7.2 Architettura testicolare

Lue et al. (2005, 2010a) hanno riportato che i topi adulti 41,XXY hanno testicoli piccoli e sodi contenenti tubuli SCO di diametro ridotto con un numero maggiore di cellule di Leydig nell’interstizio. Questi risultati sono identici a quelli del modello alternativo di KS, il topo 41,XXY* (Lewejohann et al., 2009a; Wistuba et al., 2010, Fig. 24.2) e assomigliano perfettamente al fenotipo testicolare visto nella grande maggioranza degli uomini adulti KS (Fig. 24.3). Inoltre i topi 41,XXY mostrano un modello aberrante di espressione del recettore degli androgeni (AR), non osservato finora nel KS (Lue et al., 2005).

Figura 24.2. Figura 24.2. Fenotipo testicolare del modello di topo 41,XXY* di KS.

(A) Ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) dei cromosomi sessuali in nuclei interfasici ottenuti da campioni di sangue periferico di topi maschi del ceppo B6Ei.Lt-Y*. A sinistra: nuclei di leucociti di topi maschi 40,XY*, a destra: nuclei di leucociti di topi maschi 41,XXY*. (a) cromosomi Y* (punte di freccia) rilevati dalla sonda fluorescente verde specifica del topo; (b) cromosoma X (frecce) rilevato dalla sonda fluorescente rossa specifica del topo; (c) DAPI macchia nucleare; (d) sovrapposizione di a-c. Notare i due segnali del cromosoma X nei leucociti 41,XXY*. Un cromosoma X è sempre situato in stretta associazione con il segnale Y*. La parziale sovrapposizione di questi cromosomi può essere rilevata dal colore giallastro. (B) Confronto dei pesi bitesticolari tra maschi adulti 41,XXY* (n = 98) e i loro controlli con littermate 40,XY* (n = 91). La perdita di cellule germinali nei maschi con un cromosoma X soprannumerario ha portato a dimensioni del testicolo significativamente ridotte. I valori sono medi ± SEM. (C e D) Micrografie rappresentative dell’istologia testicolare dell’epitelio seminifero. (C) topo di controllo 40,XY* che mostra una spermatogenesi completa. (D) Testicolo del topo 41,XXY*. Tutte le cellule germinali sono state eliminate dall’epitelio seminifero lasciando la sindrome delle sole cellule di Sertoli. Le cellule di Sertoli mostrano l’inizio della vacuolizzazione. (E e F) Micrografie rappresentative dell’istologia testicolare dello spazio interstiziale. (E) Nei topi di controllo 40,XY* le cellule di Leydig sono normalmente disposte negli spazi interstiziali tra le pareti tubulari. (F) Al contrario nei topi 41,XXY*, il numero di cellule di Leydig è aumentato, formando un’iperplasia. Le barre rappresentano 20 μm. Simboli: X, cellule del Sertoli; *, cellule germinali differenzianti; #, cellule di Leydig. Colorazione: Ematossilina-Eosina.

Figura 24.3. Istologia del tessuto testicolare umano: Confronto tra la spermatogenesi normale e la sindrome SCO tipicamente osservata nei pazienti Klinefelter.

(A, C, ed E) Micrografie rappresentative dell’istologia testicolare umana normale che mostra la spermatogenesi completa. (B, D e F) Micrografie rappresentative dell’istologia testicolare di un paziente KS con sindrome SCO. (A e B) panoramica delle sezioni trasversali tubulari: mentre il tessuto di controllo mostra una normale distribuzione delle aree interstiziali e tubulari, la situazione SCO mostra una perdita completa delle cellule germinali e pareti tubulari ialinizzate. I tubuli seminiferi contengono solo cellule di Sertoli. (C e D) Dettaglio dell’epitelio seminifero: Nel controllo sono presenti tutti gli stadi delle cellule germinali fino agli spermatozoi maturi. Tipicamente negli uomini adulti KS, tutte le cellule germinali sono assenti. Le cellule del Sertoli mostrano l’inizio della vacuolizzazione. (E e F) Dettaglio dello spazio interstiziale. Nel testicolo di controllo, le cellule di Leydig sono normalmente disposte negli spazi interstiziali tra le pareti tubulari. Al contrario, nel tessuto ottenuto da un paziente KS, il numero di cellule di Leydig è elevato e mostra una tipica iperplasia. Le barre rappresentano 20 μm. Simboli: X, cellule del Sertoli; *, cellule germinali differenzianti; #, cellule di Leydig. Colorazione: Ematossilina-Eosina.

Le cellule di Sertoli sono situate nei tubuli seminiferi dove sostengono la differenziazione spermatogenica fornendo nutrimento e mediando la segnalazione endocrina (Wistuba et al., 2007). Come tale, qualsiasi alterazione in queste cellule essenziali influenza profondamente la funzione testicolare. Sono state trovate prove dell’apoptosi precoce delle cellule del Sertoli nel KS, il che porta alla proposta che la perdita di supporto e di comunicazione tra le cellule del Sertoli e le cellule germinali potrebbe essere collegata alla deplezione delle cellule germinali osservata nella sindrome (Aksglaede et al., 2006; Wistuba et al., 2010). Le cellule del Sertoli esprimono il recettore degli androgeni (AR) e producono la proteina legante gli androgeni e l’inibina. Qualsiasi perturbazione delle cellule, quindi, potrebbe influenzare la quantità di ITT negli spazi interstiziali e, di conseguenza, influenzare il feedback endocrino lungo l’asse ipotalamo-ipofisi-gonadi. Nessuna prova empiricamente robusta sulla presenza alterata delle cellule del Sertoli, lo sviluppo e/o la funzione potrebbe essere ottenuta fino a quando i primi risultati sistematici dai modelli sperimentali sono diventati disponibili. I risultati dei primi studi (Lue et al., 2005) sono stati di particolare interesse e importanza in quanto hanno mostrato che l’AR era espressa nelle cellule del Sertoli dei topi di controllo XY adulti ma non nei topi XXY. Questo nonostante entrambi gli animali avessero un modello simile fino al 20° giorno post-partum (pp), indicando che la perdita di espressione di AR nei topi XXY avviene intorno alla pubertà e suggerisce che in questi animali, la maturazione delle cellule del Sertoli può essere alterata indicando che possono influenzare o essere influenzate da uno sviluppo anomalo delle cellule germinali. Un certo credito a questa nozione è stato fornito da una valutazione istologica dei testicoli del modello 41,XXY*, che ha trovato il numero di cellule del Sertoli diminuito rispetto ai controlli.

Le indagini effettuate finora forniscono prove sufficienti per supporre che le cellule del Sertoli sono alterate nei maschi con un cromosoma X soprannumerario. Per comprendere i fondamenti dell’interazione delle cellule germinali del Sertoli, l’apoptosi delle cellule del Sertoli, la maturazione e la differenziazione, sono necessarie valutazioni più approfondite; studi che richiedono una notevole quantità di materiale e la registrazione della proliferazione, differenziazione e maturazione per un lungo periodo di tempo. Queste indagini sono impossibili da eseguire negli esseri umani. Solo con l’aiuto dei modelli murini è possibile intraprendere un’esplorazione significativa dei cambiamenti in questa cruciale cellula testicolare somatica.

È stato riportato che durante la degenerazione testicolare osservata nel KS anche le cellule di Sertoli degenerano nel tempo (Aksglaede e Juul, 2013; Aksglaede et al., 2006), un’osservazione che è in linea con i dati del nostro modello murino che dimostrano che il numero di cellule di Sertoli è alterato durante lo sviluppo postnatale (Werler et al., 2014). Nel complesso, la fisiologia alterata delle cellule del Sertoli richiede analisi più dettagliate di questo tipo di cellule somatiche già durante lo sviluppo prenatale. La propagazione e la differenziazione della linea germinale è in particolare influenzata dalle conseguenze dell’aberrazione cromosomica. Così, i principali punti di controllo e di conseguenza i processi che si verificano specificamente nella linea germinale potrebbero essere alterati dallo squilibrio cromosomico, cioè lo sviluppo del sistema di cellule staminali primordiali e spermatogoniche (PGC, SSC). Come accennato in precedenza, studi in vitro hanno dimostrato che le cellule germinali indifferenziate aneuploidi morivano quando isolate dalle gonadi embrionali e solo quelle con un cariotipo corretto in modo casuale sopravvivevano in coltura (Hunt et al., 1998; Mroz et al., 1999). Così, le SSC con un cariotipo aberrante devono essere entrate in un percorso predefinito durante la fase intrauterina ma al più tardi nel periodo perinatale. Quando solo le cellule germinali con un cariotipo corretto sopravvivono in vitro dopo essere state isolate dalla gonade embrionale, mentre le cellule germinali aberranti sono morte nel tempo, si pone la domanda, perché – in vivo – la perdita di cellule germinali progredisce postnatalmente come dimostrato recentemente (Werler et al., 2014). Anche se alcune cellule germinali aberranti sono ancora presenti nel testicolo perinatale, una certa percentuale di quelle presenti al momento della nascita dovrebbe essere di cariotipo corretto e la popolazione di cellule spermatogoniche dovrebbe almeno rimanere stabile se non propagarsi. Da questa osservazione in parte contraddittoria e accettando l’ipotesi più plausibile che la correzione per propulsione casuale spieghi la sopravvivenza di una popolazione ridotta di cellule germinali primordiali (PGCs; Mroz et al., 1999; Sciurano et al., 2009) e successivamente di gonociti nel periodo postnatale, alcuni di questi sopravvissuti potrebbero perdere le loro proprietà di cellule staminali già prima della nascita. Apparentemente si perdono durante la differenziazione peripuberale, mentre pochissimi possono occasionalmente sopravvivere, esprimere correttamente tutti i marcatori rilevanti e guidare i focolai di spermatogenesi. La valutazione sistematica dei cambiamenti fenotipici durante lo sviluppo in utero è di per sé possibile solo in un modello murino.

Il disturbo dell’asse HPG, che causa l’ipogonadismo ipergonadotropo comunemente visto nei pazienti KS insieme al suggerito aumento del numero di cellule di Leydig nelle biopsie testicolari ha portato all’ipotesi che la funzione delle cellule di Leydig e/o la maturazione potrebbe essere influenzata dallo squilibrio dei cromosomi sessuali. Le cellule di Leydig sono steroidogeniche e sono la fonte del testosterone che è essenziale per lo sviluppo del fenotipo maschile sano e cruciale per la continuazione e il completamento della normale spermatogenesi.

Come per gli altri aspetti del KS, il fattore limitante per qualsiasi indagine approfondita è il limitato accesso al tessuto testicolare. Con la disponibilità dei topi maschi 41,XXY*, gli studi sulle cellule di Leydig dei maschi con un cromosoma X soprannumerario sono diventati fattibili. Utilizzando questo modello abbiamo confermato la presenza di iperplasia delle cellule di Leydig come determinato dalla microscopia stereologica e abbiamo anche scoperto che i livelli di ITT erano simili a quelli dei topi di controllo (Wistuba et al., 2010). Questo è stato sorprendente considerando i bassi livelli sierici di T osservati nei pazienti KS e nei topi 41,XXY* (Lanfranco et al., 2004; Smyth e Bremner, 1998; Wistuba, 2010). In linea con i bassi livelli circolanti di T è stata la scoperta che una volta che le cellule di Leydig del modello KS sono state estratte dall’ambiente testicolare, coltivate in vitro e normalizzate per numero di cellule, la loro funzione era effettivamente alterata. Tuttavia, non era compromessa, come si potrebbe pensare, ma iperattivata. Quando i profili di espressione dell’mRNA dei geni marcatori Tsp2 (trombospondina 2: una proteina matricellulare di origine fetale che è prevalentemente espressa nelle cellule Leydig giovanili), Rlf (fattore relaxina-simile: marcatore delle cellule Leydig mature), Est (estrogeno sulfotransferasi: marcatore delle cellule di Leydig mature), e LHR (recettore LH: studiato per la correlazione con gli esperimenti di stimolazione delle cellule di Leydig, vedi più avanti) sono stati determinati, le cellule di Leydig isolate XXY* hanno mostrato un profilo di espressione di mRNA maturo e un’attività trascrizionale significativamente più alta rispetto ai controlli (Wistuba et al., 2010; O’Shaughnessy et al., 2002). L’analisi dell’espressione genica ha rivelato un aumento generale dell’espressione dei geni specifici delle cellule di Leydig XXY* con Est espresso approssimativamente 20 volte, Rlf 8 volte, Tsp2 5 volte e LHR 3 volte superiore rispetto alle cellule di Leydig wild-type. La stimolazione delle cellule di Leydig XXY* in vitro ha indicato un recettore LH maturo che ha risposto ancora più forte alla stimolazione della gonadotropina corionica umana (hCG, un surrogato di LH) rispetto alle cellule di controllo. Inoltre, l’attività steroidogenica delle cellule di Leydig XXY* era elevata, nel senso che veniva prodotto più T per cellula in risposta a hCG.

Questi risultati entusiasmanti non solo portano a un nuovo concetto sull’origine dell’ipogonadismo ipergonadotropo, ma dimostrano anche la validità del modello di topo KS, con le sue conseguenze traslazionali dirette per la nostra comprensione dei pazienti KS. I risultati del modello murino indicano che la funzione delle cellule di Leydig non è compromessa di per sé, suggerendo che altri fattori nell’ambiente testicolare sono responsabili dell’endocrinologia androgenica disturbata osservata nei pazienti KS. In particolare, come abbiamo potuto confermare anche nei pazienti che i valori ITT non erano diversi dai controlli (Tüttelmann et al., 2014). È possibile che l’alterazione dell’architettura testicolare associata al disturbo possa ostacolare il trasporto endocrino nella circolazione, una proposta che è stata sostenuta dai risultati che i pazienti KS hanno anche un diametro ridotto dei vasi sanguigni (Foresta et al., 2012). Tenendo conto di ciò, abbiamo cercato una possibile spiegazione “vascolare” per il mancato rilascio di T nel flusso sanguigno testicolare. Nelle biopsie del testicolo dei pazienti, un’analisi affidabile dei vasi non è tuttavia possibile a causa del bias risultante dalla tecnica di dissezione che richiede di evitare i vasi sanguigni più grandi per evitare il sanguinamento. Di conseguenza, la costituzione dei vasi sanguigni è stata valutata in sezioni di testicoli interi di topi maschi adulti 41,XXY* e 40,XY*. In effetti, il rapporto vasi sanguigni/superficie testicolare che corregge i testicoli più piccoli dei topi XXY* era significativamente inferiore in questi topi rispetto ai controlli XY*. In conclusione, la produzione testicolare di T non sembra essere compromessa negli uomini con KS. I dati del modello di topo ci permettono di ipotizzare che un ridotto apporto vascolare potrebbe essere coinvolto in un minore rilascio di T nel flusso sanguigno.