8 Polimixine

Le polimixine sono una classe di decapeptidi ciclici cationici caratterizzati dalla presenza di cinque residui amminici caricati positivamente, dall’acido di-amminobutirrico (Dab), e una coda lipofila, come mostrato nella struttura della polimixina B1 (50). Dimostrano un’attività potente contro i batteri Gram-negativi e sono stati usati per la prima volta clinicamente negli anni ’50, ma l’uso è stato limitato da rapporti di tossicità, in particolare nefrotossicità. Tuttavia nell’ultimo decennio, con la crescente prevalenza di batteri Gram-negativi multi-resistenti ai farmaci, c’è stata una rinascita nell’uso delle polimixine come farmaci di ultima istanza

Ci sono molti svantaggi nell’attuale terapia con polimixine. La preparazione più comune in uso clinico è il prodrug della Polimixina E (Colistina) (51) noto come CMS (Colistina solfonato di metano), che è stato sviluppato negli anni ’60 come forma di dosaggio meno tossica. Tuttavia, essendo un prodrug con cinque gruppi amminici sulfonilati, la farmacocinetica è complicata e non ben compresa. La polimixina B viene dosata come sale solfato per infusione lenta per superare gli effetti tossicologici acuti, ma le preoccupazioni sulla nefrotossicità portano a un dosaggio sub-ottimale. Una polimixina di “seconda generazione” con un indice terapeutico migliorato e un regime di dosaggio sviluppato con la moderna metodologia PK-PD sarebbe un’aggiunta vantaggiosa all’arsenale contro le infezioni Gram-negative multiresistenti.

La modalità di azione delle polimixine non è completamente compresa. Le polimixine si legano al lipopolisaccaride (LPS) della membrana esterna dei batteri Gram-negativi e lo distruggono, permettendo il passaggio della polimixina (e di altri farmaci) nello spazio periplasmatico. Anche se le polimixine sono molecole anfifile cationiche, il legame e il riconoscimento alla membrana esterna è specifico. La delezione della catena grasso-acilica e dell’aminoacido 1 porta alla polimixina B nonapeptide (PMBN, (52)), che sebbene sia significativamente meno attiva della polimixina B, mantiene la capacità di permeabilitare la membrana esterna dei batteri Gram-negativi. L’enantiomero di PMBN, tuttavia, non è un permeabilitatore. È stato ideato un modello di legame della polimixina al lipide idrofobico A altamente conservato di LPS, basato su studi NMR della polimixina in complesso con LPS. In questo modello, le ammine caricate positivamente interagiscono con i fosfati di LPS, mentre la coda lipofila e la regione lipofila degli aminoacidi 6-7 del nucleo interagiscono con la coda lipidica di LPS. Alcuni derivati della polimixina senza una significativa attività antibatterica hanno dimostrato di legarsi all’LPS e di permeare i batteri all’azione di altri antibiotici.

Le relazioni struttura-attività delle polimixine sono state completamente riviste nel 2010 e da quella data ci sono stati ulteriori sviluppi nella chimica medicinale e nelle indagini pre-cliniche dirette sia a ridurre la tossicità che ad aumentare il livello di attività, in particolare contro ceppi emergenti multi-resistenti.

Le polimixine mostrano nefrotossicità a livelli vicini alla dose terapeutica, così come una serie di effetti tossicologici acuti poco caratterizzati. Il meccanismo della nefrotossicità è attualmente in fase di studio, tuttavia, si ritiene che sia legato alla natura cationica della molecola e all’accumulo all’interno delle cellule epiteliali tubulari prossimali renali, con l’assorbimento mediato dal recettore multi-ligando, megalina. La citotossicità è stata determinata nei tipi di cellule in cui il farmaco si accumula, per esempio le cellule tubulari prossimali renali umane (HK-2) o le cellule epiteliali del tubulo prossimale (PTEC), e può comportare danni mitocondriali, o il coinvolgimento di specie reattive dell’ossigeno.

Negli ultimi anni, una serie di approcci sono stati intrapresi per ridurre la tossicità e migliorare l’indice terapeutico delle polimixine. La sintesi totale di nuovi derivati della polimixina, attraverso la sintesi peptidica in fase solida, è stata la via principale, permettendo la manipolazione in qualsiasi punto della struttura della polimixina. Anche la semi-sintesi a partire dalla polimixina stessa è stata ampiamente utilizzata, attingendo alla capacità di vari enzimi di tagliare selettivamente la coda lipofila e la catena tripeptidica in posizioni specifiche. È stata anche ottenuta una protezione selettiva dei gruppi amminici terminali dei residui Dab, permettendo la semi-sintesi di una varietà di derivati del nonapeptide.

È stato riportato che la rimozione della coda lipofila e dell’aminoacido 1 per lasciare il polimixina B nonapeptide (PMBN) (52) porta a una significativa riduzione della nefrotossicità e dell’attività antibatterica, pur mantenendo la capacità della molecola di permeabilitare i batteri all’azione di altri antibiotici. Questa riduzione della tossicità è stata recentemente confermata da studi in vivo presso AstraZeneca , in cui l’istopatologia ha rivelato notevoli cambiamenti nei reni dei ratti trattati con colistina rispetto a quelli trattati con PMBN o controllo del veicolo.

In una serie di derivati privi della catena grasso-acilica, Katsuma e collaboratori hanno studiato gli analoghi della polimixina specifici per Pseudomonas. La sostituzione della catena grasso-acilica e dell’aminoacido 1 della polimixina con tutti i residui di base, come la catena Dab-Dab-Dab (53a), ha prodotto un’attività potente e selettiva per lo Pseudomonas in vitro, ma con una maggiore tossicità acuta nel topo. Un piccolo aminoacido idrofilo all’N-terminale (acido di-amino propionico (Dap), o serina) (53b,c) ha dato come risultato un’attività dello Pseudomonas in vitro comparabile alla stessa polimixina B. L’analogo del Dap (53b) ha mostrato una tossicità acuta 4,9 volte inferiore alla polimixina B nel topo. L’effetto sulla tossicità renale non è stato riportato in questa serie.

Un approccio adottato da Northern Antibiotics per ridurre la tossicità dei derivati della polimixina è stato quello di ridurre il numero di cariche positive nella molecola. Anche se i residui Dab nella porzione ciclica della polimixina hanno dimostrato di essere cruciali sia per il legame LPS che per la successiva attività antibatterica, il legame all’LPS può ancora avvenire in analoghi privi di residui amminici nella porzione lineare del peptide. Tali derivati possono agire come permealizzatori di altri antibiotici e alcuni hanno attività in proprio contro uno spettro più ristretto di organismi. Gli esempi includono i nonapeptidi NAB-7061 (54a) con aminobutirrato in posizione 3, e NAB-739 (54b) con d-serina in posizione 3. Entrambi mantengono la capacità della polimixina di permeabilitare la membrana esterna e agiscono sinergicamente con altri antibiotici. Sia NAB-7061 che NAB-739 hanno dimostrato un’affinità inferiore (circa un quinto in meno) per la membrana del bordo a spazzola della corteccia renale rispetto alla polimixina, come dimostrato in un saggio di spostamento della gentamicina radiomarcata. NAB-739 ha dimostrato una minore citotossicità in una linea cellulare HK-2 con valori IC50 approssimativamente 26 volte inferiori alla polimixina B. NAB-739 ha anche dimostrato attività antibatterica sia in vitro che in vivo. Mentre il profilo in vitro ha mostrato una buona attività contro E. coli e Klebsiella, l’attività era ridotta rispetto alla polimixina contro le specie Pseudomonas. NAB-739 ha dimostrato efficacia in un modello di infezione da E. coli, tuttavia, fino ad oggi non ci sono stati rapporti di studi di tossicità in vivo.

Cubist Pharmaceuticals ha riportato la riduzione della tossicità attraverso la sostituzione della coda lipofila della polimixina con un’urea arilica nel composto CB-182,804 (55). Finora questo è l’unico della nuova generazione di polimixine a progredire agli studi di fase I, dopo aver dimostrato una ridotta nefrotossicità nelle scimmie cynomolgous.

Pfizer ha recentemente riportato la sintesi di una varietà di derivati della polimixina in cui il Dab-3 della porzione lineare della catena aminoacidica è stato sostituito con l’acido di-amino propionico Dap, che è stato riportato per migliorare l’attività antibatterica. Una varietà di gruppi terminali biarilici è stata studiata con la conclusione che i composti con catene laterali più polari, come misurato da ClogD erano meno citotossici contro la linea cellulare renale hRPTEC, ma avevano una tendenza generale alla potenza antibatterica ridotta. Tuttavia, un particolare composto Pfizer, 5x (56), in cui la coda lipofila della polimixina è stata sostituita da una parte polare N-fenil-piridone, ha mostrato una tossicità in vitro notevolmente ridotta rispetto alla polimixina pur mantenendo l’attività. Il composto 5x è stato esaminato in vivo per il potenziale nefrotossico rispetto alla polimixina B nel ratto in uno studio di 7 giorni. A un livello di esposizione in cui la polimixina B ha prodotto lesioni renali necrotiche in ogni animale (anche se minime) (56) non ha mostrato alcuna incidenza di lesioni renali necrotiche. Tuttavia, nel cane, è stato riferito che non c’è un margine di sicurezza significativo di (56) rispetto alla polimixina B. Comprendere la relazione della tossicità in vitro alla situazione in vivo nelle polimixine è ancora un ostacolo da superare.

Cantab anti-infettivi ha riferito che i derivati non apeptidici della polimixina in cui la catena acilica contiene una funzionalità polare dimostrano una ridotta tossicità in vitro e in vivo pur mantenendo l’efficacia in vivo . Per esempio, il composto (57) è stato paragonato alla polimixina B in un modello di infezione della coscia del topo E. coli. Una dose totale di 10 mg/kg (i.v., b.i.d.) di (57) ha dato una riduzione di 4 log10 della carica batterica rispetto al controllo non trattato, mentre la stessa dose di polimixina ha ridotto la carica batterica di 4,8 log10. Risultati simili sono stati ottenuti in un modello di infezione da Klebsiella pneumoniae, dove (57) ha dato una riduzione simile della carica batterica (2,3 log10 di riduzione) alla colistina a 10 mg/kg. In vitro, (57) era sei volte meno citotossico della polimixina come misurato da IC50 contro la linea cellulare HK-2. In vivo, in un modello di ratto di nefrotossicità, (57) ha dato livelli significativamente più bassi di biomarcatori urinari di danno renale (N-acetil-beta-d-glucosaminidasi, albumina e cistatina C) rispetto alla colistina allo stesso livello di dose.

Un altro approccio è stato preso dal gruppo della Monash University, che ha studiato modifiche che mostrano attività contro ceppi resistenti. Le polimixine con una maggiore lipofilia agli aminoacidi 6 e 7 del nucleo e una catena lipofila, ad esempio FADDI-02 (58a) e FADD1-03 (58b) mostrano una migliore attività contro i ceppi resistenti di Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumanii rispetto alla polimixina B. La tossicità in vitro non è riportata; tuttavia, i composti sono stati valutati in un modello in vivo di nefrotossicità. L’esame istologico non ha mostrato lesioni nei ratti trattati con FADDI-03 rispetto ai segni positivi di danni ai reni negli animali trattati con polimixina B. Questa minore tossicità è stata attribuita all’alto legame sierico della molecola, impedendo l’accumulo nei reni.