WOX si trova sul braccio lungo del cromosoma 16 in un noto sito fragile. È composto da nove esoni e ha una dimensione di >1 Mb.1 Il trascritto canonico (ENST00000566780.5, NM_016373.3) codifica una proteina ubiquitaria di 414 aminoacidi (aa) altamente espressa nella prostata, nelle gonadi, nel seno, nei polmoni, nei tessuti endocrini e nel cervello.21,22 Lo splicing alternativo di WWOX durante l’elaborazione dell’RNA messaggero precursore (pre-mRNA) genera otto trascritti che sono stati osservati solo nei tumori; se ogni mRNA WWOX aberrante sia tradotto in proteina è sconosciuto.23 L’ossidoreduttasi contenente il dominio WW è l’unica proteina che accoppia due domini distinti con alte omologie sia con la famiglia del dominio WW che con la superfamiglia SRD. WWOX ospita due domini WW al termine amminico, un segnale di localizzazione nucleare (NLS) motivo e un C-terminale a catena corta deidrogenasi reduttasi (SDR) dominio (Fig. 1b). Un motivo di sequenza di destinazione mitocondriale (MTS) è stato anche mappato all’interno del dominio SDR tra aa 209 e aa 273 (rif. 24). WWOX contiene anche un sito di legame al coenzima, NAD(H) o NADP(h) (GANSGIG, aa 131-137), e un potenziale sito di legame al substrato (YNRSK, aa 293-297) (rif. 1). Il dominio C-terminale di WWOX (aa 125-414) è simile a una regione di interazione MAPT (http://www.uniprot.org/uniprot/Q9NZC7).

Varianti patogene germinali WWOX identificate in pazienti con disturbi costituzionali WWOX-correlati (SCAR12, sindrome WOREE, e DSD). a Variazioni del numero di copie (n = 12). DSD disturbo dello sviluppo sessuale, IF in frame, OOF out of frame, WOREE encefalopatia epilettica WWOX-correlata. b Variazioni singolo-nucleotide (n = 23). MTS sequenza di targeting mitocondriale, NLS segnale di localizzazione nucleare, SRD reduttasi deidrogenasi a catena corta.

WOX è tollerante alle variazioni missenso con una metrica di vincolo missenso Z = -3.19 (Exome Aggregation Consortium).20 Molte CNV eterozigoti che interessano tutto o parte di questo gene sono osservate in campioni di controllo sani (Database of Genomic Variants).25 L’alto numero di varianti patogene/probabilmente patogene nei database pubblici non è sorprendente considerando una modalità di eredità autosomica recessiva per l’encefalopatia WWOX-correlata.

WOX è espresso nel sistema nervoso dei topi in via di sviluppo, compresa la corteccia cerebrale e il cervelletto dalle fasi in utero all’età adulta.26 Modelli animali hanno dimostrato epilessia e atassia causata dalla perdita di WWOX,3,27 suggerendo un processo neurodegenerativo. In una dettagliata revisione della letteratura, Aldaz e collaboratori hanno chiaramente dimostrato che WWOX è all’incrocio tra cancro, sindrome metabolica ed encefalopatia.28

I dati clinici e molecolari per tutti i pazienti della letteratura con fenotipi SCAR12 o WOREE sono descritti nella tabella supplementare 3 (rif. 3,4,5,6,7,8,29,30). Due ulteriori pazienti, sorelle di una famiglia consanguinea araba con una variante omozigote WWOX (c.1228G>T; p.Gly410Cys), sono stati riportati anche da Alkhateeb et al. nel 2016 (rif. 9), ma ci sono dubbi sulla patogenicità della variante identificata in questi casi. Entrambi hanno presentato un ritardo nel linguaggio e uno ha avuto l’epilessia da 2 anni di età. La presentazione clinica in questa famiglia è molto lieve rispetto alla sindrome WOREE osservata in pazienti con varianti patogene germinali bialleliche in WWOX. Questo cambiamento da glicina a cisteina in posizione 410 colpisce un aminoacido alla fine del lato del terminale carbossilico della proteina. Inoltre questo cambiamento di aminoacido è presente in forma omozigote in due individui nel set di dati gnomAD. Anche se le previsioni in silico sono a favore della patogenicità di questa variante patogena missenso (possibilmente dannosa da PolyPhen-2), il suo ruolo causale è discutibile in questa famiglia. Abbiamo quindi deciso di escludere questi pazienti dalla nostra revisione della letteratura.

Segnaliamo qui sulla più grande coorte di individui con un fenotipo WOREE che consiste di 20 pazienti aggiuntivi con varianti patogene bialleliche in WWOX ereditate da genitori sani (Tabella supplementare 1). Le diagnosi molecolari sono state ottenute da una combinazione di diverse tecniche (array-CGH, qPCR/MLPA, sequenziamento Sanger mirato, ES e WGS). Aggregando i nostri pazienti con tutti i casi riportati finora in letteratura, sono noti 37 pazienti di 27 famiglie con una sindrome WOREE e varianti patogene WWOX bialleliche. Un totale di 29 diversi alleli patogeni / probabilmente patogeni (10 CNVs e 19 SNVs) sono stati identificati (Fig. 1a, b). Gli introni 5 e 8 del gene WWOX sono molto grandi con una dimensione di 220 e 780 Kb rispettivamente. Essi coprono il 90% della sequenza genomica WWOX e contengono breakpoint di traslocazione per il mieloma multiplo,28 in accordo con il fatto che le grandi regioni introniche sono spesso ricombinogene e inclini a breakpoint cromosomici. Di conseguenza, la duplicazione (un allele) e la delezione (cinque alleli) che comprendono gli esoni 6-8 sono le CNV patogene più frequenti osservate nei pazienti con disturbi WWOX-correlati (tabelle supplementari 1 e 3). Tutti i pazienti provenienti da famiglie consanguinee (10/27; 37%) sono risultati omozigoti per lo stesso allele deleterio, un evento comune nei disturbi autosomici recessivi con una bassa prevalenza. L’alta percentuale di famiglie con un genotipo che comprende uno o due CNV patogeni (14/27; 52%) evidenzia la necessità di un approccio quantitativo per lo screening del locus WWOX in pazienti con gravi disturbi del sistema nervoso centrale. Nei pazienti eterozigoti per una CNV che colpisce diversi esoni, è importante cercare (1) un possibile genotipo eterozigote composto per due piccole CNV e la necessità di una seconda analisi quantitativa tramite MLPA o qPCR in entrambi i genitori e (2) un SNV sul secondo allele tramite sequenziamento Sanger mirato. Allo stesso modo, quando l’ES o il sequenziamento mirato del pannello genico viene eseguito come indagine di prima linea, la ricerca di CNVs è essenziale in questo grande gene incline a delezioni e duplicazioni, coinvolgendo tutte o parte delle sue sequenze codificanti.

In questo studio riportiamo otto nuove varianti patogene missenso (Tabella supplementare 2). Tra i risultati di sequenziamento ad alta produttività dell’esoma e del pannello genico mirato, le varianti missense WWOX sono numerose. La loro patogenicità è difficile da stabilire perché WWOX ha numerose funzioni e partner proteici. Abbiamo seguito l’American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) linee guida31 per interpretare e annotare le varianti missense nei dati WWOX per classificarli come patogeni, probabilmente patogeni, varianti di significato sconosciuto (VUS), probabilmente benigni, o benigni. Per aiutare il nostro processo di interpretazione delle varianti, abbiamo usato uno strumento online apertamente disponibile (http://www.medschool.umaryland.edu/Genetic_Variant_Interpretation_Tool1.html/) per classificare in modo efficiente le varianti in base alle categorie di evidenza delineate dalle linee guida ACMG.31 Quattro modifiche aa (p., p., p., p.) sono associate in trans con varianti nulle in un gene in cui la perdita di funzione è un meccanismo di malattia noto. Tutte le varianti missense identificate in individui con encefalopatia WWOX-correlata (11 modifiche aa in 12 famiglie, Tabella supplementare 2) sono previsti per essere malattia-causare da una combinazione di software basati sul web. Ancora più importante, nessuno è presente in stato omozigote in gnomAD.20 Tutte le varianti missense sono classificate come patogene o probabilmente patogene secondo le raccomandazioni ACMG. Un paziente (P19) è portatore di tre diverse varianti missense patogene: p.; (Tabella 1 supplementare). La p.(Lys200Glu) e la p.(Thr358Ile) sono situate in cis; entrambi i cambiamenti aminoacidici sono previsti essere probabilmente patogeni anche se la treonina in posizione 358 non è situata in un dominio funzionale noto. Non è possibile determinare se una o entrambe queste varianti siano la variante missense che causa la malattia in P19. Nella maggior parte dei casi qui riportati e pubblicati nella letteratura medica, le variazioni di sequenza WWOX sono descritte a livello del DNA di base. Tutte le varianti patogene missense tranne una (P3; p.) sono interpretate sulla base di studi in silico senza prove sperimentali (nessuna sequenza di RNA o proteina analizzata). In P3, l’analisi dell’RNA totale tramite sequenziamento Sanger dei prodotti PCR a trascrizione inversa (RT-PCR) non è riuscita a rilevare alcuna anomalia di splicing nei leucociti. Gli studi sull’RNA non sono stati eseguiti per altri pazienti perché i campioni di sangue appropriati non erano disponibili al momento della diagnosi molecolare. Gli SNV esonici potrebbero influenzare i siti di splicing fisiologici accettore/donatore, ma anche gli esonici splicing enhancer (ESE) e gli esonici splicing silencer (ESS). Inoltre, l’attivazione di siti di splicing criptici da SNVs è un meccanismo patologico ben compreso in molti disturbi genetici; un buon esempio di questo è la sindrome di progeria di Hutchinson-Gilford.32 Le varianti missense potrebbero anche avere un impatto sulla stabilità dell’mRNA.33 Fino al 10% delle varianti missense note associate alla malattia, ma solo il 3% degli SNPs comuni, alterano lo splicing pre-mRNA.33 È probabile che una frazione delle varianti missense predette identificate nei pazienti con encefalopatia WWOX-correlata risulti in una perdita di espressione dovuta a splicing anomalo. Questo è tanto più probabile per un gene con alleli patogeni a perdita di funzione. Per le varianti patogene missense nel dominio SRD, l’assenza di substrati identificati rende difficile valutare il loro impatto sull’attività catalitica di WWOX. La caratterizzazione di modelli animali knock-in come lo zebrafish darebbe indizi sulla patogenicità delle varianti missense di WWOX.

In un paziente non incluso in questo studio, una diagnosi molecolare di encefalopatia WWOX-correlata è stata inizialmente sospettata di fronte a un genotipo biallelico costituito da due SNV in trans: un nonsense (ENST00000566780.5:p.Gln72*) e una variante missense (ENST00000402655:c.600T>A, p.Ser200Arg). Il cambiamento di aa in posizione 200 colpisce solo una proteina WWOX non-RefSeq di 311 residui. Finora, tutti i cambiamenti di aa patogeni sono stati descritti in base alla proteina WWOX canonica (414 aa), che risulta dalla traduzione di un trascritto di 9 esoni (ENST00000566780.5, isoforma 1). Non è noto se l’isoforma della proteina WWOX composta da 311 residui sia rilevante per i disturbi WWOX-correlati. Inoltre, il fenotipo in questo paziente era lieve rispetto alla sindrome WOREE. Per questi motivi, abbiamo deciso di non considerare questo genotipo come causativo per l’encefalopatia in questo paziente.

WOX, cancro e malattia polmonare?

WOX è un gene soppressore del tumore coinvolto nella modulazione delle vie legate al cancro attraverso interazioni proteina-proteina tra i domini WW e varie proteine oncogene. La perdita della proteina WWOX è stata trovata in molteplici neoplasie.23 Osteosarcomi e carcinomi polmonari sono osservati in topi Wwox-/-22 e la tumorigenesi è una delle conseguenze di un genotipo ipomorfico Wwox.34 Una perdita funzionale di copia CNV (67048) in WWOX è stata significativamente associata ad un aumentato rischio di cancro nelle popolazioni cinesi.35,36,37 Più recentemente, è stato dimostrato che la perdita di espressione di WWOX nel polmone dei topi causa un’infiammazione neutrofila.38 Sorprendentemente, l’aumento dei casi di cancro non è mai stato riportato né nei pazienti con varianti patogene germinali WWOX bialleliche né nei loro genitori eterozigoti. La gravità della sindrome WOREE con un’alta frequenza di morte prematura nei primi anni di vita potrebbe spiegare l’assenza di tumori. Questa non è una spiegazione convincente per i pazienti eterozigoti per un allele WWOX nullo. L’ablazione di Wwox non è tumorigenica in tutti i modelli animali knockout; questo gene soppressore putativo del tumore è più probabile che sia rilevante nella progressione del tumore piuttosto che nell’inizio durante l’oncogenesi. Questo studio conferma che le alterazioni germinali di WWOX non sono varianti patogene importanti per l’inizio e/o la progressione del cancro.

WWOX e DSD

WOX è altamente espresso in tessuti regolati ormonalmente come l’ipofisi, i testicoli e le ovaie, e si presume che abbia un ruolo nella biosintesi delle gonadotropine o degli steroidi sessuali.1,39 Il dominio enzimatico SRD in WWOX si pensa abbia un ruolo nel metabolismo degli steroidi con substrati non ancora identificati. Queste osservazioni e la descrizione di due diversi modelli di topi knockout WWOX con anomalie gonadiche34,39 supportano chiaramente un ruolo di WWOX nello sviluppo delle gonadi.

Il primo riarrangiamento germinale di WWOX nell’uomo era associato a una DSD 46, XY.2 Il paziente aveva tessuto gonadico indifferenziato bilaterale e testicoli immaturi. Era eterozigote per una delezione degli esoni 6-8 ereditata da sua madre che aveva una storia personale di menarca tardivo. Questa CNV è prevista per risultare in una delezione in-frame, causando un prodotto accorciato con il dominio SRD in gran parte mancante. Più recentemente, tre VUS eterozigoti nel gene WWOX sono stati identificati da ES in pazienti con DSD (Fig. 1) (rif. 40). A nostra conoscenza, DSD non è stato riportato in genitori eterozigoti di pazienti con sindrome WOREE e crediamo che l’implicazione di SNVs/CNVs eterozigoti nell’eziologia molecolare di DSD è discutibile. L’atrofia testicolare, la ridotta fertilità, le anomalie gonadiche, la disfunzione delle cellule di Leydig e l’alterazione dello sviluppo mammario fanno parte dei fenotipi osservati in diversi modelli animali di ablazione WWOX.28 A nostra conoscenza, la DSD non è riportata in modelli animali knockout eterozigoti. Tuttavia, rimane la possibilità che un fenotipo più lieve potrebbe essere identificato dopo un’attenta valutazione dello sviluppo sessuale e della funzione gonadica in pazienti eterozigoti per una variante patogena WWOX.

Fenotipo SCAR12

Nel 2014, varianti patogene omozigoti missenso in WWOX sono state identificate da ES in sei pazienti di due famiglie consanguinee con atassia spinocerebellare autosomica recessiva (SCAR12). Finora, questa associazione non è stata confermata in altre famiglie. I pazienti affetti hanno presentato con atassia cerebellare infantile, epilessia tonico-clonica generalizzata, disabilità intellettuale e spasticità prominente.3 Rispetto ai pazienti con sindrome WOREE, i pazienti con fenotipo SCAR12 hanno un ritardo di sviluppo meno grave: tutti erano in grado di camminare (4/4; 100%), 3 su 4 erano in grado di parlare, e nessuna morte prematura è stata riportata. Quando eseguita, la risonanza magnetica del cervello ha mostrato una lieve ipoplasia cerebellare (2/2; 100%) nei pazienti affetti, una caratteristica non osservata nella nostra coorte. Anche se l’epilessia era una caratteristica costante nei pazienti SCAR12, le crisi erano più spesso rispondenti ai farmaci antiepilettici (2/4; 50%). Il coinvolgimento degli occhi era anche presente con il nistagmo riportato in quattro pazienti. Questa forma di atassia cerebellare autosomica recessiva legata al WWOX sembra essere una rara condizione genetica. La gravità del fenotipo WOREE e la morte prematura in una parte dei pazienti potrebbero nascondere problemi di equilibrio legati alla disfunzione cerebellare. Ulteriori casi di atassia cerebellare WWOX-correlata sono necessari per confermare la sua implicazione in questo disordine neurologico.

Fenotipo WOREE

Poco dopo la descrizione del fenotipo SCAR12, WWOX è stato implicato in una forma recessiva di encefalopatia epilettica infantile in 17 pazienti di 9 famiglie.4,5,6,7,8,9,30 Abbiamo più che raddoppiato il numero di casi con 20 pazienti affetti in 18 famiglie aggiuntive. Il fenotipo dei nostri pazienti è coerente con quello dei rapporti precedenti. Abbiamo osservato un minor tasso di consanguineità nella nostra coorte in accordo con la più alta proporzione di genotipi eterozigoti composti descritti in questo studio. Questi genotipi potrebbero essere stati precedentemente mancati quando array-CGH o high-throughput sequencing sono stati eseguiti indipendentemente. L’implementazione della predizione di CNV dai dati di sequenza dell’esoma facilita l’identificazione dei pazienti con genotipi WWOX composti sia da SNV che da CNV.

Un feto con anomalie cerebrali e possibili crisi intrauterine è stato riportato nel 2015 (rif. 7). La diminuzione dei movimenti fetali è stata riportata occasionalmente nella nostra serie (3/20), mentre l’aumento della translucenza nucale era il segno più frequente durante la gravidanza nei rapporti precedenti (4/17). Le contratture di mani e piedi sono state riportate in 5 pazienti della nostra coorte e in 3 pazienti della letteratura4,5,6 nel periodo prenatale o neonatale. La diminuzione dei movimenti fetali, l’aumento della translucenza nucale e le anomalie delle mani o dei piedi potrebbero essere segni prenatali della malattia, ma non sono caratteristiche cliniche specifiche o frequenti.

In contrasto con la letteratura, il ritardo di crescita (6%) e la microcefalia (20%) non erano caratteristiche prominenti nei nostri pazienti che presentavano un’altezza media bassa normale (-1,1 SD) e un OFC medio (-1,4 SD). Il dismorfismo è stato riportato in più della metà dei pazienti. Le caratteristiche più evidenti erano un viso rotondo con guance piene, un collo corto e un aspetto facciale ipotonico (Fig. 2). Nei pazienti P15 e P16, in età più avanzata, l’ipotonia facciale era ancora presente ma il viso diventava più triangolare. Ulteriori problemi medici erano la scoliosi o cifosi di esordio precoce (65%), che potrebbe guidare la diagnosi, così come i problemi di alimentazione che richiedono un tubo di alimentazione nel 70% dei pazienti e problemi respiratori (40%), come visto in altre encefalopatie infantili.

Tutti i pazienti avevano un grave ritardo nello sviluppo. Nessuno di loro era in grado di sedersi, parlare o camminare. L’esame neurologico ha mostrato ipotonia assiale e ipertonia distale nella maggior parte dei pazienti. I movimenti distonici sono stati osservati occasionalmente. Come riportato in letteratura, tutti i pazienti avevano un’epilessia ad esordio precoce (100%) con crisi quotidiane e resistenza ai farmaci osservata nella maggior parte dei casi (95%). Non c’era una grande suscettibilità alle crisi febbrili. La sindrome di West caratterizzata da spasmi e ipsaritmia registrata sull’EEG è stata riportata nel 26% dei pazienti. Sono state osservate crisi focali, generalizzate e combinate. Sono state descritte crisi toniche, cloniche, tonico-cloniche e miocloniche, nonché spasmi e assenze infantili. Così l’epilessia era molto grave, di esordio precoce e con mainfestioni di crisi variabili. Come precedentemente descritto, il danno visivo sembra essere parte dello spettro clinico della sindrome di WOREE. La maggior parte dei pazienti affetti non aveva contatto visivo (75%). Circa la metà di loro ha presentato un fundus oculi alterato (47%) e/o test elettrodiagnostici (45%) suggestivi di atrofia ottica e/o distrofia retinica. L’esame oftalmologico precoce può quindi dare indizi diagnostici in pazienti con crisi precoci e ritardo dello sviluppo. La risonanza magnetica cerebrale (Fig. 3) era anormale nell’80% dei pazienti, mostrando principalmente ipoplasia del corpo calloso (75%) e atrofia cerebrale (55%). Abbiamo confermato nella nostra coorte che la morte prematura è una caratteristica della sindrome WOREE che si verifica in otto pazienti (40%) con un’età media alla morte di 40 mesi. La gravità dell’epilessia e il deterioramento neurologico possono essere collegati alla morte precoce nei pazienti affetti.

Risonanza magnetica cerebrale (MRI) di individui con la sindrome da encefalopatia epilettica WWOX-correlata (WOREE). a-j Corpo calloso ipoplasico sui piani sagittali. k-q Atrofia cerebrale e spazi subaracnoidei ingranditi sui piani assiali (P4, P6, P14) e coronali (P3, P7, P17). r-t Ipersegnale simmetrico della materia bianca su T2 assiale. u-v Plagiocefalia e ventricolo laterale asimmetrico su piani assiali T2. w P19 lesioni circolari sagittali T1 (iposegnale) della parte mediale del corpo calloso. m mese, P paziente, y anno di età.

I principali segni clinici in pazienti precedentemente pubblicati con WOREE sono riassunti nella Tabella 4 supplementare. Da questa revisione possiamo concludere che la WOREE è un’encefalopatia epilettica molto grave caratterizzata da scarsa mobilità spontanea, assenza di sviluppo del linguaggio e acquisizione della deambulazione, crisi resistenti ai farmaci ad esordio precoce, coinvolgimento oftalmologico e un’alta probabilità di morte prematura. Le caratteristiche dismorfiche (viso rotondo ipotonico, guance piene e collo corto) e la deformità della colonna vertebrale possono essere segni associati precoci che possono sostenere la diagnosi.

Correlazioni fenotipo/genotipo

Le correlazioni fenotipo/genotipo sono state recentemente suggerite per i disturbi del neurosviluppo WWOX correlati5,7 con una classificazione dei genotipi WWOX in tre gruppi. Secondo la classificazione provvisoria, i pazienti portatori di due alleli nulli predetti avevano maggiori probabilità di presentare il fenotipo WOREE più grave, mentre i genotipi ipomorfi con due varianti missense risulterebbero invece in atassia spinocerebellare (SCAR12). Il fenotipo dei pazienti portatori di un allele nullo e di una variante missense patogena sarebbe intermedio.5 Il nostro grande studio fornisce una rivalutazione di queste correlazioni preliminari.

La presentazione clinica più grave sembra essere associata a genotipi costituiti da codoni di stop prematuri precoci corrispondenti a WWOX full knockdown. Questi genotipi sono stati osservati in sette pazienti: delezione omozigote dell’esone da 1 a 4 in P10, codoni di stop omozigoti p.(Arg54*) e p.(Trp44*),4,30 delezione omozigote dei primi sei esoni.7 La morte prematura prima dei 2 anni si è verificata in 5/7 casi e anomalie cerebrali sono state rilevate prenatalmente in una famiglia. Inoltre, la morte prematura non è mai stata descritta in pazienti con genotipo missenso variante patogena solo (Tabelle supplementari 1 e 3). La caratterizzazione precisa di varianti missense e CNVs a livello della proteina con studi funzionali può dare alcuni indizi su come i genotipi potrebbero spiegare diverse presentazioni cliniche, soprattutto per quanto riguarda SCAR12/WOREE fenotipi.

In conclusione, varianti patogene germline in WWOX sono chiaramente associati con una grave encefalopatia epilettica ad esordio precoce chiamato sindrome WOREE e riportiamo qui sulla più grande coorte di individui con questo disturbo neurologico. L’implicazione delle varianti costituzionali WWOX in DSD e SCA ha ancora bisogno di studi di replica.

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