Abstract

Sono stati raccolti campioni di siero di 474 uccelli selvatici, 378 cavalli e 42 esseri umani con meningite e meningite linfocitica tra il 2010 e il 2014 da diverse aree della Polonia. Gli anticorpi del virus del Nilo occidentale (WNV) sono stati rilevati utilizzando saggi immunosorbenti legati a un enzima di competizione: ELISA-1 ID Screen West Nile Competition, IDvet, ELISA-2 ID Screen West Nile IgM Capture, e ELISA-3 Ingezim West Nile Compac. Gli anticorpi sono stati trovati in 63 (13,29%) su 474 campioni di siero di uccelli selvatici e in uno (0,26%) su 378 campioni di siero di cavallo. Quattordici (33,33%) su 42 sieri di pazienti erano positivi all’antigene WNV e un siero era dubbio. I campioni positivi ottenuti negli uccelli sono stati successivamente ritestati con il test di microneutralizzazione del virus per confermare i risultati positivi e le reazioni incrociate con altri antigeni del complesso dell’encefalite giapponese. Sospettiamo che i risultati sierologici positivi negli esseri umani, negli uccelli e nei cavalli indicano che il WNV può essere in qualche modo strettamente legato all’ecosistema in Polonia.

1. Introduzione

Il virus del Nilo occidentale (WNV) può colpire una vasta gamma di specie di uccelli, cavalli ed esseri umani. Il virus è un agente emergente responsabile di malattie in questi animali e nell’uomo in tutto il mondo. I principali vettori del WNV sono diverse specie di insetti succhiasangue, che possono trasmettere il virus agli uccelli, ai cavalli e all’uomo.

Le infezioni sono caratterizzate da un’elevata piressia, paralisi e morbilità causate dai fattori finora riconosciuti come patogeni solo per gli animali. Più spesso le infezioni sono caratterizzate da segni clinici lievi.

Il virus del Nilo occidentale è nella lista dell’Organizzazione mondiale per la salute animale (OIE) come fattore neurotropico che causa la malattia sotto l’obbligo di notifica. La febbre del Nilo occidentale (WNF) causata dal virus è una zoonosi, che è il principale problema di salute pubblica negli Stati Uniti.

WNV è un arbovirus appartenente alla famiglia Flaviviridae, genere Flavivirus incluso nel complesso antigenico dell’encefalite giapponese indotta da virus dell’encefalite giapponese (JEV), virus dell’encefalite di St. Louis (SLEV), Murray Valley encephalitis virus (MVEV), e Usutu virus (USUV). Il genoma ssRNA+ del virus contiene un singolo frame di lettura aperto da 11.000 a 12.000 nucleotidi. Il genoma del virus consiste di sette proteine non strutturali, NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, e NS5, e tre proteine strutturali: glicoproteina E, proteina del nucleo C, e proteina premembrana prM.

Gli uccelli tropicali e migratori, che appartengono a diverse specie, sono il principale serbatoio del virus. Il lignaggio 1 del WNV è un lignaggio isolato in tutto il mondo, ma il lignaggio 2 è stato isolato solo in Africa e in Madagascar, fino ai focolai ungheresi di WNV, causati da un nuovo lignaggio 2, che è stato introdotto in Ungheria, molto probabilmente da uccelli migratori dall’Africa, nel 2004. Lo stesso lignaggio 2 ha causato nell’estate del 2010 la malattia neuroinvasiva endemica (WNND) negli esseri umani in Grecia con 262 casi confermati e 35 morti. Nel 2011 il virus si è diffuso nella Grecia centrale, ma con meno casi, 101 diagnosticati e 9 morti. Il numero totale di persone in Grecia infettate dal virus è stimato a 18000.

Oltre 300 specie diverse di uccelli sono state infettate dal WNV. Di solito, il virus circola tra gli uccelli selvatici e le zanzare in ciclo chiuso e può essere trasportato dagli uccelli durante le loro migrazioni verso le diverse regioni.

Il virus è presente in molti paesi del mondo e anche in 20 paesi europei, compresi i paesi che sono vicini alla Polonia, dove la presenza del virus è stata confermata. La presenza di anticorpi WNV è stata confermata anche in campioni di siero di uccelli selvatici e umani in Polonia.

Nel 2010, la morbilità e la mortalità umana causata dall’infezione da WNV sono state segnalate in Grecia, Russia, Romania, Italia e Israele. la circolazione del virus Usutu è stata confermata anche in Polonia. Non sono stati pubblicati altri studi sulla circolazione di altri virus responsabili del complesso dell’encefalite giapponese in Polonia.

Lo scopo dello studio è stato il rilevamento di anticorpi WNV in campioni di siero di diversi uccelli selvatici, cavalli e pazienti ospedalizzati con sintomi neurologici.

2. Materiali e metodi

Uccelli. Campioni di siero di 474 uccelli selvatici, 400 cicogne bianche (Ciconia ciconia), 21 fagiani comuni (Phasianus colchicus), 19 fringuelli comuni (Fringilla coelebs), nove anatre selvatiche (Anas platyrhynchos), quattro aquile di mare (Haliaeetus albicilla), due galli cedroni occidentali (Tetrao urogallus), sei piccioni viaggiatori (Ectopistes migratorius), tre astore del nord (Accipiter gentilis), due corvi incappucciati (Corvus cornix), tre astore del nord (Accipiter gentilis), e un rondone comune (Apus apus), merlo comune (Turdus merula), storno comune (Sturnus vulgaris), corvo comune (Corvus corax), e poiana comune (Buteo buteo), sono stati raccolti in diverse località della Polonia (Giardini Zoologici, Centro di riabilitazione degli animali protetti). Tuttavia, la maggior parte dei campioni deriva dal Centro di riabilitazione degli uccelli selvatici, Fondazione Albatros. I campioni sono stati raccolti nel periodo marzo-ottobre, 2010-2014, quando l’attività della zanzara era la più alta (Figura 1).

Figura 1

Mappa della Polonia. Zone dove sono stati raccolti i campioni.

Cavalli. 378 campioni di siero sono stati ottenuti da cavalli domestici sani da alcuni ranch situati in quattro distretti. I campioni di siero sono stati prelevati anche da cavalli da corsa (Figura 1).

Uomo. Campioni di siero derivati da 42 pazienti (17 uomini e 25 donne) dal Dipartimento di Malattie Infettive e Neuroinfezioni, Università Medica di Bialystok. I pazienti presentavano sintomi neurologici caratteristici della meningite, della meningite linfocitica e dell’encefalite da zecche. Sono stati ricoverati tra maggio e settembre 2010. Tutti i pazienti sono stati testati per gli anticorpi del virus dell’encefalite da zecca con Enzygnost Anti-TBE/FSME Virus, Siemens. I campioni sono stati conservati a -20°C.

Tutti i campioni esaminati sono stati ricontrollati e testati in condizioni di biosicurezza 3+.

ELISA-1. Lo studio sierologico è stato eseguito con una competizione disponibile in commercio, ELISA ID Screen West Nile Competition (Innovative Diagnostics, Montpelier, Francia), per la rilevazione degli anticorpi del virus West Nile contro le proteine dell’involucro pr-E e pr-M contenenti un epitopo comune al virus dell’encefalite giapponese secondo il protocollo del produttore. Tutti i campioni sono stati esaminati due volte. Le micropiastre sono state lette a 450 nm. L’ELISA è stato convalidato quando sono state calcolate le razioni di legame residuo (S/N%). I campioni di siero con rapporti S/N uguali o inferiori al 40% sono stati considerati positivi; i campioni con rapporti superiori al 50% sono stati considerati negativi. I valori S/N tra il 40% e il 50% erano dubbi.

ELISA-2 è stato eseguito utilizzando ID Screen West Nile IgM Capture (Innovative Diagnostics, Montpelier, Francia). I pozzetti sono stati rivestiti con l’anticorpo policlonale IgM. Quando sono stati ottenuti risultati positivi, la presenza di anticorpi è apparsa come soluzione blu e dopo l’aggiunta della soluzione di stop è diventata gialla. In assenza di anticorpi, non è apparsa alcuna colorazione. Le piastre sono state lette a 450 nm.

ELISA-3 è stato eseguito utilizzando il test enzimatico Ingezim WNV Compac (Ingenasa, Spagna) basato sull’ELISA bloccante, in cui è stato utilizzato un anticorpo monoclonale (MAb) specifico per la proteina E del WNV. Se gli anticorpi erano presenti nei campioni di siero, si legavano all’antigene. Quando è stato aggiunto il MAb specifico per la proteina E, questo si è legato all’antigene che non è stato bloccato dagli anticorpi del campione di siero. In caso di anticorpi che bloccano l’antigene, il coniugato non si è legato. Il test è stato letto mediante una reazione colorimetrica dopo l’aggiunta del substrato. I campioni sono stati considerati positivi quando i valori di OD erano uguali o inferiori ai campioni di siero di controllo positivo. I campioni sono stati considerati negativi quando il valore OD era uguale o superiore al cut-off negativo. I campioni con valore OD nell’intervallo di entrambi i valori sono stati considerati dubbi.

Test di microneutralizzazione del virus. Il test di microneutralizzazione del virus con campioni ELISA positivi da uccelli selvatici è stato condotto nel Laboratorio Europeo di Riferimento, ANSES, Francia. Nel test sono state utilizzate cellule Vero e il virus del Nilo occidentale, ceppo IS-98-ST1. Il test si è basato sulla procedura standard dell’OIE.

3. Risultati

I distretti della Polonia e le aree in cui sono stati raccolti i campioni sono mostrati nella Figura 1.

La maggior parte dei campioni sono stati prelevati dagli uccelli durante l’assegnazione e i trattamenti veterinari. Alcuni uccelli erano al centro di riabilitazione dopo alcuni incidenti. Gli uccelli non hanno manifestato alcun sintomo di malattie neurologiche e nessun segno di infezioni neurologiche. Ogni uccello è stato fornito dall’organizzazione che ha inviato i campioni con le informazioni sulla posizione, il sesso, l’età e, quando è stato possibile, sulla storia del viaggio.

L’esame dei campioni di siero ha rivelato anticorpi specifici del WNV in 63 campioni di uccelli selvatici: 62 di cicogne bianche e uno di fringuello comune. Un campione di siero positivo è stato ottenuto da una cavalla.

Per quanto riguarda i campioni di siero umano, 14 su 42 erano positivi e uno era dubbio. Tutti i pazienti avevano una storia di punture di zanzare e zecche. L’encefalite da zecche è stata diagnosticata in 16 pazienti.

Per confermare i risultati, è stato eseguito l’ELISA-2 per rilevare gli anticorpi IgM specifici del WNV nel siero come prima linea di risposta immunitaria. I risultati sono stati negativi e quindi non hanno confermato la presenza di anticorpi IgM o qualsiasi prova di infezione recente degli animali.

Per verificare i risultati ottenuti con ELISA-1, è stato eseguito ELISA-3, e la presenza di anticorpi specifici WNV è stata confermata in questi casi. I risultati sono presentati nella tabella 1.

Per la conferma dei risultati positivi, i campioni di siero degli uccelli positivi sono stati ritestati con il test di microneutralizzazione del virus. Tutti i 63 campioni di siero di uccelli selvatici sono stati confermati e identificati come positivi per gli anticorpi WNV con il titolo 10 in 60 campioni e il titolo 30 in tre campioni. Per quanto riguarda gli esami di altri membri del JECV, i campioni erano negativi anche per il virus Usutu. Non sono state osservate reazioni di cross-reattività.

Il confronto dei risultati ottenuti con diversi metodi diagnostici (ELISA e test di microneutralizzazione del virus) è presentato nella tabella 1.

4. Discussione

Negli ultimi anni, è stato notato che il WNV si diffonde nei paesi con clima moderato. Le zanzare della famiglia Culicidae sono il vettore più comune della diffusione del virus e attualmente sei specie di zanzare esistono nella zona climatica polacca. Negli anni novanta del secolo scorso, Juřicová et al. utilizzando il test di inibizione dell’emoagglutinazione hanno confermato gli anticorpi WNV nel 12,1% dei passeri domestici (Passer domesticus) e nel 2,8% dei passeri eurasiatici (Passer montanus) nella zona della foresta di Campinas in Polonia. Negli anni successivi, gli anticorpi WNV sono stati trovati in tre cicogne, un corvo (Corvus corone cornix), e un cigno muto (Cygnus olor) sull’altra parte della Polonia.

Abbiamo eseguito tre diversi ELISA per presentare e poi confermare i risultati ottenuti. Il primo ELISA è stato ID Screen West Nile Competition, test specifico per il WNV, ma che dà anche reazioni incrociate sierologiche tra i membri del JECV. Quando sono stati ottenuti risultati positivi, è stato eseguito il test ELISA-2 West Nile IgM Capture, che è specifico solo per il WNV e permette di escludere le reazioni incrociate ma rileva solo le IgM. Ciò significa che possiamo identificare solo l’infezione recente e non possiamo rilevare gli anticorpi IgG. ELISA-3 è stato utilizzato per confermare i risultati ottenuti con ELISA-1 e i risultati sono stati confermati nel 100% dei casi.

Nel nostro studio, i risultati positivi con campioni di siero di uccelli selvatici ottenuti con gli ELISA sono stati confermati dal test di microneutralizzazione del virus. Inoltre, l’ELISA ha mostrato anticorpi WNV in 14 su 42 campioni di siero di pazienti con sintomi di meningite, meningite linfocitica ed encefalite da zecca, ma non siamo stati in grado di verificare i risultati ottenuti con il test di neutralizzazione a riduzione della placca (PRNT). L’infezione da WNV nell’uomo e l’identificazione del WNV nel liquido cerebrospinale sono state solitamente confermate mediante RT-PCR, Nested PCR, o in tessuti umani fissati in formalina e inclusi in paraffina mediante RT-PCR. Secondo lo studio di Czupryna et al. , tutti i campioni di liquido cerebrospinale di 24 pazienti ricoverati presso il Dipartimento di Malattie Infettive e Neuroinfezioni, Università Medica di Bialystok, erano negativi per WNV RNA.

Campioni di siero di esseri umani, uccelli e cavalli sono stati utilizzati come campioni adeguati per determinare gli anticorpi specifici di WNV. Se abbiamo confermato gli anticorpi specifici nei campioni di siero, l’animale o l’uomo è stato considerato come avente contatto con il virus (in Polonia o fuori dal paese). Si suppone che gli uccelli selvatici positivi potrebbero avere contatti con il virus al di fuori del paese. Per quanto riguarda i campioni umani positivi, 11 pazienti non hanno mai lasciato il paese; ciò significa che hanno dovuto avere il contatto con il virus già in Polonia. Lo stesso vale per i cavalli, che, secondo la loro storia di viaggio, non hanno mai lasciato il paese.

Sulla base della situazione epidemiologica in Europa, il ruolo degli uccelli selvatici nella trasmissione del WNV e i risultati di precedenti esami sierologici su esseri umani e uccelli indicano che la presenza del WNV in Polonia può essere possibile. In Polonia, gli anticorpi del WNV sono stati rilevati in donne febbrili e in lavoratori forestali sani delle regioni di Swietokrzyskie (28,85%) e Podlaskie (34,14%) . I nostri risultati sierologici possono suggerire che il virus è già presente nella nostra zona climatica e nel nostro ecosistema. La possibilità della sua reazione incrociata con i virus dell’encefalite da zecche e delle malattie endemiche deve essere presa in considerazione.

Approvazione etica

Lo studio è stato approvato dalla II Commissione Etica locale di Lublino (numero 92/2010 del 16 novembre 2010) e ha ottenuto il permesso del Direttore Generale della Protezione Ambientale (numero DOP-OZGŁZ. 6401.03.36.2011.dł).

Conflitto di interessi

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Gli autori desiderano ringraziare il supporto finanziario fornito dal progetto quadro P/020, Free Living Water Birds as a Reservoir and the Vector during the Expansion of Viral Diseases, e dal progetto quadro W/211, Development Diagnostic Methods and Risk Evaluation of the Occurrence of West Nile Virus Infection in Birds in Poland (2014-2018).