ORIGINAL PAPER

Studio biochimico e farmacologico del veleno del ragno lupo Lycosa singoriensis

Liu ZHI; Qian WII; Li JI; Zhang YI; Liang SI

ICollege of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha, China
IIAdministrative Center for Basic Research, Ministry of Science ant Technology, China

Correspondence to

ABSTRACT

The wolf spider Lycosa singoriensis is a large and venomous spider distributed throughout northwestern China. Come altri veleni di ragno, il veleno del ragno lupo è un cocktail chimico. Il suo contenuto proteico è di 0,659 mg di proteine/mg di veleno grezzo come determinato dal metodo Lowry. L’analisi MALDI-TOF ha rivelato che i peptidi del veleno sono molto diversi e possono essere divisi in tre gruppi caratterizzati da tre intervalli molecolari indipendenti: da 2.000 a 2.500 Da, da 4.800 a 5.500 Da e da 7.000 a 8.000 Da, rispettivamente. Questa distribuzione molecolare differisce sostanzialmente da quella della maggior parte dei veleni di ragno studiati finora. Questo veleno di ragno lupo ha una bassa azione neurotossica sui topi, ma può indurre l’emolisi degli eritrociti umani. Inoltre, il veleno mostra un’attività antimicrobica contro cellule procariotiche ed eucariotiche.

Parole chiave: ragno, Lycosa singoriensis, veleno grezzo, MALDI-TOF, attività antimicrobica.

INTRODUZIONE

Ci sono circa 39.000 specie di ragni descritte, con un numero ancora maggiore in attesa di caratterizzazione. Quasi tutti i ragni sono predatori e hanno ghiandole velenifere. La proposta primaria dei veleni di ragno è di uccidere o paralizzare la preda. I veleni di ragno sono cocktail chimici complessi in cui i peptidi sono i costituenti principali della maggior parte dei veleni di ragno, tranne quelli dei ragni vedova nera che contengono una proporzione elevata, maggiore di 100 kD di proteine (1-3). I peptidi del veleno di ragno sono prodotti in modo combinatorio, il che porta a un totale stimato di circa 1,5 milioni di peptidi del veleno di ragno. Di conseguenza, i veleni di ragno sono una ricca fonte di nuovi composti farmacologicamente e agrochimicamente interessanti che negli ultimi anni hanno ricevuto una maggiore attenzione da parte di farmacologi e biochimici. Tuttavia, negli ultimi decenni, solo pochi veleni di ragno sono stati studiati in modo sufficientemente dettagliato, e quindi meno dello 0,01% dei peptidi del veleno di ragno sono stati identificati finora (4-7).

Il ragno lupo Lycosa singoriensis è un grande ragno distribuito in tutta la Cina nord-occidentale. La femmina adulta del ragno ha una lunghezza del corpo da 28 a 40 mm (35±6 mm) e un peso corporeo da 2,6 a 7 g (Figura 1). Questo ragno peloso vive in buche sottoterra. La sua tana, foderata con un tubo di seta, ha un diametro da 2 a 4 cm e una lunghezza da 30 a 60 cm, e l’entrata della tana è spesso coperta da una rete di seta. Il ragno passa il giorno rannicchiato sul fondo della tana, mentre risale il tubo di seta e si nasconde vicino all’ingresso della tana in attesa di una preda di notte. Dopo essere riuscito a catturare le vittime, il ragno le porta nel buco. In molti casi, sul fondo della tana si trovano residui di piccoli insetti. Il ragno lupo Lycosa singoriensis è anche un ragno velenoso e aggressivo. Nel 2000, è stato segnalato che ci sono stati morsi di ragno lupo a esseri umani e altri animali nella zona settentrionale della provincia di Xinjiang. Secondo le registrazioni cliniche, la maggior parte dei morsi di ragno ha causato effetti evidenti, tra cui segni rossi e dolore intorno ai siti di morso (8, 9).

In questo studio, riportiamo le proprietà biochimiche e farmacologiche del veleno del ragno lupo Lycosa singoriensis. Rispetto a molti altri veleni di ragno studiati finora, il veleno di questo ragno ha alcune proprietà distinte, che lo rendono una fonte utile per lo screening delle tracce di farmaci e per lo studio della biodiversità dei peptidi del veleno di ragno.

MATERIALI E METODI

Rami e raccolta del veleno

Le femmine adulte di ragno Lycosa singoriensis sono state raccolte nella provincia di Xinjiang, Cina, mantenute in secchi di plastica coperti da reti di plastica e fornite di acqua ogni giorno. Fegati di maiale tritati e vermi sono stati usati per nutrire gli animali. Come molti altri grandi ragni (10, 7), la Lycosa singoriensis diventa facilmente aggressiva quando viene provocata da un pezzo di tubo di plastica. Afferrano il tubo saldamente, e poi le sue zanne velenose perforano il tubo e iniettano il veleno all’interno. Questo evita la necessità della stimolazione elettrica, che può contaminare il veleno con gli enzimi della saliva e dei fluidi digestivi. Usando questo metodo si potrebbero ottenere circa 50 mg di veleno da circa 300 ragni Lycosa singoriensis, permettendo così di esplorare le proprietà biochimiche e farmacologiche di questo veleno di ragno. Il veleno grezzo è un liquido chiaro e incolore, facilmente solubile in acqua ed è stato raccolto ogni due settimane. Il veleno grezzo liofilizzato è stato conservato a -20°C prima dell’analisi.

Analisi SDS-PAGE del veleno grezzo

L’elettroforesi su gel di poliacrilammide dodecil solfato di sodio (SDS-PAGE) sul veleno raccolto è stata eseguita in condizioni denaturate in un gel di poliacrilammide al 10%. Cento microgrammi di veleno liofilizzato sono stati utilizzati per l’elettroforesi, e le proteine separate nel gel sono state visualizzate mediante colorazione G250.

Analisi MALDI-TOF del veleno grezzo

L’impronta digitale del veleno grezzo è stata determinata utilizzando una spettrometria di massa MALDI-TOF (Voyager-DE STR Biospectometry® workstation, Applied Biosystems, USA). La ionizzazione è stata ottenuta mediante irradiazione con un laser ad azoto (337 nm) ad una tensione di accelerazione di 20 kV; l’acido α-ciano-4-idrossicinnamico (CCA) è stato impiegato come matrice.

L’effetto del veleno grezzo sulle preparazioni isolate di nervi-sinapsi

Tre tipi di preparazioni isolate di nervi-sinapsi – nervo frenico-diaframma di topo, vaso deferente di ratto e cuore di rospo – sono stati usati per studiare l’attività farmacologica del veleno grezzo. Gli esperimenti di preparazione del nervo frenico-diaframma del topo sono stati eseguiti secondo Bülbring (11). I saggi del Vas deferens e del cuore di rospo sono stati eseguiti secondo Liang et al. (12).

Saggio emolitico

L’attività emolitica del veleno grezzo è stata valutata con globuli rossi umani eparinizzati sciacquati tre volte in 5 mL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS – 50 mM NaH2PO4 e 150 mM NaCl, pH 7,2) e centrifugati per 5 minuti a 3.000 rpm. I globuli rossi sono stati poi incubati a temperatura ambiente per 1 ora in acqua deionizzata (controllo positivo), in PBS (bianco), o con veleni a varie concentrazioni (da 3,1 a 20 mg/mL) in PBS. I campioni sono stati centrifugati a 12.000 rpm per 5 minuti. Il surnatante è stato separato dal pellet e la sua assorbanza è stata misurata a 570 nm.

Attività antimicrobica del veleno grezzo

Sei batteri (Bacillus cereus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Staphylococcus albus e E. coli DH5) e due funghi. coli DH5) e due funghi (Saccaromyces cerevisae e Candida albicans) sono stati coltivati rispettivamente nel terreno di coltura fino a raggiungere la fase esponenziale con un’assorbanza a 600 nm da 0,3 a 0,8. Cinquanta microlitri di terreno sono stati sparsi uniformemente su tre piastre di agar solidificato. Le piastre sono state completate con l’1,5% di agarosio/mezzo versato in piastre Petri sterili da 100 × 20 mm. Una carta da filtro di 6 mm di diametro ha coperto le piastre. Cinque microlitri di soluzione di veleno, in soluzione fisiologica normale, a varie concentrazioni è stata posta sulla carta da filtro. Dopo l’incubazione a 37°C per una notte, gli effetti del veleno grezzo sono stati registrati come cerchi chiari nel prato batterico sulla carta da filtro.

Quindi, in questo biotest, le soluzioni di veleno grezzo a varie concentrazioni (3 mg/mL, 6 mg/mL e 12 mg/mL) sono state fatte cadere sulla carta da filtro, e un cerchio chiaro era rilevabile sulla carta se il veleno a questa concentrazione aveva inibito la crescita microbica.

RISULTATI E DISCUSSIONE

Caratterizzazione biochimica del veleno grezzo

Si è scoperto che ogni milligrammo di veleno grezzo contiene circa 0,659 mg di proteine/peptidi. Come mostrato nella Figura 2, le proteine ad alta massa molecolare del veleno grezzo sono distribuite principalmente tra masse molecolari che vanno da 14 a 31.000 Da, con una spessa banda proteica vicino a 20.000 Da e un’altra banda evidente vicino a 14.000 Da. Una banda spessa è anche visibile sulla parte superiore del pannello del gel SDS-PAGE che consiste nei peptidi con massa molecolare inferiore a 10.000 Da. Le proteine/peptidi distribuiti nei due legami spessi sono i componenti più abbondanti del veleno grezzo, che corrispondono all’80% della componente proteica del veleno grezzo.

Di recente, la spettrometria di massa MALDI-TOF è stata applicata per chiarire la complessità dei peptidi del veleno. Inoltre, con il rapido sviluppo della spettrometria di massa, questa tecnologia è stata ampiamente utilizzata nella ricerca sul veleno (5, 13). Per esempio, Pierre Escoubas et al. (5) hanno dipinto un quadro del veleno per concettualizzare la complessità dei veleni dei ragni funnel-web australiani usando un approccio combinato di cDNA e spettrometria di massa. I loro studi dimostrano che i veleni di questi ragni contengono molte centinaia di peptidi che seguono una distribuzione bimodale, con la maggioranza dei peptidi nella gamma di massa da 3.000 a 5.000 Da, e un secondo gruppo meno pronunciato nella gamma da 6.500 a 8.500 Da. Questa distribuzione di masse molecolari è analoga a quella osservata in precedenza per un gran numero di veleni di tarantola (4). Risultati simili sono stati trovati anche nei nostri studi precedenti sui veleni dei ragni tarantola cinesi Ornithoctonus huwena, Ornithoctonus hainana e Chilobrachys jingzhao (14-16).

Come presentato nella Figura 3, l’analisi spettrometrica MALDI-TOF del veleno grezzo di Lycosa singoriensis dimostra che la distribuzione della massa molecolare è analogamente osservata nell’intervallo da 1.000 a 10.000 Da. Tuttavia, a differenza delle specie sopra menzionate, i peptidi del veleno di Lycosa singoriensis possono essere divisi in tre gruppi in base alla loro massa. Il primo gruppo comprende peptidi che possiedono masse molecolari tra 2.000 e 2.500 Da, il che indica che hanno circa 20 residui di aminoacidi. Questo intervallo di massa molecolare è stato raramente osservato nella maggior parte dei veleni di ragno studiati fino ad oggi. Il secondo gruppo comprende principalmente peptidi con masse molecolari comprese tra 4.800 e 5.500 Da, il che suggerisce che sono composti da circa 50 residui di aminoacidi. Il terzo gruppo è composto da peptidi con massa compresa tra 7.000 e 8.000 Da, che corrisponde a più di 60 residui di aminoacidi. Si stima che i peptidi distribuiti negli ultimi due gruppi siano la maggior parte dei peptidi del veleno.

Interessante, piuttosto pochi peptidi hanno masse molecolari tra 3.000 e 5.000 Da. Paradossalmente, i peptidi in questa gamma di massa sono il componente più abbondante in molti altri veleni di ragno. Sarebbero necessari ulteriori studi per chiarire queste discrepanze, che potrebbero contribuire a comprendere il meccanismo evolutivo dei peptidi del veleno di ragno. Lo studio attuale contribuisce a dimostrare che i peptidi di Lycosa singoriensis sono altamente diversificati.

L’analisi delle librerie di cDNA della ghiandola del veleno ha prodotto più di 200 sequenze di peptidi simili a tossine. La distribuzione di massa di questi peptidi derivati dalle sequenze di cDNA è coerente con quella osservata dalla spettrometria MALDI-TOF. Inoltre, l’analisi delle sequenze ha rivelato che i peptidi del primo gruppo non hanno residui di cisteina, e quelli del secondo gruppo contengono 4 o 5 legami disolfuro, mentre quelli dell’ultimo gruppo hanno più di 5 legami disolfuro (dati non pubblicati). La maggior parte delle tossine peptidiche di ragno identificate finora hanno solitamente 3 o 4 legami disolfuro, e le loro strutture 3D adottano il classico motivo cistina-nodo dell’inibitore. Di conseguenza, c’è ragione di credere che alcuni peptidi del veleno di Lycosa singoriensis possiedano un nuovo tema strutturale.

Caratterizzazione farmacologica del veleno grezzo

Il veleno grezzo, ad una dose elevata di 200 µg/mL, non poteva bloccare la contrazione stimolata elettricamente della preparazione del diaframma del nervo frenico del topo (n = 5). Ha anche esibito un basso effetto sulla risposta alla contrazione dei vasi deferenti di ratto. La concentrazione di 200 µg/mL di veleno grezzo potrebbe inibire solo parzialmente la risposta di contrazione per 20 minuti (n = 5) (Figura 4 – A). Al contrario, il veleno grezzo del ragno O. huwena, alla stessa concentrazione, era in grado di bloccare rapidamente la risposta alle contrazioni della stessa preparazione del nervo-diaframma o del vaso deferente di ratto (dati non mostrati). Tuttavia, il veleno grezzo di Lycosa singoriensis ha avuto un effetto significativo sulla contrazione del cuore del rospo. In presenza di 100 µg/mL di veleno grezzo, il tasso e la grandezza del battito cardiaco sono stati potentemente aumentati (n = 5) (Figura 4 – B). Questo suggerisce che il veleno grezzo contiene alcuni composti che sono cardiotonici.

Attualmente, gli agenti cardiotonici sono classificati in tre classi basate sui loro meccanismi d’azione subcellulari, cioè agenti che agiscono attraverso meccanismi a monte (mobilizzatori di Ca2+), così come meccanismi centrali e a valle (sensibilizzatori di Ca2+). Questi agenti inducono un effetto inotropo positivo aumentando la concentrazione intracellulare di ioni Ca2+ (17). Ad oggi, non c’è alcun rapporto di un effetto cardiotonico dei veleni di ragno lupo, mentre nessun composto cardiotonico è stato ancora purificato e caratterizzato da questi veleni. Pertanto, è importante studiare i composti cardiotonici dal veleno di Lycosa singoriensis.

L’attività emolitica del veleno grezzo è stata determinata utilizzando eritrociti umani freschi. Come mostrato nella Figura 5 (A), il veleno grezzo ha distrutto gli eritrociti umani in modo dose-dipendente. La sua concentrazione efficace del 50% di inibizione (EC50) è di 1,25 mg/mL.

Come riportato da Budnik et al. (18), il veleno grezzo di Lycosa singoriensis contiene peptidi antimicrobici (denominati licocitine 1, 2 e 3) che possono inibire la crescita di batteri gram-positivi e gram-negativi e funghi a concentrazioni micromolari. Abbiamo quindi testato l’attività antimicrobica del veleno grezzo contro cellule sia procariotiche che eucariotiche mediante il saggio di inibizione della crescita su piastra. Nelle nostre condizioni di biotest, i ceppi cellulari più sensibili al veleno grezzo erano, in particolare, Bacillus subtilis e Staphylococcus sp, in cui la crescita era potentemente inibita a 3 mg/mL. Il veleno ha anche agito fortemente contro Corynebacterium glutamicum e Micrococcus luteus ma debolmente contro uno dei ceppi di funghi (Candida albicans). Tuttavia, il veleno grezzo non aveva alcun effetto rilevabile su E. coli e Saccaromyces cerevisae anche all’alta concentrazione di 12 mg/mL (Figura 5 – B).

Negli ultimi dieci anni, molti peptidi antimicrobici sono stati identificati dai veleni di ragno. Le licotossine I e II sono state identificate dal veleno del ragno lupo Lycosa carolinensis. Entrambi sono peptidi antimicrobici lineari che dimostrano il carattere anfipatico ad α-elica tipico dei peptidi poroformanti. Il loro meccanismo di formazione dei pori è stato ulteriormente verificato dalla loro promozione dell’efflusso di ioni calcio dai sinaptosomi (19). Dopo le licotossine, anche le cupiennine (20-22) e le oxyopinine (23, 24), dal veleno dei ragni lupo Cupiennus salei e Oxyopes kitabensis, rispettivamente, sono state trovate per avere attività antimicrobiche. Più recentemente, sette nuovi brevi peptidi lineari antimicrobici e citolitici chiamati latarcine sono stati purificati dal veleno del ragno Lachesana tarabaevi. Inoltre, cinque nuovi peptidi che condividono una considerevole somiglianza strutturale con le latarcine purificate sono stati predetti dalla base di dati di expressed sequence tag per la ghiandola del veleno del ragno (25).

Questi peptidi dai veleni di ragno appartengono ai peptidi antimicrobici lineari cationici α-helical. Questa classe di peptidi antimicrobici condivide alcune caratteristiche comuni, come l’inibizione della crescita microbica a basse concentrazioni micromolari e la formazione di eliche anfipatiche e cationiche in ambienti idrofobici. Negli ultimi decenni, un gran numero di peptidi antimicrobici, compresi i peptidi antimicrobici lineari cationici α-elici, sono stati scoperti sia negli animali che nelle piante. Questi peptidi sono tipicamente composti da 12 a 45 aminoacidi e svolgono ruoli importanti nei sistemi immunitari innati della maggior parte degli organismi viventi (26-28). La maggior parte di essi può uccidere i microrganismi con le seguenti quattro caratteristiche: tossicità selettiva, uccisione rapida, ampio spettro antimicrobico e nessuno sviluppo di resistenza (29-31).

In sintesi, riportiamo nuovi risultati biochimici e farmacologici sul veleno del ragno lupo Lycosa singoriensis. Le proprietà distinte dei peptidi di questo veleno lo rendono un modello ideale per studiare i meccanismi evolutivi dei peptidi del veleno di ragno. Lo studio farmacologico di questo veleno è utile per purificare e caratterizzare i peptidi bioattivi in ulteriori studi.

CONOSCENZE

Questo lavoro è stato sostenuto dai progetti della National Science Foundation (30430170 e 30700127).

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