TESTO

Il gene XRCC1 codifica una proteina molecolare scaffold che assembla complessi multiproteici coinvolti nella riparazione della rottura del singolo filamento di DNA (sintesi di Hoch et al., 2017).

Cellule umane fuse con linee mutanti dell’ovaio di criceto cinese (CHO), difettose in diversi geni per la riparazione per escissione del DNA in seguito a irradiazione ultravioletta (UV) o difettose nella riparazione in seguito a irradiazione X, producono ibridi che mantengono il gene umano che integra il difetto nella linea CHO quando viene selezionato in condizioni che richiedono la riparazione. Per produrre topi transgenici che portano una mutazione nel locus Xrcc1, Brookman et al. (1994) hanno clonato l’omologo murino di XRCC1 da entrambe le biblioteche cosmidiche genomiche e cDNA. L’analisi del cDNA ha indicato una struttura di lettura aperta di 1.893 bp che codifica una proteina di soli 631 aminoacidi, rispetto al polipeptide di 633 aminoacidi di XRCC1 umano. Lamerdin et al. (1995) hanno trovato che le proteine umane e del topo condividono l’86% di identità di sequenza.

Whitehouse et al. (2001) hanno riportato che XRCC1 interagisce con la polinucleotide chinasi umana (PNK; 605610) oltre alle interazioni con la DNA polimerasi-beta (POLB; 174760) e la DNA ligasi III (LIG3; 600940). Inoltre, queste 4 proteine sono coassociate in complessi multiproteici nell’estratto di cellule umane, e insieme riparano le rotture a singolo filamento tipiche di quelle indotte dalle specie reattive dell’ossigeno e dalle radiazioni ionizzanti. Sorprendentemente, XRCC1 stimola le attività di DNA chinasi e DNA fosfatasi di PNK ai termini del DNA danneggiato, accelerando così la reazione globale di riparazione. Questi dati hanno identificato un nuovo percorso per la riparazione della rottura del singolo filamento nei mammiferi e hanno dimostrato un ruolo concertato per XRCC1 e PNK nella fase iniziale dell’elaborazione delle estremità danneggiate del DNA. In vitro, Sano et al. (2004) hanno dimostrato che la forma lunga di aprataxina (APTX; 606350), ma non la forma corta, interagisce con il dominio C-terminale di XRCC1, suggerendo che aprataxina può essere coinvolta nel complesso di riparazione.

Bhattacharyya e Banerjee (2001) hanno scoperto che XRCC1 interagisce con un POLB troncato che è espresso nei tumori primari del colon-retto e del seno e inibisce la normale funzione di riparazione del POLB wildtype. Hanno determinato che l’interazione della variante POLB e XRCC1 è richiesta per l’effetto inibitorio dominante.

Loizou et al. (2004) hanno dimostrato che la caseina chinasi II (CK2; vedi 115440) fosforila XRCC1 e quindi permette l’assemblaggio e l’attività dei complessi proteici di riparazione della rottura del singolo filamento di DNA in vitro e nei siti di rottura del cromosoma. L’inibizione della fosforilazione di XRCC1 mediante la mutazione dei siti di fosforilazione di CK2 o impedendo l’attività di CK2 mediante un inibitore altamente specifico ha ablato la rapida riparazione delle rotture del singolo filo di DNA cellulare da parte di XRCC1. Questi dati hanno identificato un ruolo diretto di CK2 nella riparazione delle rotture del filamento di DNA del cromosoma e nel mantenimento dell’integrità genetica.

Luo et al. (2004) hanno fornito dati biochimici per dimostrare che esistono 2 complessi proteici XRCC1 preformati nelle cellule HeLa in ciclo. Un complesso contiene enzimi conosciuti che sono importanti per la riparazione della rottura di un singolo filamento, inclusi LIG3, PNK e POLB; l’altro è un nuovo complesso che contiene LIG3 e aprataxina. Luo et al. (2004) hanno riportato la caratterizzazione del nuovo complesso XRCC1. XRCC1 è fosforilato in vivo e in vitro da CK2, e la fosforilazione CK2 di XRCC1 su ser518, thr519 e thr523 determina ampiamente il legame di aprataxina a XRCC1 attraverso il suo dominio FHA. Una perdita acuta di aprataxina da piccolo RNA interferente rende le cellule HeLa sensibili al trattamento con metanesulfonato di metile attraverso un meccanismo di emivita ridotta di XRCC1. Così, Luo et al. (2004) hanno concluso che aprataxina gioca un ruolo per mantenere il livello proteico di XRCC1 allo stato stazionario. Luo et al. (2004) hanno concluso che, collettivamente, i loro dati forniscono informazioni sul meccanismo molecolare di riparazione della rottura del singolo filamento nella cellula e indicano il coinvolgimento di aprataxina in questo processo, collegando così la riparazione della rottura del singolo filamento alla malattia neurologica atassia-oculomotoria aprassia (208920).

Utilizzando fibroblasti umani primari, Moser et al. (2007) hanno dimostrato che XRCC1 e LIG3 erano componenti essenziali della riparazione dell’escissione del nucleotide (NER). La downregolazione di LIG3 ha compromesso la rimozione delle lesioni indotte dai raggi UV e la ricongiunzione delle tacche indotte dai raggi UV nel DNA cromosomico. Inoltre, XRCC1-LIG3 e polimerasi-delta (vedi POLD1; 174761) hanno interagito e colocalizzato con i componenti NER in modo UV-specifico durante l’interfase. Al contrario, il reclutamento di LIG1 (126391) e della polimerasi-epsilon (POLE; 174762) nei siti irradiati dagli UV è stato osservato solo nelle cellule in proliferazione. Moser et al. (2007) hanno concluso che le DNA ligasi e le polimerasi sono reclutate in modo diverso per la riparazione del DNA mediata da NER durante il ciclo cellulare.

Gao et al. (2011) hanno riferito che la DNA ligasi III è essenziale per l’integrità del DNA mitocondriale, ma dispensabile per la riparazione del DNA nucleare. L’inattivazione della ligasi III nel sistema nervoso del topo ha portato a una perdita di mtDNA che porta a una profonda disfunzione mitocondriale, a un’alterazione dell’omeostasi cellulare e a un’atassia invalidante. Allo stesso modo, l’inattivazione della ligasi III nel muscolo cardiaco ha provocato una disfunzione mitocondriale e una funzione difettosa della pompa cardiaca che porta all’insufficienza cardiaca. Tuttavia, l’inattivazione della ligasi III non ha provocato un deficit di riparazione del DNA nucleare, indicando che le funzioni essenziali di riparazione del DNA di Xrcc1 possono verificarsi in assenza della ligasi III. Invece, Gao et al. (2011) hanno scoperto che la ligasi I era critica per la riparazione del DNA, ma agiva in modo cooperativo con la ligasi III. Inoltre, la carenza di ligasi III non ha ricapitolato le caratteristiche distintive dell’inattivazione neurale di Xrcc1, come la perdita di interneuroni cerebellari indotta da danni al DNA, sottolineando ulteriormente la separazione funzionale di questi fattori di riparazione del DNA. Pertanto, Gao et al. (2011) hanno concluso che il ruolo biologico della ligasi III è quello di mantenere l’integrità del mtDNA e non la riparazione del DNA dipendente da XRCC1.

Simsek et al. (2011) hanno dimostrato un ruolo cruciale per la ligasi III del DNA nei mitocondri ma non nella riparazione dipendente da XRCC1. Simsek et al. (2011) hanno usato la complementazione preventiva per determinare il requisito di vitalità di Lig3 nelle cellule di mammifero e il suo requisito nella riparazione del DNA. Varie forme di Lig3 sono state introdotte in modo stabile in cellule staminali embrionali di topo contenenti un allele condizionale di Lig3 che poteva essere eliminato con la ricombinasi Cre. Con questo approccio, Gao et al. (2011) hanno scoperto che il Lig3 mitocondriale, ma non nucleare, è richiesto per la vitalità cellulare. Anche se la funzione catalitica di Lig3 è richiesta, i domini zinc finger e BRAC1 C-terminal-related di Lig3 non lo sono. Notevolmente, il requisito di vitalità per Lig3 può essere aggirato puntando Lig1 ai mitocondri o esprimendo la ligasi del DNA del virus Chlorella, l’enzima minimo eucariota di nick-sealing, o Escherichia coli LigA, una ligasi NAD(+)-dipendente. Le cellule Lig3-null non erano sensibili a diversi agenti dannosi per il DNA che sensibilizzano le cellule Xrcc1-deficienti. Simsek et al. (2011) hanno concluso che i loro risultati hanno stabilito un ruolo per Lig3 nei mitocondri, ma lo hanno distinto dalla sua proteina interagente XRCC1.

Lamerdin et al. (1995) hanno caratterizzato la struttura genomica di XRCC1 negli uomini e nei topi. Il gene umano ha 17 esoni e si estende per circa 31,9 kb.

Il primo gene complementatore di riparazione a raggi X (XRCC1) fu mappato a 19qcen-19q13.3 sulla base della perdita di marcatori 19p, del mantenimento di marcatori 19q prossimali e della perdita di marcatori 19q più distali (Siciliano et al., 1987). Con l’analisi meridionale del DNA di un pannello ibrido che utilizza sonde per i 3 geni di riparazione del DNA situati sul cromosoma 19, Thompson et al. (1989) hanno concluso che ERCC2 (126340) è distale a XRCC1 e nella stessa regione, cioè 19q13.2-q13.3, come ERCC1 (126380), ma su diversi frammenti di macrorestrizione MluI. Esperimenti simili utilizzando un pannello di cloni ibridi contenenti cromosomi di criceto cinese segreganti hanno mostrato che gli omologhi del criceto dei 3 geni di riparazione fanno parte di un gruppo di collegamento altamente conservato sul cromosoma 9 del criceto cinese. L’emizigosi del cromosoma 9 del criceto nelle cellule CHO può spiegare l’alta frequenza con cui le mutazioni geneticamente recessive sono recuperate in questi 3 geni nelle cellule CHO. Con l’ibridazione in situ a fluorescenza, Trask et al. (1993) hanno assegnato il gene XRCC1 a 19q13.2.

Con l’ibridazione in situ in metafase Brookman et al. (1994) hanno mappato il gene Xrcc1 del topo alla regione A3-B2 del cromosoma 7.

In una donna di 47 anni di origine indiana orientale con atassia spinocerebellare-26 autosomica recessiva (SCAR26; 617633), Hoch et al. (2017) hanno identificato mutazioni eterozigoti composte nel gene XRCC1 (194360.0001 e 194360.0002). Le mutazioni, che sono state trovate dal sequenziamento dell’esoma e confermate dal sequenziamento Sanger, hanno dimostrato di provocare livelli proteici significativamente diminuiti, coerenti con una perdita di funzione. Le cellule del paziente e le cellule XRCC1-null hanno mostrato livelli elevati di proteina ADP-ribosilazione derivanti da un aumento dell’attività di PARP1 (173870). Questi cambiamenti cellulari erano simili a quelli osservati in pazienti con mutazioni nel partner XRCC1 PNKP (605610) che hanno atassia-oculomotoria aprassia-4 (AOA4; 616267), che ha caratteristiche sovrapponibili. I risultati hanno identificato l’aumento dei livelli di ADP-ribosio come biomarcatore dell’iperattività di PARP1 e come causa dell’atassia cerebellare indotta da rotture non riparate del DNA a singolo filamento derivanti dalla perdita di XRCC1. Studi in topi con delezione Xrcc1 specifica per il cervello (vedi MODELLO ANIMALE) hanno mostrato che la delezione di Parp1 ha ablato i livelli di ADP-ribosio anormalmente aumentati, ha aumentato la densità neuronale nel cervelletto e ha migliorato le prestazioni motorie anche senza un effetto sulla riparazione delle rotture a singolo filamento. Hoch et al. (2017) hanno suggerito che PARP1 può essere un bersaglio farmacologico per il trattamento delle atassie cerebellari associate alla rottura del DNA a singolo filamento non riparata.

Hoch et al. (2017) hanno notato che la delezione germinale di Xrcc1 nei topi è embrionalmente letale. I topi con delezione condizionale del gene Xrcc1 nel cervello hanno mostrato atassia cerebellare con aumento dell’apoptosi dei neuroni granulari cerebellari, riduzione del numero di interneuroni cerebellari e diminuzione dell’attività elettrofisiologica dei picchi nelle cellule di Purkinje. Questi cambiamenti sono stati associati a un aumento dei livelli di ADP-ribosio cerebellare e all’iperattivazione di Parp1. La delezione di Parp1 ha ablato il livello elevato di ADP-ribosio, ha aumentato la densità neuronale nel cervelletto e ha migliorato le prestazioni motorie anche senza un effetto sulla riparazione della rottura del singolo filamento. I dati hanno dimostrato che in assenza di Xrcc1-dipendente riparazione del singolo filo di rottura, Parp1 è iperattivato, con conseguente perdita e/o disfunzione dei neuroni cerebellari.