Stabilimento di un modello di xenotrapianto di cancro gastrico umano in topi immunocompetenti utilizzando il Microcarrier-6
Abstract
Il cancro gastrico è tra i più comuni tumori maligni del tratto digestivo. Stabilire un modello animale robusto e affidabile è la base per studiare la patogenesi del cancro. Il presente studio ha stabilito un modello murino di carcinoma gastrico inoculando topi immunocompetenti con cellule MKN45 usando microcarrier. Sessanta topi maschi C57BL/6 sono stati divisi a caso in tre gruppi: un gruppo 2D, un gruppo con vettore vuoto e un gruppo 3D, secondo il sistema di cocoltura di MKN45 e il microcarrier. I modelli di topo sono stati stabiliti mediante iniezione ipodermica. Il tempo di sviluppo del tumore, il tasso di formazione del tumore e le caratteristiche patologiche sono stati osservati in ogni gruppo. Nel gruppo 3D, il tempo di tumorigenesi era breve, mentre il tasso di formazione del tumore era alto (75%). Non c’è stata alcuna formazione tumorale rilevabile né nel gruppo 2D né in quello del vettore vuoto. Sia la colorazione H&E che quella immunoistochimica dello xenotrapianto tumorale hanno mostrato prove caratteristiche di neoplasie gastriche umane. Il presente studio ha stabilito con successo un modello di carcinoma gastrico umano in topi immunocompetenti, che fornisce un modello animale nuovo e prezioso per la ricerca sul cancro e lo sviluppo di farmaci anticancro.
1. Introduzione
Con circa un milione di nuovi casi diagnosticati ogni anno, il cancro gastrico rappresenta una grave minaccia per la salute e la vita delle persone in tutto il mondo. Tuttavia, la patogenesi e i meccanismi di metastasi del cancro gastrico devono ancora essere completamente chiariti. I modelli in vivo del cancro gastrico sono strumenti essenziali per l’esplorazione delle caratteristiche biologiche di questo cancro e delle potenziali nuove opzioni di trattamento. I modelli di xenotrapianto del cancro gastrico di derivazione umana sono stati stabiliti in topi immunodeficienti, come i topi nudi e i topi con grave immunodeficienza combinata. Tuttavia, i topi immunodeficienti non sono facilmente allevati e sono costosi. Inoltre, i topi immunodeficienti non riflettono i ruoli importanti del sistema immunitario nello sviluppo e nella progressione del tumore. Quindi, la creazione di un nuovo modello di xenotrapianto del cancro gastrico umano nei topi con un sistema immunitario normale è di grande importanza. Nel presente studio, MKN45, cellule umane di cancro gastrico e il microcarrier sono stati coculturati, e topi immunocompetenti sono stati successivamente inoculati con la sospensione, stabilendo con successo un nuovo xenotrapianto di cancro gastrico di derivazione umana.
2. Materiali e metodi
2.1. Materiali
Il mezzo di coltura Roswell Park Memorial Institute- (RPMI-) 1640, la tripsina, il siero bovino fetale e la penicillina sono stati acquistati da Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Gli anticorpi monoclonali di coniglio anti-antigene carboidrato umano 199 (CA199), citocheratina 7 (CK-7), e homeobox 2 di tipo caudale (CDX-2) sono stati acquistati da Abcam (Cambridge, UK). Il microcarrier-6 è stato acquistato da Elyon Biotechnologies LLC (Gaithersburg, MD, USA).
2.2. Animali sperimentali
Sessanta topi maschi di 6-8 settimane di età C57BL/6 del peso di 22-25 g sono stati acquistati da Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co. Ltd. (numero di licenza: SCXK 20140007, provincia di Shandong, Cina) e alloggiati in un centro per animali esenti da patogeni specifici presso l’ospedale affiliato di Jining Medical College (provincia di Shandong, Cina). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti con l’approvazione del Comitato Istituzionale per la cura e l’uso degli animali dell’Ospedale Affiliato dell’Università Medica di Jining ed eseguiti in conformità alle linee guida approvate.
2.3. Le linee cellulari
La linea cellulare di cancro gastrico umano MKN45 è stata acquistata dalla Cell Bank of the Chinese Academy of Science (Shanghai, Cina) e coltivata in RPMI-1640 medium contenente 10% di siero fetale bovino e 100 U/mL di penicillina a 37°C con 5% CO2. Il mezzo di coltura è stato cambiato ogni 24 ore, e le cellule raccolte mediante digestione con 0,25% di tripsina.
2.4. La microportante-6 è stata immersa in etanolo al 75% per 24 ore, lavata tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato 1x, e incubata in RPMI-1640 per 24 ore. Successivamente, la microportante-6 è stata modificata tramite un’incubazione di 3 ore con il fattore 1 alfa derivato dalle cellule stromali (SDF-1α) e il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), entrambi ad una concentrazione di 100 ng/mL. Le cellule in fase di crescita logaritmica sono state contate dopo la colorazione blu trypan e regolate a una concentrazione di quando la vitalità era >95%. La sospensione cellulare MKN45 è stata mescolata con il microcarrier-6 modificato e incubata a 37°C con 5% CO2 per altre 24 ore per saturare le cellule con il microcarrier, come osservato al microscopio (Figure 1(c) e 1(d)).
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Figura 1
Sistema di cocoltura 3D di cellule MKN45 al microscopio e al microscopio elettronico. (a) Nell’ambiente di coltura 2D, le cellule MKN45 hanno mostrato una forma poligonale irregolare. (b) Il microcarrier-6 di tipo C; struttura irregolare simile a un “labirinto”. (c) Dopo una cocoltura di 24 ore, le cellule MKN45 hanno aderito bene al microportante-6, come osservato al microscopio. Cluster di cellule irregolari sono stati osservati intorno alle cellule MKN45 che hanno aderito al microcarrier-6. (d) A seguito di una cocoltura di 24 ore, la colorazione DAPI ha mostrato un gran numero di cellule MKN45 aderite alla microportante-6. (e) La struttura porosa multistrato dei microcarriers può essere osservata al microscopio elettronico a scansione. (f) Le cellule MKN45 hanno aderito ai microcarri, e le cellule aderite alla superficie hanno formato cluster di cellule. Raggruppamento degli animali
I 60 topi C57BL/6 sono stati divisi a caso in tre gruppi (20 topi per gruppo): il gruppo bidimensionale (2D) (animali inoculati con contenente), il gruppo del vettore vuoto (animali inoculati con contenente 30 μg microcarrier-6), e il gruppo 3D (animali inoculati con contenente e 30 μg microcarrier-6).
2.6. Generazione del modello animale
Il modello di coltura di cellule tumorali 3D è stato stabilito il primo giorno dell’esperimento e incubato per 24 ore. Il secondo giorno, i complessi cellula-microcarriera coltivati sono stati lavati tre volte e mescolati delicatamente con per regolare la concentrazione alle cellule e 300 μg microcarrier-6 per 1 mL di sospensione, e messi in ghiaccio per un uso successivo. Le cellule MKN45 in fase di crescita logaritmica sono state raccolte, tripsinizzate, lavate tre volte con , e risospese in ad una concentrazione di , che è stato posto su ghiaccio per un uso successivo. Il microcarrier-6 modificato è stato lavato tre volte con , risospeso in ad una concentrazione di 300 μg/mL, e posto su ghiaccio per un uso successivo. Ogni topo in tutti e tre i gruppi sperimentali è stato inoculato con 100 μL della soluzione corrispondente sotto la cresta ascellare destra.
2.7. Rilevamento degli indicatori ed esame patologico
Dopo l’inoculazione, i topi sono stati alloggiati separatamente per gruppo, e l’appetito giornaliero, le attività e il peso sono stati monitorati. Il tempo per la formazione del tumore locale e il volume del tumore in ogni topo è stato registrato. Una volta che i tumori erano visibili, il diametro lungo (a) e il diametro corto (b) di ogni tumore sono stati misurati quotidianamente, e il volume tumorale è stato calcolato secondo la formula del volume tumorale: . I topi portatori di tumore sono stati sacrificati in tre lotti: 10, 20 e 30 giorni dopo l’inoculazione. I tessuti tumorali sono stati completamente rimossi da ogni topo, e la qualità del tumore, la consistenza e il grado di infiltrazione e necrosi sono stati registrati. I tessuti tumorali sono stati successivamente fissati in formaldeide neutra tamponata al 4% e colorati con ematossilina ed eosina (H&E). La tecnica di colorazione in due fasi EnVision è stata usata per l’immunoistochimica. I risultati della colorazione sono stati determinati in base alla colorazione citoplasmatica granulare positiva del tumore. La colorazione negativa (-ve) è stata definita come <5% di cellule colorate positivamente, e la colorazione positiva (+ve) è stata definita come ≥5% di cellule colorate positivamente.
2.8. Analisi statistica
Per l’analisi statistica è stato utilizzato il software SPSS 13.0 (IBM SPSS, Chicago, IL, USA). I dati di misurazione sono presentati come media ± errore standard della media (SEM). Le differenze tra i valori medi di ciascun gruppo sono state confrontate utilizzando l’analisi della varianza a una via (ANOVA) o il test di Kruskal-Wallis come appropriato. è considerata una differenza statisticamente significativa.
3. Risultati
3.1. Stabilimento del sistema di coltura in vitro del tumore MKN45 3D usando il microcarrier-6
Il microcarrier-6 è un nuovo microcarrier composto da polimeri organici positivamente elettrificabili con una struttura porosa multistrato. La dimensione dei pori, la densità di carica superficiale positiva e le dimensioni della microportante-6 possono essere regolate tramite sintesi chimica. Tipo C microportante-6, piccolo volume, grande dimensione dei pori, e molte volte di piegatura dello spazio, è usato principalmente per la coltura cellulare 3D e gli esperimenti di sensibilità ai farmaci (Figure 2(a) e 2(b)). Tipo M microportante-6, grande volume, piccole dimensioni dei pori, e bassi tempi di ripiegamento interno, è utilizzato principalmente per la ricerca di ingegneria dei tessuti (Figure 2(c) e 2(d)). La microportante-6 di tipo C è stata usata nel nostro studio. Il microportante-6 è un composto organico puro che non è soggetto a contaminazione, non ha impurità, è basso in immunogenicità e metabolismo, ed è altamente biocompatibile, fornendo un microambiente stabile per la crescita cellulare (Figure 2(a)-2(d)). Inoltre, la microportante-6 è direttamente incorporata nella pelle dei topi, inducendo la crescita dei vasi sanguigni (Figure 2(e) e 2(f)), che può fornire un apporto di sangue sufficiente per la crescita delle cellule tumorali. Le cellule MKN45 hanno aderito rapidamente nell’ambiente 2D, e la morfologia cellulare osservata al microscopio dopo 24 ore di coltura ha mostrato una forma di poligono irregolare (Figura 1(a)). Il microcarrier-6 ha esibito una forma di fuso irregolare o lungo e una struttura sciolta (Figura 1(b)). A seguito di una cocoltura di 24 ore di MKN45 e del microportante-6 modificato, le cellule MKN45 hanno aderito bene al microportante e hanno raggiunto la confluenza. Inoltre, sono stati osservati cluster di cellule irregolari che circondano le cellule MKN45 aderite al microcarrier-6 (Figura 1(c)). I complessi MKN45 cellula-microportante sono stati colorati con una soluzione di 4,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI), rivelando un gran numero di cellule MKN45 aderite all’impalcatura microportante-6 (Figura 1 (d)). La struttura porosa multistrato dei microcarriers può essere osservata al microscopio elettronico a scansione (Figura 1(e)). Le cellule MKN45 hanno aderito ai microcarri, e le cellule aderite alla superficie hanno formato cluster di cellule (Figura 1(f)).
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Figura 2
Le caratteristiche del microcarrier-6 al microscopio. (a, b) Microportante-6 di tipo C, piccolo volume, grande apertura. (c, d) Microportante-6 di tipo M, grande volume, piccola apertura. La dimensione dei pori, la densità di carica superficiale positiva e la dimensione della microportante-6 possono essere regolate tramite sintesi chimica. La microportante-6 è multistrato e reticolata per formare una struttura irregolare simile a un “labirinto” con spazio sufficiente (b, d). La microportante-6 è direttamente incorporata nella pelle di topi C57BL/6 per 5 settimane, inducendo la crescita di vasi sanguigni (e, f). (e) Visivamente, le superfici rosse sono vasi sanguigni. (f) Al microscopio, le ombre dendritiche sono vasi sanguigni.
3.2. Sopravvivenza del topo e formazione del tumore
Nessun cambiamento significativo nell’appetito, nel pelo o nel peso corporeo è stato notato tra i gruppi durante l’esperimento (Tabella 1). I topi del gruppo 3D hanno mostrato una leggera diminuzione dell’attività una settimana dopo l’inoculazione. Nessun animale è morto in nessun gruppo, e nessuna formazione di tumori è stata trovata nei gruppi con vettore vuoto o 2D durante i 30 giorni di esperimento. Masse sottocutanee in 15 dei 20 topi nel gruppo 3D sono stati identificati tramite palpazione 7-10 giorni dopo l’inoculazione, suggerendo un tasso di formazione del tumore del 75% (Tabella 1). Tumore xenotrapianti cresciuto rapidamente e sono stati osservati come masse sottocutanee circa 10 giorni dopo l’inoculazione (Figura 3 (a), Figura 3 supplementare). Tumore xenotrapianti cresciuto a 0.5-1.0 cm3 di dimensioni da 2 a 3 settimane postinoculazione. I tessuti xenotrapianti tumore sono stati facilmente separati dai tessuti adiacenti e presentato come forme relativamente regolari, per lo più rotondo o ovale, bianco grigiastro o rosso grigiastro a colori, e con un abbondante apporto di sangue periferico (Figure 3 (b) e 3 (c) e Figura 3 supplementare). Ci sono stati cambiamenti istologici del sito di iniezione nel gruppo del vettore vuoto, ma nessun cambiamento nel gruppo 2D (Figure 3(d) e 3(e)). Piccole masse sottocutanee sono stati osservati con un colore giallo nel gruppo vettore vuoto (Figura 3 (d)).
Tempo (giorno)
Gruppo vettore vuoto
Gruppo 2D
3D gruppo
Peso del corpo (g)
Volume (mm3)
Peso del corpo (g)
Volume (mm3)
Peso del corpo (g)
Volume (mm3)
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0
3
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7
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I dati sono indicati come .
Tabella 1
Peso corporeo e volume tumorale dei topi in diversi punti temporali.
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Figura 3
Cambiamenti istologici nei siti di iniezione dei diversi gruppi. (a, b, c) Grandi masse sottocutanee sono state osservate 10 giorni dopo l’inoculazione nel gruppo 3D. (b, c) I tessuti dello xenotrapianto erano facilmente separati dai tessuti adiacenti e si presentavano con forme relativamente regolari, per lo più rotonde o ovali, e di colore bianco grigiastro o rosso grigiastro. (d) Piccole masse sottocutanee sono state osservate con un colore giallo nel gruppo del vettore vuoto. (e) Nessuna massa sottocutanea è stata osservata nel gruppo 2D.
3.3. H&E Staining
L’istomorfologia, vista al microscopio ottico, ha mostrato un gran numero di cellule disordinate e atipiche negli xenograft tumorali dei topi del gruppo 3D (Figure 4(a)-4(c)). Un gran numero di cellule eterotipiche, microcarri residui e vasi sanguigni abbondanti sono stati osservati, 10 giorni dopo l’inoculazione (Figura 4(a)). Un piccolo numero di microcarriers residui (Figura 4(b)) e un gran numero di lesioni necrotiche (Figura 4(d)) sono stati osservati, 20 giorni postinoculazione. Tuttavia, i microcarriers sono stati sostanzialmente eliminati 30 giorni dopo l’inoculazione (Figura 4(c)). Un gran numero di microcarriers e un piccolo numero di cellule infiammatorie sono stati osservati nel gruppo vettore vuoto, ma non sono state trovate cellule tumorali (Figura 4 (e)).
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Figura 4
H&E e colorazione immunoistochimica di uno xenotrapianto di cancro gastrico umano (200x). (a) Un gran numero di cellule eterotipiche, microcarri residui, e abbondanti vasi sanguigni sono stati osservati, 10 giorni dopo l’inoculazione. (b, d) Un piccolo numero di microcarriers residui (b) e un gran numero di lesioni necrotiche (d), 20 giorni dopo l’inoculazione. (c) Quasi nessun microcarriers residuo può essere trovato, 30 giorni postinoculazione. (e) Un gran numero di microcarriers e un piccolo numero di cellule infiammatorie sono stati visti nel gruppo del vettore vuoto. Le frecce blu si riferiscono ai vasi sanguigni, le frecce rosse indicano le cellule eterotipiche e le frecce nere mostrano i microcarriers residui (a, b, c). Le frecce grigie si riferiscono alle lesioni necrotiche (d), e le frecce verdi si riferiscono alle cellule infiammatorie (e). Lo xenotrapianto di cancro gastrico umano ha mostrato una diffusa e forte immunoreattività nel citoplasma o nei nuclei delle cellule tumorali. (f) CA199, (g) CK-7, e (h) CDX-2.
3.4. Immunoistochimica
L’immunoistochimica è stata effettuata in animali eutanasia 20 giorni dopo lo xenotrapianto del tumore. I tessuti dello xenotrapianto tumorale hanno mostrato una colorazione positiva di CA199, CK-7 e CDX-2 (Figure 4(f)-4(h)), confermando ulteriormente che le cellule atipiche erano cellule tumorali di derivazione umana.
4. Discussione
I modelli animali sono stati ampiamente utilizzati per studiare la patogenesi e i meccanismi metastatici del cancro gastrico e svolgono un ruolo estremamente importante nella valutazione dell’efficacia e della tossicità dei farmaci terapeutici. Attualmente, i modelli animali di cancro gastrico includono principalmente i seguenti: il modello di induzione, il modello di trapianto e il modello di ingegneria genetica. Tra i tre tipi di modelli, il modello di trapianto è facilmente operabile e quindi ampiamente utilizzato. Il tipo di animali da esperimento, gli xenotrapianti tumorali e il sito e la via del trapianto sono stati considerati fattori che influenzano il successo dei modelli di xenotrapianto. Topi con difetti nella funzione immunitaria, come topi nudi e topi con immunodeficienza combinata grave (SCID), sono comunemente usati per modelli di xenotrapianto. Tuttavia, a causa del costo relativamente costoso, breve durata di vita, e la mancanza di risposta immunitaria ai tumori nei topi con immunodeficienza, abbiamo selezionato topi immunocompetenti C57BL/6 per il modello di xenotrapianto per evitare i difetti dei topi con immunodeficienza. Si ritiene generalmente che l’insorgenza del cancro gastrico non sia legata al livello di estrogeni, e l’incidenza del cancro gastrico nei maschi è superiore a quella delle femmine. Quindi, abbiamo usato topi maschi come modello. Inoltre, il presente studio ha utilizzato le cellule di cancro gastrico umano MKN45 per stabilire il modello in vitro soprattutto a causa delle forti caratteristiche invasive e metastatiche della linea cellulare. Inoltre, la regione sottocutanea ascellare e il trapianto ectopico sono stati selezionati come il sito e il percorso del trapianto di cellule tumorali, rispettivamente, come risultato dell’abbondante apporto di sangue e la struttura del tessuto sciolto di questa zona, che facilita la crescita del tumore nei topi.
Come un ponte tra il sistema di coltura cellulare 2D e il modello animale, il sistema di coltura cellulare 3D simula meglio il microambiente di crescita delle cellule tumorali ed è diventato un argomento interessante nella ricerca attuale. La cultura 3D di cellule tumorali formerà organiidi tumorali, e i modelli di xenotrapianto del tumore del topo basati su organoidi tumorali hanno cominciato ad essere applicati allo screening di farmaci antitumorali. Il presente studio ha utilizzato il nuovo microcarrier-6 e le cellule MKN45 per gli esperimenti di cocoltura per stabilire con successo un modello di crescita 3D. Abbiamo direttamente incorporato la microportante-6 nel tessuto sottocutaneo dei topi per consentire ai vasi sanguigni di entrare nei microportanti, presentando un vantaggio specifico che non è stato raggiunto con altri microportanti. Gli studi hanno riportato una lieve immunosoppressione dei topi immunocompetenti per ottenere la resistenza alle cellule tumorali umane, stabilendo con successo un modello di topo portatore di tumore; tuttavia, ad oggi, non ci sono rapporti di trapianto ectopico di successo di un tumore umano in topi normali in condizioni non immunosoppressive. Inoltre, quando abbiamo regolato la concentrazione di cellule MKN45 e iniettato immediatamente 100 μL di sospensione cellulare MKN45 per via sottocutanea in ogni topo, la formazione stabile del tumore non è stata raggiunta a causa della forte eliminazione immunitaria delle cellule tumorali umane trapiantate ectopicamente. La microportante-6 usata nel presente studio ha esibito una bassa immunogenicità e una struttura sciolta con numerosi pori al centro, facilitando la crescita delle cellule tumorali. La microportante-6 ha anche agito come una barriera per bloccare le cellule immunitarie dall’uccidere direttamente le cellule tumorali. La microportante-6 modificata ha permesso ai vasi sanguigni di crescere facilmente all’interno del tumore, fornendo le condizioni adatte per la rapida crescita delle cellule tumorali.
L’immunità cellulare è il principale esercito contro la crescita del tumore; le cellule coinvolte includono principalmente le cellule T, le cellule natural killer, i macrofagi e le cellule dendritiche. A causa della struttura irregolare “a labirinto” del microcarrier-6, esso può agire come una barriera a breve termine e bloccare l’uccisione diretta delle cellule tumorali da parte delle cellule immunitarie in una certa misura. Inoltre, tre ore prima dell’esperimento, la microportante-6 è stata ulteriormente modificata con SDF-1α e VEGF per accelerare la formazione di vasi sanguigni e fornire un apporto di sangue per una rapida crescita del tumore, che ha superato l’effetto immunitario antitumorale dei topi. Contemporaneamente, abbiamo trovato che i macrofagi nel sangue periferico e nei tessuti splenici dei topi erano significativamente diminuiti durante la fase iniziale della formazione del tumore trapiantato, rispetto al gruppo di controllo normale (Figura 1 supplementare). Il numero di macrofagi del midollo osseo è diminuito gradualmente tra il gruppo del vettore vuoto, il gruppo 2D e il gruppo 3D, ma non c’era alcuna significatività statistica (Figura supplementare 2A, 2B). Rispetto al gruppo di portatori vuoti, il numero di linfociti T della milza nel gruppo 2D era ridotto, ma non c’era alcuna significatività statistica (Figura supplementare 2C). Il numero di linfociti T della milza nel gruppo 3D era significativamente inferiore a quello del gruppo 2D (Figura supplementare 2C). Questo suggerisce che la crescita del tumore ha inibito il sistema immunitario, permettendo al tumore di crescere rapidamente.
Il presente studio ha stabilito un modello di crescita 3D delle cellule MKN45, stabilendo con successo un modello di xenotrapianto di cancro gastrico umano in topi immunocompetenti nel gruppo 3D, mentre i topi nei gruppi 2D e con vettore vuoto non hanno formato alcun tumore. Questo modello di xenotrapianto è stato caratterizzato dalla rapida crescita dei tumori, che potevano essere palpati a mano 7-10 giorni dopo l’inoculazione e hanno raggiunto una crescita ottimale entro 10-15 giorni dopo l’inoculazione; il volume del tumore era 0,5-1,0 cm3 circa 20 giorni dopo l’inoculazione. Un gran numero di cellule con atipie nucleari che avevano infiltrato i tessuti muscolari e grassi sono state rilevate dalla colorazione H&E. Il microcarrier-6 residuo era circondato da cellule infiammatorie e formava granulomi con una grande area di necrosi nel centro, che era probabilmente causata da un insufficiente apporto di sangue a causa della rapida crescita del tumore. Questi fenomeni sono coerenti con lo sviluppo del tumore nell’uomo. Inoltre, i capillari abbondanti erano principalmente situati nella periferia dei tumori. Attualmente, non esiste un marcatore tumorale specifico per il cancro gastrico; tuttavia, CA199, CK-7 e CDX-2 sono comunemente usati come marcatori dei tumori gastrointestinali. Così, abbiamo scelto questi tre marcatori per l’etichettatura e l’identificazione delle cellule tumorali gastriche di derivazione umana. La colorazione immunoistochimica di CA199, CK-7 e CDX-2 era positiva, confermando ulteriormente che le cellule eteromorfe erano cellule di cancro gastrico umano.
5. Conclusioni
Abbiamo stabilito con successo un modello di xenotrapianto di cancro gastrico umano in topi immunocompetenti. Questo modello può riflettere l’interazione tra il sistema immunitario del corpo e i tumori e ha ampie prospettive di applicazione nella ricerca futura sull’immunità tumorale così come la ricerca e lo sviluppo di nuovi farmaci.
Data Availability
I dati utilizzati per sostenere i risultati di questo studio sono disponibili dall’autore corrispondente su richiesta.
Conflitti di interesse
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Contributi degli autori
Yanzhen Bi, Quanyi Wang, e Yonghong Yang hanno contribuito ugualmente a questo lavoro.
Riconoscimenti
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (81170395 e 81570556), della Natural Science Foundation of Jilin Province (20180101137JC e 20180101130JC), e del Research Fund for Lin He’s Academician Workstation of New Medicine and Clinical Translation in Jining Medical University (JYHL2019FMS21).
Materiale supplementare
I cambiamenti delle cellule infiammatorie e altri dati tumorali. Figura supplementare 1: i cambiamenti delle cellule infiammatorie nei topi portatori di tumore durante la fase iniziale della formazione del tumore trapiantato. Figura supplementare 2: i cambiamenti delle cellule infiammatorie in diversi gruppi durante la fase iniziale della formazione del tumore trapiantato. Figura supplementare 3: topi portatori di tumore e tessuti tumorali trapiantati. (Materiali supplementari)
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I 60 topi C57BL/6 sono stati divisi a caso in tre gruppi (20 topi per gruppo): il gruppo bidimensionale (2D) (animali inoculati con contenente), il gruppo del vettore vuoto (animali inoculati con contenente 30 μg microcarrier-6), e il gruppo 3D (animali inoculati con contenente e 30 μg microcarrier-6).
2.6. Generazione del modello animale
Il modello di coltura di cellule tumorali 3D è stato stabilito il primo giorno dell’esperimento e incubato per 24 ore. Il secondo giorno, i complessi cellula-microcarriera coltivati sono stati lavati tre volte e mescolati delicatamente con per regolare la concentrazione alle cellule e 300 μg microcarrier-6 per 1 mL di sospensione, e messi in ghiaccio per un uso successivo. Le cellule MKN45 in fase di crescita logaritmica sono state raccolte, tripsinizzate, lavate tre volte con , e risospese in ad una concentrazione di , che è stato posto su ghiaccio per un uso successivo. Il microcarrier-6 modificato è stato lavato tre volte con , risospeso in ad una concentrazione di 300 μg/mL, e posto su ghiaccio per un uso successivo. Ogni topo in tutti e tre i gruppi sperimentali è stato inoculato con 100 μL della soluzione corrispondente sotto la cresta ascellare destra.
2.7. Rilevamento degli indicatori ed esame patologico
Dopo l’inoculazione, i topi sono stati alloggiati separatamente per gruppo, e l’appetito giornaliero, le attività e il peso sono stati monitorati. Il tempo per la formazione del tumore locale e il volume del tumore in ogni topo è stato registrato. Una volta che i tumori erano visibili, il diametro lungo (a) e il diametro corto (b) di ogni tumore sono stati misurati quotidianamente, e il volume tumorale è stato calcolato secondo la formula del volume tumorale: . I topi portatori di tumore sono stati sacrificati in tre lotti: 10, 20 e 30 giorni dopo l’inoculazione. I tessuti tumorali sono stati completamente rimossi da ogni topo, e la qualità del tumore, la consistenza e il grado di infiltrazione e necrosi sono stati registrati. I tessuti tumorali sono stati successivamente fissati in formaldeide neutra tamponata al 4% e colorati con ematossilina ed eosina (H&E). La tecnica di colorazione in due fasi EnVision è stata usata per l’immunoistochimica. I risultati della colorazione sono stati determinati in base alla colorazione citoplasmatica granulare positiva del tumore. La colorazione negativa (-ve) è stata definita come <5% di cellule colorate positivamente, e la colorazione positiva (+ve) è stata definita come ≥5% di cellule colorate positivamente.
2.8. Analisi statistica
Per l’analisi statistica è stato utilizzato il software SPSS 13.0 (IBM SPSS, Chicago, IL, USA). I dati di misurazione sono presentati come media ± errore standard della media (SEM). Le differenze tra i valori medi di ciascun gruppo sono state confrontate utilizzando l’analisi della varianza a una via (ANOVA) o il test di Kruskal-Wallis come appropriato. è considerata una differenza statisticamente significativa.
3. Risultati
3.1. Stabilimento del sistema di coltura in vitro del tumore MKN45 3D usando il microcarrier-6
Il microcarrier-6 è un nuovo microcarrier composto da polimeri organici positivamente elettrificabili con una struttura porosa multistrato. La dimensione dei pori, la densità di carica superficiale positiva e le dimensioni della microportante-6 possono essere regolate tramite sintesi chimica. Tipo C microportante-6, piccolo volume, grande dimensione dei pori, e molte volte di piegatura dello spazio, è usato principalmente per la coltura cellulare 3D e gli esperimenti di sensibilità ai farmaci (Figure 2(a) e 2(b)). Tipo M microportante-6, grande volume, piccole dimensioni dei pori, e bassi tempi di ripiegamento interno, è utilizzato principalmente per la ricerca di ingegneria dei tessuti (Figure 2(c) e 2(d)). La microportante-6 di tipo C è stata usata nel nostro studio. Il microportante-6 è un composto organico puro che non è soggetto a contaminazione, non ha impurità, è basso in immunogenicità e metabolismo, ed è altamente biocompatibile, fornendo un microambiente stabile per la crescita cellulare (Figure 2(a)-2(d)). Inoltre, la microportante-6 è direttamente incorporata nella pelle dei topi, inducendo la crescita dei vasi sanguigni (Figure 2(e) e 2(f)), che può fornire un apporto di sangue sufficiente per la crescita delle cellule tumorali. Le cellule MKN45 hanno aderito rapidamente nell’ambiente 2D, e la morfologia cellulare osservata al microscopio dopo 24 ore di coltura ha mostrato una forma di poligono irregolare (Figura 1(a)). Il microcarrier-6 ha esibito una forma di fuso irregolare o lungo e una struttura sciolta (Figura 1(b)). A seguito di una cocoltura di 24 ore di MKN45 e del microportante-6 modificato, le cellule MKN45 hanno aderito bene al microportante e hanno raggiunto la confluenza. Inoltre, sono stati osservati cluster di cellule irregolari che circondano le cellule MKN45 aderite al microcarrier-6 (Figura 1(c)). I complessi MKN45 cellula-microportante sono stati colorati con una soluzione di 4,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI), rivelando un gran numero di cellule MKN45 aderite all’impalcatura microportante-6 (Figura 1 (d)). La struttura porosa multistrato dei microcarriers può essere osservata al microscopio elettronico a scansione (Figura 1(e)). Le cellule MKN45 hanno aderito ai microcarri, e le cellule aderite alla superficie hanno formato cluster di cellule (Figura 1(f)).
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3.2. Sopravvivenza del topo e formazione del tumore
Nessun cambiamento significativo nell’appetito, nel pelo o nel peso corporeo è stato notato tra i gruppi durante l’esperimento (Tabella 1). I topi del gruppo 3D hanno mostrato una leggera diminuzione dell’attività una settimana dopo l’inoculazione. Nessun animale è morto in nessun gruppo, e nessuna formazione di tumori è stata trovata nei gruppi con vettore vuoto o 2D durante i 30 giorni di esperimento. Masse sottocutanee in 15 dei 20 topi nel gruppo 3D sono stati identificati tramite palpazione 7-10 giorni dopo l’inoculazione, suggerendo un tasso di formazione del tumore del 75% (Tabella 1). Tumore xenotrapianti cresciuto rapidamente e sono stati osservati come masse sottocutanee circa 10 giorni dopo l’inoculazione (Figura 3 (a), Figura 3 supplementare). Tumore xenotrapianti cresciuto a 0.5-1.0 cm3 di dimensioni da 2 a 3 settimane postinoculazione. I tessuti xenotrapianti tumore sono stati facilmente separati dai tessuti adiacenti e presentato come forme relativamente regolari, per lo più rotondo o ovale, bianco grigiastro o rosso grigiastro a colori, e con un abbondante apporto di sangue periferico (Figure 3 (b) e 3 (c) e Figura 3 supplementare). Ci sono stati cambiamenti istologici del sito di iniezione nel gruppo del vettore vuoto, ma nessun cambiamento nel gruppo 2D (Figure 3(d) e 3(e)). Piccole masse sottocutanee sono stati osservati con un colore giallo nel gruppo vettore vuoto (Figura 3 (d)).
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3.3. H&E Staining
L’istomorfologia, vista al microscopio ottico, ha mostrato un gran numero di cellule disordinate e atipiche negli xenograft tumorali dei topi del gruppo 3D (Figure 4(a)-4(c)). Un gran numero di cellule eterotipiche, microcarri residui e vasi sanguigni abbondanti sono stati osservati, 10 giorni dopo l’inoculazione (Figura 4(a)). Un piccolo numero di microcarriers residui (Figura 4(b)) e un gran numero di lesioni necrotiche (Figura 4(d)) sono stati osservati, 20 giorni postinoculazione. Tuttavia, i microcarriers sono stati sostanzialmente eliminati 30 giorni dopo l’inoculazione (Figura 4(c)). Un gran numero di microcarriers e un piccolo numero di cellule infiammatorie sono stati osservati nel gruppo vettore vuoto, ma non sono state trovate cellule tumorali (Figura 4 (e)).
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3.4. Immunoistochimica
L’immunoistochimica è stata effettuata in animali eutanasia 20 giorni dopo lo xenotrapianto del tumore. I tessuti dello xenotrapianto tumorale hanno mostrato una colorazione positiva di CA199, CK-7 e CDX-2 (Figure 4(f)-4(h)), confermando ulteriormente che le cellule atipiche erano cellule tumorali di derivazione umana.
4. Discussione
I modelli animali sono stati ampiamente utilizzati per studiare la patogenesi e i meccanismi metastatici del cancro gastrico e svolgono un ruolo estremamente importante nella valutazione dell’efficacia e della tossicità dei farmaci terapeutici. Attualmente, i modelli animali di cancro gastrico includono principalmente i seguenti: il modello di induzione, il modello di trapianto e il modello di ingegneria genetica. Tra i tre tipi di modelli, il modello di trapianto è facilmente operabile e quindi ampiamente utilizzato. Il tipo di animali da esperimento, gli xenotrapianti tumorali e il sito e la via del trapianto sono stati considerati fattori che influenzano il successo dei modelli di xenotrapianto. Topi con difetti nella funzione immunitaria, come topi nudi e topi con immunodeficienza combinata grave (SCID), sono comunemente usati per modelli di xenotrapianto. Tuttavia, a causa del costo relativamente costoso, breve durata di vita, e la mancanza di risposta immunitaria ai tumori nei topi con immunodeficienza, abbiamo selezionato topi immunocompetenti C57BL/6 per il modello di xenotrapianto per evitare i difetti dei topi con immunodeficienza. Si ritiene generalmente che l’insorgenza del cancro gastrico non sia legata al livello di estrogeni, e l’incidenza del cancro gastrico nei maschi è superiore a quella delle femmine. Quindi, abbiamo usato topi maschi come modello. Inoltre, il presente studio ha utilizzato le cellule di cancro gastrico umano MKN45 per stabilire il modello in vitro soprattutto a causa delle forti caratteristiche invasive e metastatiche della linea cellulare. Inoltre, la regione sottocutanea ascellare e il trapianto ectopico sono stati selezionati come il sito e il percorso del trapianto di cellule tumorali, rispettivamente, come risultato dell’abbondante apporto di sangue e la struttura del tessuto sciolto di questa zona, che facilita la crescita del tumore nei topi.
Come un ponte tra il sistema di coltura cellulare 2D e il modello animale, il sistema di coltura cellulare 3D simula meglio il microambiente di crescita delle cellule tumorali ed è diventato un argomento interessante nella ricerca attuale. La cultura 3D di cellule tumorali formerà organiidi tumorali, e i modelli di xenotrapianto del tumore del topo basati su organoidi tumorali hanno cominciato ad essere applicati allo screening di farmaci antitumorali. Il presente studio ha utilizzato il nuovo microcarrier-6 e le cellule MKN45 per gli esperimenti di cocoltura per stabilire con successo un modello di crescita 3D. Abbiamo direttamente incorporato la microportante-6 nel tessuto sottocutaneo dei topi per consentire ai vasi sanguigni di entrare nei microportanti, presentando un vantaggio specifico che non è stato raggiunto con altri microportanti. Gli studi hanno riportato una lieve immunosoppressione dei topi immunocompetenti per ottenere la resistenza alle cellule tumorali umane, stabilendo con successo un modello di topo portatore di tumore; tuttavia, ad oggi, non ci sono rapporti di trapianto ectopico di successo di un tumore umano in topi normali in condizioni non immunosoppressive. Inoltre, quando abbiamo regolato la concentrazione di cellule MKN45 e iniettato immediatamente 100 μL di sospensione cellulare MKN45 per via sottocutanea in ogni topo, la formazione stabile del tumore non è stata raggiunta a causa della forte eliminazione immunitaria delle cellule tumorali umane trapiantate ectopicamente. La microportante-6 usata nel presente studio ha esibito una bassa immunogenicità e una struttura sciolta con numerosi pori al centro, facilitando la crescita delle cellule tumorali. La microportante-6 ha anche agito come una barriera per bloccare le cellule immunitarie dall’uccidere direttamente le cellule tumorali. La microportante-6 modificata ha permesso ai vasi sanguigni di crescere facilmente all’interno del tumore, fornendo le condizioni adatte per la rapida crescita delle cellule tumorali.
L’immunità cellulare è il principale esercito contro la crescita del tumore; le cellule coinvolte includono principalmente le cellule T, le cellule natural killer, i macrofagi e le cellule dendritiche. A causa della struttura irregolare “a labirinto” del microcarrier-6, esso può agire come una barriera a breve termine e bloccare l’uccisione diretta delle cellule tumorali da parte delle cellule immunitarie in una certa misura. Inoltre, tre ore prima dell’esperimento, la microportante-6 è stata ulteriormente modificata con SDF-1α e VEGF per accelerare la formazione di vasi sanguigni e fornire un apporto di sangue per una rapida crescita del tumore, che ha superato l’effetto immunitario antitumorale dei topi. Contemporaneamente, abbiamo trovato che i macrofagi nel sangue periferico e nei tessuti splenici dei topi erano significativamente diminuiti durante la fase iniziale della formazione del tumore trapiantato, rispetto al gruppo di controllo normale (Figura 1 supplementare). Il numero di macrofagi del midollo osseo è diminuito gradualmente tra il gruppo del vettore vuoto, il gruppo 2D e il gruppo 3D, ma non c’era alcuna significatività statistica (Figura supplementare 2A, 2B). Rispetto al gruppo di portatori vuoti, il numero di linfociti T della milza nel gruppo 2D era ridotto, ma non c’era alcuna significatività statistica (Figura supplementare 2C). Il numero di linfociti T della milza nel gruppo 3D era significativamente inferiore a quello del gruppo 2D (Figura supplementare 2C). Questo suggerisce che la crescita del tumore ha inibito il sistema immunitario, permettendo al tumore di crescere rapidamente.
Il presente studio ha stabilito un modello di crescita 3D delle cellule MKN45, stabilendo con successo un modello di xenotrapianto di cancro gastrico umano in topi immunocompetenti nel gruppo 3D, mentre i topi nei gruppi 2D e con vettore vuoto non hanno formato alcun tumore. Questo modello di xenotrapianto è stato caratterizzato dalla rapida crescita dei tumori, che potevano essere palpati a mano 7-10 giorni dopo l’inoculazione e hanno raggiunto una crescita ottimale entro 10-15 giorni dopo l’inoculazione; il volume del tumore era 0,5-1,0 cm3 circa 20 giorni dopo l’inoculazione. Un gran numero di cellule con atipie nucleari che avevano infiltrato i tessuti muscolari e grassi sono state rilevate dalla colorazione H&E. Il microcarrier-6 residuo era circondato da cellule infiammatorie e formava granulomi con una grande area di necrosi nel centro, che era probabilmente causata da un insufficiente apporto di sangue a causa della rapida crescita del tumore. Questi fenomeni sono coerenti con lo sviluppo del tumore nell’uomo. Inoltre, i capillari abbondanti erano principalmente situati nella periferia dei tumori. Attualmente, non esiste un marcatore tumorale specifico per il cancro gastrico; tuttavia, CA199, CK-7 e CDX-2 sono comunemente usati come marcatori dei tumori gastrointestinali. Così, abbiamo scelto questi tre marcatori per l’etichettatura e l’identificazione delle cellule tumorali gastriche di derivazione umana. La colorazione immunoistochimica di CA199, CK-7 e CDX-2 era positiva, confermando ulteriormente che le cellule eteromorfe erano cellule di cancro gastrico umano.
5. Conclusioni
Abbiamo stabilito con successo un modello di xenotrapianto di cancro gastrico umano in topi immunocompetenti. Questo modello può riflettere l’interazione tra il sistema immunitario del corpo e i tumori e ha ampie prospettive di applicazione nella ricerca futura sull’immunità tumorale così come la ricerca e lo sviluppo di nuovi farmaci.
Data Availability
I dati utilizzati per sostenere i risultati di questo studio sono disponibili dall’autore corrispondente su richiesta.
Conflitti di interesse
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Contributi degli autori
Yanzhen Bi, Quanyi Wang, e Yonghong Yang hanno contribuito ugualmente a questo lavoro.
Riconoscimenti
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (81170395 e 81570556), della Natural Science Foundation of Jilin Province (20180101137JC e 20180101130JC), e del Research Fund for Lin He’s Academician Workstation of New Medicine and Clinical Translation in Jining Medical University (JYHL2019FMS21).
Materiale supplementare
I cambiamenti delle cellule infiammatorie e altri dati tumorali. Figura supplementare 1: i cambiamenti delle cellule infiammatorie nei topi portatori di tumore durante la fase iniziale della formazione del tumore trapiantato. Figura supplementare 2: i cambiamenti delle cellule infiammatorie in diversi gruppi durante la fase iniziale della formazione del tumore trapiantato. Figura supplementare 3: topi portatori di tumore e tessuti tumorali trapiantati. (Materiali supplementari)
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