefalochordato Branchiostoma floridae è troppo frammentato per l’analisi. Pertanto, gli autori hanno confrontato le loro 17 tetradi di CARs con i 17 gruppi di collegamento ancestrali dei cordati precedentemente determinati dal confronto della sintenia dei geni sui cromosomi umani e sulle impalcature del genoma di B. floridae. Notevolmente, ognuno di questi gruppi di collegamento dei cordati era correlato a una tetrade CAR predominante. Hanno concluso da questo confronto che il genoma del vertebrato ancestrale aveva 17 cromosomi che poi si sono duplicati in 34 cromosomi attraverso un giro di WGD (1R). Successivamente, ci sono state 7 fusioni cromosomiche che hanno portato a 27 cromosomi, che all’origine dei vertebrati, prima della scissione agnathan/gnathosome, si sono duplicati di nuovo (2R WGD) in 54 cromosomi. Dopo la 2R WGD, ci sono state altre quattro fusioni prima del vertebrato osseo ancestrale seguito da una quinta fusione prima della base degli amnioti. Così, il cariotipo ancestrale dei vertebrati ossei comprendeva 50 cromosomi e l’amniota ancestrale aveva 49 cromosomi (Fig. 1b).

Oltre a ricostruire duplicazioni, fusioni e fissioni di cromosomi durante l’evoluzione, l’algoritmo AGORA può calcolare gli ordini dei geni sui cromosomi dell’ipotetico antenato amniota confrontando gli ordini dei geni sui cromosomi dei suoi discendenti esistenti. Questo genoma amniotico ancestrale ricostruito contiene l’80% dei 15.854 geni dei CAR. La distribuzione ineguale di questi geni sui 49 cromosomi dell’amniota ancestrale potrebbe riflettere la realtà o in alternativa la difficoltà di ricostruire l’ordine dei geni su cromosomi che avevano subito un considerevole riarrangiamento genico durante l’evoluzione.

Anche così, due cose spiccano nell’analisi. La prima è che il confronto del genoma ancestrale degli amnioti con i CAR raggruppati in 17 tetradi con i super-scaffold del genoma della lampreda (Petromyzon marinus) mostra un chiaro schema da 1 a 4 coerente con 2R WGD prima della scissione agnathan/gnathostome. Questo è in contrasto con i risultati di Smith et al. che hanno trovato forti prove per solo 1R WGD nella lampreda rispetto al pollo. Questa discrepanza potrebbe essere spiegata dall’inclusione di dati genomici da più specie nella ricostruzione dell’ipotetico genoma ancestrale amniotico, un processo che di per sé elimina anche i riarrangiamenti genomici confondenti che si sono verificati nei vertebrati successivamente all’antenato amniotico. È probabile che sia dovuto anche all’inclusione di dati filogenetici per determinare le tetradi CAR, rivelando così ohnologs che divergevano alla base dell’evoluzione dei vertebrati.

Il secondo risultato che spicca è la corrispondenza tra l’ordine dei geni sui cromosomi umani e i 17 cromosomi pre-1R. Quando i 17 cromosomi pre-1R sono codificati a colori (Fig. 1b) e i colori di ogni gene trasferiti alle posizioni degli 8282 geni umani che discendono dai geni pre-1R, il modello di duplicazioni e traslocazioni del genoma è evidente. Per esempio, il cromosoma 1 nel genoma pre-1R contiene i geni Hox. Un ampio segmento del cromosoma 2 umano contiene il cluster HoxD più molti altri geni corrispondenti a quelli del cromosoma 1 pre-1R. Gli altri 3 cluster Hox umani si trovano sui cromosomi 7, 12 e 17. Inoltre, un numero sostanziale di omologhi di altri geni sul cromosoma 1 pre-1R si trova sui cromosomi umani 1, 3, 10, 16 e 22, indicativo di traslocazioni.