Abstract

Wnt5a è coinvolto nell’attivazione di diverse vie di segnalazione Wnt non canoniche, che possono inibire o attivare la via di segnalazione canonica Wnt/β-catenina in modo dipendente dal contesto del recettore. La segnalazione di Wnt5a è fondamentale per la regolazione dei normali processi di sviluppo, tra cui l’auto-rinnovamento delle cellule staminali, la proliferazione, il differenziamento, la migrazione, l’adesione e la polarità. Inoltre, l’attivazione o l’inibizione aberrante della segnalazione Wnt5a sta emergendo come un evento importante nella progressione del cancro, esercitando sia effetti oncogenici che tumorali soppressivi. Studi recenti mostrano il coinvolgimento della segnalazione di Wnt5a nella regolazione dell’auto-rinnovamento delle cellule staminali normali e tumorali, della proliferazione delle cellule tumorali, della migrazione e dell’invasione. In questo articolo, rivediamo le recenti scoperte riguardanti i meccanismi molecolari e i ruoli della segnalazione di Wnt5a nelle cellule staminali nell’embriogenesi e nel seno o nell’ovaio normale o neoplastico, evidenziando che Wnt5a può avere effetti diversi sulle cellule bersaglio a seconda dei recettori di superficie espressi dalla cellula bersaglio.

1. Introduzione

Le cellule staminali, comprese le cellule staminali embrionali e le cellule staminali identificate nei tessuti adulti, hanno la capacità di autorinnovarsi e di generare una progenie più differenziata. La cellula staminale embrionale deriva dalla massa cellulare interna della blastocisti, è pluripotente e può quindi generare tutti i tessuti del corpo. Le cellule staminali nei tessuti adulti risiedono in nicchie specializzate, dove integrano vari input di segnalazione ambientale e intrinseca che determinano il destino delle cellule e mantengono l’omeostasi dei tessuti.

I fattori Wnt sono un gruppo di queste molecole di segnalazione che agiscono sulle cellule staminali all’interno della nicchia delle cellule staminali per aiutare a mantenere la loro capacità di autorinnovamento. I fattori Wnt sono noti per legarsi a diversi recettori per trasdurre la via di segnalazione canonica o non canonica che regolano diverse attività biologiche. La via di segnalazione canonica Wnt è iniziata quando i fattori Wnt si legano ai recettori della famiglia Frizzled (Fzd) e ai corecettori della proteina 5/6 legata al recettore delle lipoproteine a bassa densità (LRP5/6) per formare complessi. Questo provoca il reclutamento di Axin e dishevelled (Dvl) alla membrana plasmatica e la rottura del complesso di degradazione della β-catenina, portando all’accumulo di β-catenina nel citoplasma, che poi trasloca al nucleo, dove si lega al fattore T-cellulare (TCF)/fattore enhancer linfoide (LEF) della famiglia e attiva la trascrizione dei geni bersaglio canonici Wnt. Al contrario, diversi fattori Wnt attivano vie indipendenti dalla β-catenina (vie di segnalazione Wnt non canoniche), note come la via Wnt-Ca2+ o la via della polarità cellulare planare (PCP), che agiscono per dirigere la migrazione cellulare durante l’embriogenesi.

Diciannove glicoproteine secrete ricche di cisteina della famiglia Wnt sono state identificate nei topi e negli uomini. Durante la prima embriogenesi dei mammiferi o il mantenimento dell’omeostasi dei tessuti adulti, questi fattori Wnt e i loro recettori sono espressi dinamicamente per attivare una segnalazione appropriata, per assicurare il giusto equilibrio tra proliferazione e differenziazione. La perturbazione della segnalazione Wnt con l’espressione aberrante dei fattori Wnt, dei loro recettori o delle molecole di segnalazione a valle può portare allo sviluppo di diversi tumori umani. Poiché la capacità di iniziare un tumore sembra essere limitata a una piccola popolazione di cellule tumorali che sono dotate della capacità di autorinnovamento e differenziazione, esse sono spesso denominate cellule staminali del cancro (CSC, o cellule di inizio del tumore). Ancora più importante, la biologia delle cellule staminali embrionali, delle cellule staminali normali e delle CSC è altamente correlata. Questo è evidente dal fatto che i segnali molecolari (ad esempio, la segnalazione Wnt) che definiscono e mantengono le cellule staminali embrionali o le cellule staminali adulte normali sono spesso attivati in modo aberrante nelle cellule tumorali.

Un obiettivo principale di questa revisione è il ruolo della segnalazione Wnt5a attraverso diversi recettori di superficie nella regolazione delle cellule staminali nell’embriogenesi e nel seno o nelle ovaie normali o neoplastiche, poiché ci sono già diverse recensioni eccellenti che coprono aspetti della segnalazione Wnt nel cancro del colon. Abbiamo riassunto gli ultimi progressi sulle vie di segnalazione che sono attivate da Wnt5a e che pongono un enigma per la progettazione razionale di farmaci volti a impoverire le CSC (o cellule di inizio del tumore) all’interno dei tumori, risparmiando la funzione dei tessuti normali.

2. Via di segnalazione Wnt5a

Wnt5a è un ligando Wnt non canonico che è evolutivamente conservato e svolge un ruolo importante nello sviluppo. I topi omozigoti Wnt5a knockout hanno letalità perinatale a causa di difetti di sviluppo. Studi precedenti hanno dimostrato che Wnt5a può interagire con Fzd2 e recettore tirosin-chinasi-come recettore orfano 2 (ROR2) per attivare Rac1 in un percorso β-catenina-indipendente. Più recentemente, abbiamo dimostrato che Wnt5a ha indotto l’eteroligermizzazione del recettore tirosin-chinasi-come recettore orfano 1/2 (ROR1/ROR2), che ha reclutato e attivato i fattori di scambio della guanina (GEF), che a loro volta hanno attivato RhoA e Rac1, rispettivamente, aumentando la chemiotassi delle cellule leucemiche e la proliferazione. D’altra parte, come un’altra azione di Wnt5a, compete con Wnt3a per il legame a Fzd2, inibendo così la fosforilazione LRP6 dipendente da Wnt3a e l’accumulo di β-catenina in vitro e in cellule intatte, inibendo la capacità di Wnt3a di indurre l’accumulo di β-catenina, e quindi inibendo la segnalazione Wnt β-catenina-dipendente.

Tuttavia, Wnt5a potrebbe anche attivare la via β-catenina-dipendente e indurre la formazione di assi secondari in embrioni di Xenopus che coesprimevano il recettore Fzd5. Successivamente, un altro studio ha trovato che Wnt5a potrebbe inibire la segnalazione canonica Wnt/β-catenina in cellule che esprimevano ROR2, ma anche potrebbe indurre la segnalazione canonica Wnt/β-catenina in cellule che esprimevano Fzd4 e LRP5. Così, un singolo ligando Wnt5a può avere effetti disparati sulle cellule a seconda della disponibilità del recettore. Pertanto, il contesto cellulare detta l’effetto di Wnt5a. Questo potrebbe spiegare l’osservazione che il Wnt5a potrebbe esercitare effetti oncogenici o tumorali soppressivi in diversi tipi di cancro.

3. La segnalazione di Wnt5a nelle cellule staminali embrionali

La via di Wnt (innescata da Wnt3a, Wnt5a, o Wnt6) potrebbe anche essere coinvolta nel mantenimento a breve termine della pluripotenza delle cellule ES sia murine che umane. La prima prova di ciò è stata fornita da uno studio di un inibitore farmacologico della glicogeno sintasi chinasi-3 (GSK3) che potrebbe modulare l’attività di GSK3, portando all’attivazione della segnalazione canonica β-catenina e all’aumento della stabilità di c-Myc. In seguito si è scoperto che Wnt5a e Wnt6 sono prodotti dalle cellule feeder di fibroblasti embrionali, che potrebbero inibire la differenziazione delle cellule ES di topo in modo dipendente dal siero. L’attivazione diretta della β-catenina, utilizzando β-catenina costitutivamente attiva (S33Y) senza disturbare i componenti a monte della Wnt/β-catenina, ha pienamente ricapitolato l’effetto delle Wnt sulle cellule ES. È importante notare che Wnt5a è anche un potente inibitore della fosforilazione della β-catenina, stabilizzando così la β-catenina. Questi dati suggeriscono che Wnt5a segnala di stabilizzare la β-catenina per attivare ulteriormente la segnalazione canonica Wnt/β-catenina nelle cellule ES del topo. Infine, il percorso Wnt/β-catenina può upregolare l’mRNA per STAT3, un noto regolatore di auto-rinnovamento delle cellule ES, suggerendo un meccanismo molecolare per cui il percorso Wnt/β-catenina agisce per prevenire il differenziamento delle cellule ES attraverso la convergenza sul percorso LIF/JAK-STAT a livello di STAT3. Tuttavia, quali recettori di superficie sono coinvolti nell’attivazione della segnalazione Wnt5a/β-catenina nelle cellule ES e se la segnalazione Wnt non canonica potrebbe anche essere attivata da Wnt5a nelle cellule ES rimane poco chiaro.

4. Wnt5a Signaling on Stem Cells in Normal Mammary Gland and Ovarian Tissues

Una linea di prove supporta l’importanza di Wnt nel mantenimento delle cellule staminali mammarie nella ghiandola mammaria. Tuttavia, Wnt5a non induce attività di transattivazione β-catenina/TCF nel tessuto della ghiandola mammaria. Le cellule della ghiandola mammaria sono iperproliferative nei topi knockout Wnt5a, mentre in presenza di Wnt5a ectopico, l’estensione duttale è inibita. Questi fenotipi sono l’inverso dell’attivazione della segnalazione canonica Wnt/β-catenina. Pertanto, Wnt5a può limitare e controllare la crescita della ghiandola mammaria sopprimendo la segnalazione Wnt/β-catenina. È sconcertante quindi che questa inibizione della crescita della ghiandola mammaria non sia stata osservata nei ceppi transgenici MMTV-Wnt5a.

Nel germinatoio di Drosophila, la segnalazione alterata di Wingless (Wg; l’omologo Wnt della mosca) avviene nelle cellule staminali germinali ovariche (GSCs) attraverso la rimozione dei suoi regolatori come dishevelled, armadillo, Axin e shaggy; questo causa la perdita di GSC, influenza la proliferazione delle cellule follicolari e induce la differenziazione. Utilizzando il targeting genico condizionale per Wnt5a nelle cellule della granulosa ovarica (GC) si ottiene la subfertilità femminile associata all’aumento dell’atresia follicolare e alla diminuzione dei tassi di ovulazione. Un ulteriore studio ha scoperto che Wnt5a regola i suoi geni bersaglio non segnalando attraverso la via Wnt/Ca2+ o la polarità cellulare planare, ma piuttosto inibendo la via canonica, causando la diminuzione dei livelli di proteina β-catenina e cAMP responsive element binding (CREB) attraverso una via glicogeno sintasi chinasi-3β-dipendente nelle cellule della granulosa ovarica (GC). Questi dati indicano che Wnt5a è richiesto per il normale sviluppo del follicolo ovarico e può antagonizzare la reattività alle gonadotropine nelle cellule della granulosa sopprimendo la segnalazione canonica Wnt/β-catenina.

Collettivamente, Wnt5a è più probabile che sopprima la segnalazione β-catenina nelle normali cellule staminali della ghiandola mammaria e nei tessuti ovarici, anche se Wnt5a è in grado di attivare la segnalazione β-catenina nelle cellule staminali embrionali. Se questa differenza sia dovuta a recettori che sono espressi in modo diverso nelle cellule staminali embrionali rispetto alle cellule staminali della ghiandola mammaria normale o dell’ovaio deve essere ulteriormente studiata.

5. Wnt5a Signaling in Breast Cancer Stem Cells

I fattori Wnt possono influenzare varie cellule epiteliali mammarie e indurre un’espansione delle cellule staminali durante la progressione tumorale. Inoltre, l’espressione aberrante di β-catenina è stata associata a tumori al seno basali, triplo-negativi e ad un cattivo esito clinico. Il verificarsi di un’aberrante segnalazione Wnt in specifici sottotipi di cancro al seno è meno probabilmente dettata dall’attivazione causata da mutazioni somatiche. Le mutazioni non sono state identificate in CTNNB1, che codifica la β-catenina, e le mutazioni in APC sono state identificate in meno del 20% dei campioni di pazienti con cancro al seno. Ulteriori indagini sono necessarie per determinare quali ligandi e recettori Wnt causano questa segnalazione aberrante Wnt/β-catenina.

Recentemente, uno studio su cellule primarie di topo MMTV-Wnt1 ha trovato che sia Wnt3a ricombinante che Wnt5a ricombinante potrebbero aumentare la formazione di mammospheres in vitro. La formazione di mammosfere indotta da Wnt5a non era causata da un aumento della segnalazione canonica Wnt/β-catenina, ma era invece mediata dalla segnalazione Wnt non canonica che richiede la tirosin-chinasi recettore ROR2 e l’attività della chinasi N-terminale Jun, JNK, nelle cellule di cancro al seno del topo. Questo è coerente con l’osservazione che i pazienti con tumori al seno che esprimono ROR2 avevano una sopravvivenza complessiva significativamente più breve rispetto a quelli con tumori privi di espressione di ROR2. Tuttavia, il silenziamento di ROR2 in linee cellulari di cancro al seno umano ha diminuito sia gli obiettivi β-catenina-dipendenti che quelli β-catenina-indipendenti, suggerendo che ROR2 può essere coinvolto in entrambe le vie di segnalazione Wnt β-catenina-dipendenti e β-catenina-indipendenti. ROR1 sembra essere espresso prevalentemente da tumori meno ben differenziati che hanno un alto potenziale di ricaduta e metastasi e che esprimono anche marcatori associati alla transizione epitelio-mesenchimale (EMT). Al contrario, il silenziamento di ROR1 nelle linee cellulari di cancro al seno umano potrebbe attenuare l’espressione dei geni associati a EMT e compromettere la loro capacità di migrazione/invasione in vitro e il loro potenziale metastatico in vivo. Molto recentemente, Chien et al. hanno riferito che l’espressione di ROR1 potrebbe essere un fattore prognostico avverso indipendente in pazienti con cancro al seno triplo-negativo. Se ROR1 può avere un effetto simile a ROR2 sulle cellule staminali del cancro al seno e quali vie di segnalazione sono attivate da ROR1 nelle cellule staminali del cancro al seno rimane sconosciuto.

Uno studio su un modello murino di cancro al seno indotto da ErbB2 ha trovato prove contrastanti sull’effetto di Wnt5a sulle cellule staminali del cancro al seno umano. Durante la tumorigenesi mammaria indotta da ErbB2, le cellule iniziatrici tumorali basali (TIC), che hanno esibito una maggiore capacità tumorale rispetto ai corrispondenti progenitori luminali, hanno perso preferenzialmente l’espressione di Wnt5a, come determinato dall’analisi del profilo dei trascritti. Inoltre, l’eterozigosi di Wnt5a ha promosso la molteplicità del tumore e la metastasi polmonare. Come substrato di TGFβ, Wnt5a prodotto dalle cellule luminali ha indotto un ciclo feed-forward che ha attivato SMAD2 in un modo dipendente da RYK e TGFβR1 per limitare l’espansione delle TIC basali in modo paracrino, una potenziale spiegazione dell’effetto soppressivo di Wnt5a sulla tumorigenesi mammaria. In questo modello di topo, rimane incerto se la segnalazione canonica Wnt/β-catenina è stata attivata o se Wnt5a ha anche inibito la segnalazione canonica β-catenina per sopprimere l’espansione delle TIC basali.

Il laboratorio Weinberg ha studiato cellule epiteliali mammarie umane immortalizzate (mMECs) e ha scoperto che sia le vie Wnt canoniche che non canoniche hanno cooperato con la segnalazione TGFβ non solo nel mantenimento, ma curiosamente anche nell’induzione, delle proprietà delle cellule staminali. Inoltre, solo i ligandi Wnt non canonici Wnt5a e Wnt16 sono stati trovati upregolati nelle cellule staminali rispetto alle cellule non staminali. Pertanto, è possibile che Wnt5a o Wnt16 possano attivare la via di segnalazione Wnt canonica o non canonica in un modo dipendente dal contesto del recettore nelle cellule staminali del cancro al seno umano.

6. Wnt5a Signaling in Ovarian Cancer Stem Cells

Simile al cancro al seno, l’effetto di Wnt5a sul cancro ovarico è anche controverso. Un primo studio sui tumori ovarici primari () che ha mostrato bassi livelli di Wnt5a nel cancro ovarico rispetto all’ovaio normale è predittivo di un cattivo esito. L’espressione ectopica di Wnt5a inibisce la proliferazione della linea cellulare di cancro ovarico umano OVCAR5 sia in vitro che in modelli di topo con cancro ovarico ortotopico in vivo. Meccanicamente, l’espressione ectopica di Wnt5a in OVCAR5 antagonizza la segnalazione canonica Wnt/β-catenina e induce la senescenza cellulare attivando il percorso di senescenza dell’istone repressore A (HIRA)/leucemia promielocitica (PML).

Al contrario, gli studi che hanno coinvolto un gran numero di pazienti hanno trovato che l’upregulation di Wnt5a era associato ad una prognosi relativamente povera. Rispetto alla frequenza di espressione di Wnt1 nel cancro ovarico, Wnt5a è stato trovato più frequentemente in pazienti con cancro ovarico epiteliale maligno (80% su un totale di 38). Da notare che le pazienti con tumori ovarici che esprimono alti livelli sia di Wnt1 che di Wnt5a avevano una probabilità significativamente più bassa di sopravvivenza a lungo termine rispetto alle pazienti con tumori ovarici che non esprimevano Wnt1 o Wnt5a. Inoltre, Wnt5a è prevalente nel liquido ascitico ottenuto da donne con cancro ovarico, suggerendo che contribuisce al microambiente del tumore ovarico. Questo è coerente con l’osservazione che alti livelli di Wnt5a sono associati ad un aumentato rischio di metastasi.

Mutazioni attivanti nel percorso canonico di Wnt sono rare nel cancro ovarico, con l’eccezione dei tumori ovarici endometrioidi. Il contributo della segnalazione Wnt canonica alla progressione del cancro ovarico rimane sconosciuto. Al contrario, gli studi sulla segnalazione non canonica Wnt/β-catenina mostrano che Wnt5a può regolare il cancro ovarico EMT, la migrazione o la metastasi attraverso vie di segnalazione non canoniche. Coerentemente con questa nozione, studi recenti hanno trovato che l’espressione di ROR1, un recettore di Wnt5a, era altamente espresso dai tumori ovarici di alto grado e meno differenziati e associato con una sopravvivenza libera da malattia relativamente breve e sopravvivenza complessiva rispetto ai tumori ovarici che non esprimevano ROR1. I tumori ovarici che esprimono alti livelli di ROR1 avevano firme di espressione genica associate alle CSC ovariche. Inoltre, l’espressione delle cellule tumorali di ROR1 è apparentemente correlata all’espressione di ALDH1 e alla capacità di formare sferoidi tumorali in vitro (entrambi marcatori di CSC). Trattando le cellule tumorali ovariche primarie derivate da pazienti xenotrapianti (PDX), che esprimono alti livelli di ROR1 con un mAb anti-ROR1 (UC-961 o cirmtuzumab), si è inibita la formazione di sferoidi e la migrazione in vitro e l’incisione e il reinnesto in topi immunodeficienti, indicando che ROR1 può influenzare il rinnovamento delle cellule staminali del cancro ovarico. Sono necessari ulteriori studi per determinare se Wnt5a è responsabile dell’influenza che ROR1 apparentemente ha sulla biologia delle cellule staminali del cancro ovarico.

7. Osservazioni conclusive

Wnt5a può svolgere un ruolo importante nello sviluppo delle cellule staminali embrionali e degli organi. Tuttavia, il ruolo di Wnt5a nelle cellule staminali tumorali è vario e complesso. Può sopprimere o promuovere la progressione del tumore. Per chiarire i meccanismi molecolari che guidano il comportamento cellulare alterato, sono necessarie ulteriori ricerche sull’espressione tessuto-specifica di recettori e corecettori specifici. In particolare, una comprensione più dettagliata del complesso cross-talk tra Wnt5a e recettori specifici che sono espressi nelle cellule staminali embrionali e che possono essere riespressi o riattivati nelle cellule staminali tumorali, ma non nei tessuti somatici normali (es, ROR1 e ROR2), può consentire lo sviluppo di inibitori specifici che bloccano la segnalazione aberrante e quindi hanno un impatto favorevole sulla sopravvivenza dei pazienti.

Conflitti di interesse

Gli autori dichiarano che non ci sono conflitti di interesse relativi alla pubblicazione di questo articolo.

Riconoscimenti

Questo studio è stato sostenuto dalla Breast Cancer Research Foundation (NIH Grant P01-CA081534), dal California Institute for Regenerative Medicine, dalla National Natural Science Foundation of China (NSFC, Grant no. 2016YFC009159), e dalla Science and Technology Foundation of Shenzhen, China (Shenzhen Peacock Innovation Team Project, Grant no. KQTD20140630100658078).