Principi del sequenziamento del bisolfito dell’intero genoma

Gli studi epigenetici hanno confermato che la modifica del DNA-metilazione di specifiche regioni geniche gioca un ruolo importante nella conformazione del cromosoma e nella regolazione dell’espressione genica. La metilazione dei residui di citosina del DNA al C5 (5meC) è un marchio epigenetico comune in molti eucarioti e si trova ampiamente in CpG o CpHpG (H=A, T, C). Ci sono principalmente tre approcci, tra cui la digestione con endonucleasi, l’arricchimento per affinità e la conversione con bisolfito (Tabella 1). Quasi tutti gli approcci di analisi sequenza-specifica della metilazione del DNA richiedono un trattamento dipendente dalla metilazione prima dell’amplificazione o dell’ibridazione per mantenere la fedeltà. Varie tecniche di biologia molecolare, come il sequenziamento di prossima generazione (NGS), vengono successivamente eseguite per rilevare i residui 5meC.

Tabella 1. Principi principali dell’analisi di metilazione basata su NGS.

*MCA: Amplificazione delle isole CpG metilate; *HELP: HpaII tiny fragment enrichment by ligation-mediated PCR; *MSCC: methylation-sensitive cut counting; *MeDIP-seq: methylated DNA immunoprecipitation; *MIRA: methylated CpG island recovery assay; *RRBS: reduced representation bisulfite sequencing; *WGBS: whole genome bisulfite sequencing; *BSPP: bisulfite padlock probes.

La conversione del bisolfito ha stimolato una rivoluzione nell’analisi della metilazione del genoma negli anni ’90. Poiché il bisolfito può convertire le citosine non metilate nel genoma in uracili e poi sostituite da timine durante l’amplificazione PCR, che possono essere distinte dalla citosina originariamente modificata dalla metilazione contando le citosine e le timine per ogni posizione dopo il sequenziamento (Figura 1). Il sequenziamento con bisolfito dell’intero genoma (WGBS), come metodo di ricerca di grande importanza in questo campo, applica una combinazione di trattamento con bisolfito e tecnologie di sequenziamento di prossima/terza generazione (principalmente, sequenziamento shotgun) per studiare la metilazione del DNA a livello genomico.

Figura 1. Conversione del bisolfito e amplificazione PCR prima del sequenziamento del DNA.

Svantaggi del sequenziamento del bisolfito dell’intero genoma

• Rendendo possibile il profiling della metilazione a livello di singola base.
• Valutando lo stato di metilazione di quasi ogni locus CpG, compresi i “deserti genici” intergenici, i domini di metilazione parziale e gli elementi regolatori remoti.
• Rivelando i livelli assoluti di metilazione del DNA e lo sfondo della sequenza di metilazione.

Flusso di sequenziamento del bisolfito dell’intero genoma

In breve, le fasi fondamentali del sequenziamento del bisolfito dell’intero genoma (WGBS) includono l’estrazione del DNA, la conversione del bisolfito, la preparazione della libreria, il sequenziamento e l’analisi bioinformatica. Qui usiamo Illumina HiSeq come esempio per illustrare il flusso di lavoro di WGBS.

Figura 2. Il flusso di lavoro del sequenziamento con bisolfito dell’intero genoma (Khanna et al. 2013).

• Estrazione del DNA

In primo luogo, circa 1-5 mg di campioni di tessuto raccolti da esseri umani, animali, piante o microrganismi sono preparati per il DNA. In generale, i campioni per il sequenziamento del bisolfito dell’intero genoma devono soddisfare le seguenti quattro caratteristiche.

i. Eucarioti;

ii. Ipometilazione (come mostrato nella figura 3, gli studi hanno dimostrato che una volta che il numero di siti CpG in una regione aumenta, i dati di sequenziamento del WGBS iniziano a diminuire);

iii. Il suo genoma di riferimento è stato assemblato almeno a livello di scaffold;

iv. Annotazioni del genoma relativamente complete. E poi, applicare un kit adatto per estrarre il DNA ad alta purezza e ad alto peso molecolare. Il DNA estratto dovrebbe avere una massa non inferiore a 5 μg, una concentrazione non inferiore a 50 ng/ul, e una OD260/280 di 1,8 a 2,0.

Figura 3. La tecnologia WGBS convenzionale ha una bassa copertura dei siti di metilazione (Raine et al. 2016)

• Conversione del bisolfito

La conversione del bisolfito è considerata il “gold standard” per l’analisi della metilazione del DNA, i principi sono stati mostrati nella Figura 4. Per questo metodo, la degradazione del DNA indotta dal BS può portare all’impoverimento delle regioni genomiche arricchite di citosine non metilate. Pertanto, è importante valutare la quantità di degradazione del DNA in condizioni di reazione, e come questo influenza l’amplicone desiderato dovrebbe anche essere considerato. Olova et al. (2018) hanno trovato che la degradazione del DNA è forte nei protocolli di conversione del bisolfito che utilizzano alta denaturazione o alta molarità del bisolfito. Ci sono diversi kit disponibili sul mercato (Tabella 2).

Figura 4. Deaminazione mediata dal bisolfito della citosina (Hayatsu et al. 2004).

Tabella 2. Protocolli e parametri di conversione del bisolfito.

• Preparazione biblioteca

Prendiamo come esempio il kit EpiGnomeTM Methyl-Seq (Epicentre) (come mostrato nella Figura 5), Il DNA a singolo filamento trattato con bisolfito viene innescato a caso utilizzando una polimerasi in grado di leggere i nucleotidi di uracile, per sintetizzare il DNA contenente un tag di sequenza specifico. L’estremità 3′ del filamento di DNA appena sintetizzato viene poi selettivamente etichettato con una seconda sequenza specifica, quindi si può ottenere una molecola di DNA a due marcatori con un tag di sequenza noto alle estremità 5′ e 3′. Illumina P7 e P5 adattatori vengono successivamente aggiunti tramite PCR alle estremità 5 e 3 prima del sequenziamento del DNA.

Figura 5. Flusso di lavoro per il kit EpiGnomeTM Methyl-Seq.

• Sequenziamento

La tecnologia di sequenziamento Hiseq, un nuovo metodo di sequenziamento basato sul sequenziamento per sintesi (SBS), è ampiamente applicata per WGBS. L’amplificazione a ponte su una cella di flusso è ottenuta utilizzando una matrice a molecola singola. Poiché la nuova tecnica di blocco reversibile può sintetizzare solo una base alla volta ed etichettare il fluoroforo, il laser corrispondente viene utilizzato per eccitare il fluoroforo, e la luce di eccitazione può essere catturata per leggere le informazioni di base. Paired-end 150 bp strategia è tipicamente impiegato in WGBS per sequenziare 250-300 bp inserimento bisolfito trattati librerie di DNA. Oltre a Illumina HiSeq, PacBio SMRT, Nanopore, Roche 454, e altre piattaforme Illumina sono anche comunemente utilizzati per questo scopo.

• Analisi dei dati

Una serie di analisi può essere eseguita per i risultati di sequenziamento. Cinque tipi principali di analisi delle informazioni sono elencati nella tabella 3. Inoltre, l’analisi della densità di metilazione, l’analisi delle regioni differenzialmente metilate (DMR), l’annotazione DMR e l’analisi di arricchimento (GO/KEGG) e l’analisi di clustering possono anche essere eseguite. Le risorse bioinformatiche comuni di WGBS includono BDPC, CpGcluster, CpGFinder, Epinexus, MethTools, mPod, QUMA, e TCGA Data Portal.

Tabella 3. Principali tipi di analisi dei dati WGBS.

Servizi caratteristici:

Sequenziamento bisolfito dell’intero genoma

Sequenziamento bisolfito mirato

ChIP-seq

Reducation Bisulfite Sequencing

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