Trasformazione degli erbicidi da parte dei white-rot-fungi

E’ ben documentato che una vasta gamma di inquinanti, compresi i pesticidi, vengono trasformati e degradati dal WRF: pentaclorofenoli, isoproturone, derivato dell’isoxaflutolo, atrazina, simazina, propazina, lindano, atrazina, diuron, terbutilazina, metalaxil, DDT, dieldrin, aldrin, eptacloro, clordano, ecc. . Questa lista può essere ampliata data la forte evidenza del potenziale di degradazione della WRF verso diverse classi di inquinanti. I dati sulla degradazione degli erbicidi da parte della WRF sono riassunti in parte nella tabella 2. Va menzionato che un gran numero di lavori sono stati eseguiti usando condizioni stazionarie su mezzi liquidi e condizioni di fermentazione su sistemi solidi. Tuttavia, ci sono dati contraddittori sul livello di degradazione dell’erbicida, sul ruolo degli enzimi ligninolitici in questa procedura e sul meccanismo di degradazione.

Diversi funghi, come Agrocybe semiorbicularis, Auricularia auricula, Coriolus versicolor, Dichomitus squalens, Flammulina velupites, Hypholoma fasciculare, Pleurotus ostreatus, Phanerochaete velutina, e Stereum hirsutum hanno dimostrato la capacità di degradare vari erbicidi come atrazina, diuron, e terbuthylazine con diverse efficienze. Coriolus versicolor, Hypholoma fasciculare e Stereum hirsutum hanno degradato più dell’86% di diuron, atrazina e terbutilazina in 6 settimane. Erano anche i più attivi nella produzione di enzimi ligninolitici. Tuttavia, la capacità della WRF di degradare gli erbicidi aromatici, diuron, atrazina e terbutilazina, non era correlata alla loro attività ligninolitica determinata nel test di decolorazione Poly R-478 (che è usato come indicatore di attività ligninolitica). La possibile spiegazione di questi risultati era la differenza nei modelli LME prodotti dai funghi nelle colture liquide. È interessante che nelle prove sul campo il ceppo più efficace S. hirsutum era inattivo nella degradazione dell’erbicida e gli altri ceppi C. versicolor e H. fasciculare hanno dimostrato il 30% di degradazione del cloropyriphos in 6 settimane.

Funghi white-rot Phanerochaete chrysosporium e Trametes versicolor hanno convertito fino al 35-40% di diketonitrile (un prodotto di trasformazione del suolo dell’erbicida isoxaflutol) in analogo inattivo dell’acido benzoico dopo 15 giorni in condizioni stazionarie su supporti liquidi. Il livello di enzimi ligninolitici, come le laccasi, prodotti durante la fermentazione sembrava essere correlato alla degradazione dell’erbicida, confermando il ruolo di questi enzimi nei processi di degradazione. Tuttavia, gli autori hanno sottolineato che l’induzione della produzione di laccasi sestuplicata tramite l’aggiunta di 2,5-xilidina non ha portato ad alcun aumento significativo della scissione del diketonitrile.

È stato dimostrato che Coriolus hirsutus, Cerrena maxima, Coriolopsis fulvocinerea, e Coriolus hirsutus/Cerrena maxima co-coltivati possono degradare atrazina sotto coltivazione sommersa; la rimozione dell’erbicida era 77-91% dopo 40 giorni di coltivazione. È interessante menzionare che quantità trascurabili di atrazina sono state trovate assorbite dal micelio. L’attività della laccasi era piuttosto alta, permettendo di proporre la partecipazione della laccasi nella degradazione dell’atrazina da parte di questi funghi. Questa ipotesi è stata supportata dallo studio della degradazione dell’atrazina in presenza di induttori di laccasi (guayacol e syringaldezine) sotto coltivazione sommersa. L’efficienza della degradazione dell’erbicida era più alta nelle colture indotte del 78-98% e il più alto livello di rimozione dell’atrazina è stato raggiunto per Coriolopsis fulvocinerea usando il guaiacolo come induttore.

Hiratsuka et al. hanno riportato che Coriolus versicolor IFO 30340 ha degradato il 30% di cloronitrofene (CNP) e l’80% di nitrofene (NIP) dopo 12 giorni di coltivazione in condizioni stazionarie su terreni liquidi. Il tasso di degradazione dell’erbicida dipendeva dalla concentrazione di azoto nel mezzo ed era più alto in condizioni di basso azoto, suggerendo che il sistema degradativo della lignina era responsabile della degradazione dell’erbicida. Tuttavia, LiP, MnP, e laccasi così come il filtrato della cultura non hanno ossidato gli erbicidi. Né il cloronitrofene né il nitrofene sono stati ossidati dal sistema laccasi – mediatore redox utilizzando HBT, che è un noto mediatore redox della laccasi. Questi risultati portano alla conclusione che gli enzimi ligninolitici extracellulari non sono coinvolti nella fase iniziale della degradazione di CNP o NIP da parte di Coriolus versicolor IFO 30340. L’identificazione sequenziale dei prodotti formati durante il metabolismo di CNP e dei suoi intermedi da parte di C. versicolor ha permesso agli autori di proporre quattro diverse vie per la degradazione di CNP: idrossilazione aromatica, declorazione ossidativa, declorazione riduttiva e riduzione del gruppo nitro ad ammina. L’idrossilazione aromatica per formare 2,4,6-tricloro-3-idrossi-4′-nitrodifenil etere e la declorazione ossidativa per formare 2,4-dicloro-6-idrossi-4′-nitrodifenil etere sono stati assunti per catalizzare da citocromo P450-tipo enzima (s) perché questi percorsi sono stati efficacemente spento dalla aggiunta esogena di piperonyl butoxide, un inibitore P450. La conversione di CNP in NIP da parte di Coriolus versicolor IFO 30340 dovrebbe essere una declorazione riduttiva. Le reazioni di declorazione riduttiva sono state coinvolte nella degradazione del pentaclorofenolo da P. chrysosporium. Il CNP è stato anche convertito in 2,4,6-tricloro-4′-aminodifenil etere da C. versicolor. Le reazioni di declorazione riduttiva e di nitro-riduzione sono state trovate anche come reazioni iniziali nella degradazione del CNP, che sono state potenziate con l’aggiunta dell’inibitore del citocromo P450. L’idrossilazione aromatica e la declorazione ossidativa sono state osservate anche durante la conversione fungina di NIP; tuttavia, i prodotti formati non sono stati identificati – sono stati assunti per essere o 2, 4-dicloro-3-idrossi-4′-nitrodifenil etere o 2, 4-dicloro-6-idrossi-4′-nitrodifenil etere e 2-cloro-4-idrossi-4′-nitrodifenil etere o 2-hydroxy-4-chloro-4′-nitrodiphenyl etere, rispettivamente. La conversione fungina di NIP è stata anche efficacemente inibita dal piperonil butossido.

In base al risultato ottenuto, gli autori hanno ipotizzato che il citocromo P450 abbia giocato un ruolo importante nell’abbassare il potenziale di ionizzazione degli aromatici persistenti nell’ambiente e nel fornire substrati adatti agli enzimi ossidanti a un elettrone ligninolitici per una degradazione efficace. Quando l’etere difenilico, l’etere 4-clorodifenilico e l’etere 4-nitrodifenilico sono stati aggiunti alla cultura fungina, l’etere 4-idrossidifenilico, l’etere 4-cloro-4′-idrossidifenilico e l’etere 4-nitro-4′-idrossidifenilico sono stati identificati come i prodotti principali, rispettivamente. Il 4-clorofenolo e il 4-nitrofenolo sono stati rilevati in tracce dall’etere 4-clorodifenile e dall’etere 4-nitrodifenile, rispettivamente, ma l’idrochinone corrispondente non è stato osservato. Questi dati suggeriscono che la formazione di prodotti fenolici dall’anello A o B del CNP potrebbe essere derivata attraverso un percorso diverso, e che la scissione diretta dell’etere potrebbe non essere avvenuta. Questi risultati hanno dato la prova che i funghi degradano gli erbicidi attraverso diverse vie utilizzando i loro sistemi metabolici multipli.

Ganoderma lucidum ha dimostrato di essere resistente agli erbicidi diuron e bentazon: i limiti superiori erano 80 µM e 20 mM, rispettivamente. Questo risultato può essere spiegato dalla maggiore tossicità dei metaboliti formati durante la trasformazione del diuron. È stato riportato in precedenza che alcuni dei metaboliti risultanti dalla trasformazione fungina del diuron possono essere ancora più tossici del composto genitore. G. lucidum è stato in grado di rimuovere efficacemente il 55% del diuron e l’88% del bentazon dopo 10 giorni di coltivazione in colture liquide. Sia il bentazon che il diuron hanno fortemente migliorato la produzione di laccasi da parte del fungo inducendo una delle due isoforme di laccasi. L’analisi PAGE nativa degli enzimi extracellulari ha rivelato che il miglioramento dell’attività della laccasi in risposta agli erbicidi non era dovuto all’espressione di una nuova laccasi, ma alla sovrapproduzione di un’isoforma già esistente nelle culture non indotte. Risultati simili sono stati ottenuti con Trametes versicolor e Abortiporus biennis, dove le loro laccasi costitutive sono state iperprodotte in presenza di paraquat, un erbicida azotato quaternario. L’analisi elettroforetica degli enzimi extracellulari di G. lucidum ha mostrato che la laccasi1 era l’enzima dominante in condizioni non indotte. È interessante notare che gli erbicidi hanno indotto solo l’isoforma laccasi2 mentre la laccasi1 è stata soppressa in queste culture. Tali risultati suggeriscono che la laccasi2 è, probabilmente, l’isoforma più intensamente coinvolta nel sistema di difesa del fungo, considerando che entrambi gli erbicidi hanno fortemente inibito la crescita del fungo. Queste osservazioni dimostrano che questi tipi di enzimi hanno, almeno in parte, un ruolo importante nella degradazione degli inquinanti in condizioni in vivo.

E’ stato eseguito lo studio comparativo della degradazione dell’erbicida bentazon da parte del Ganoderma lucidum in colture liquide e allo stato solido utilizzando la pannocchia di mais come substrato. Il fungo era più resistente all’erbicida e più efficiente nella sua degradazione in colture allo stato solido rispetto alle colture liquide: 50 mM contro 20 mM e 90% contro 55%, rispettivamente. Gli autori hanno proposto due spiegazioni possibili, che non si escludono a vicenda: una minore disponibilità di erbicida a causa del suo adsorbimento al substrato insolubile pannocchia di mais per questa osservazione e le attività più elevate di entrambi laccasi e Mn perossidasi nelle colture in stato solido rispetto alle colture liquide, dove è stata rilevata l’alta attività della laccasi. Tuttavia, nessun prodotto metabolico è stato trovato negli estratti acquosi e metanolici combinati. Il G. Lucidum ha dimostrato che i filtri grezzi contenenti laccasi e Mn perossidasi sono in grado di degradare il bentazon in vitro. Gli esperimenti con l’aggiunta di Mn2+, ABTS, Tween 80, e H2O2 ai filtri grezzi hanno dimostrato sinergie nella degradazione del bentazon, suggerendo che sia la laccasi che la perossidasi Mn erano coinvolte nella sua degradazione. È noto che l’ABTS media l’ossidazione dei composti non fenolici della lignina e la presenza di acidi grassi insaturi (Tween 80) migliora il processo di ossidazione catalizzato da Mn perossidasi e laccasi a causa della produzione di radicali perossili o alcossili lipidici. L’ipotetico meccanismo di degradazione del bentazon può essere il seguente Mn perossidasi e laccasi generano radicali perossili o alcossili lipidici; in presenza di questi radicali Mn perossidasi ossida Mn2+ a Mn3+, che a sua volta ossida il bentazon, mentre la laccasi usa ABTS come mediatore redox per l’ossidazione del bentazon. Tuttavia, nessuna degradazione del picloram G. lucidum e Trametes sp. sono stati osservati in colture liquide, forse a causa della sua alta sostituzione dell’anello aromatico. Questo erbicida ha aumentato la produzione di laccasi da parte di Trametes sp., mentre la produzione dell’enzima da parte di G. lucidum è stata soppressa. Gli autori hanno ipotizzato che l’inibizione della produzione dell’enzima potrebbe avvenire a livello di mRNA dopo che il picloram è entrato nella cellula o tramite la modifica dell’enzima prima o dopo la secrezione. L’esposizione di G. lucidum e Trametes sp. al picloram ha rivelato un meccanismo peculiare di bioaccumulo transitorio dell’erbicida da parte di entrambi i funghi.

Il WRF più studiato è P. chrysosporium, che ha dimostrato di degradare una vasta gamma di erbicidi in condizioni diverse. MCPA e bentazon sono stati degradati da P. chrysosporium al 65% e 75%, rispettivamente, in 20 giorni. P. chysosporium degradato isoproturone appartenente ai gruppi fenilurea , atrazina , e anche diuron . Tuttavia, secondo , nessuna degradazione atrazina è stato osservato da questo fungo in colture liquide. L’efficienza di degradazione di P. chrysosporium era più alta nelle culture allo stato solido rispetto a quelle liquide. Due meccanismi di degradazione degli erbicidi sono stati proposti: l’azione degli enzimi ligninolitici e l’azione degli enzimi intracellulari in particolare il citocromo P450. In , la degradazione del diuron da parte di P. chrysosporium è stata studiata includendo l’identificazione dei prodotti formati e la valutazione del ruolo del citocromo P450. Due risultati sono stati di grande importanza: le considerevoli quantità di diuron, DCPMU e DCPU trovate nei miceli freschi e l’inibizione della degradazione del diuron da parte di ABT (1-aminobenzotriazolo), un inibitore del citocromo P450. Questi risultati hanno confermato il meccanismo intracellulare di degradazione di questo erbicida con conseguente N-demetilazione. Tuttavia, dopo 5 giorni le concentrazioni di DCPMU e DCPU erano più alte nei filtri culturali che negli estratti dei miceli, suggerendo un possibile coinvolgimento degli enzimi lignolitici nella degradazione di questi metaboliti. Secondo da Silva Coelho-Moreira et al. , gli estratti grezzi enzimatici forniti con combinazioni di alcool veratriale H2O2 e Mn2+ non hanno degradato l’erbicida, è possibile che DCPMU e DCPU possano essere ulteriormente trasformati da MnP.

P. chrysosporium è anche in grado di trasformare l’atrazina, il suo prodotto di trasformazione e altri erbicidi s-triazina . Il primo e principale passo nel percorso di degradazione della s-triazina clorurata da parte del fungo era la mono-N-dealchilazione. L’idrossiatrazina era il principale prodotto di degradazione trovato nei terreni trattati con atrazina e nelle colture liquide. P. chrysosporium ha trasformato attivamente l’idrossiatrazina in un composto sconosciuto che si è accumulato nel terreno di coltura. È stato stabilito che la presenza di entrambi i gruppi alchilici e il cloro nella posizione 2 sono necessari per la mono N-dealchilazione dell’atrazina da parte di P. chrysosporium. Di conseguenza, la formazione di desetilidrossiatrazina nelle colture liquide dovrebbe risultare dall’idrolisi della deetilatrazina. Gli esperimenti con terbutilazina, atrazina e simazina mostrano anche che la rimozione della catena laterale etilica è la reazione preferenziale, e potrebbe dipendere dalla massa del secondo gruppo alchilico. In altre parole, ci si aspetta che i composti con un gruppo ad alta massa legato ad un sostituente amminico subiscano una maggiore N-dealchilazione che colpisce l’altra catena. Anche i composti simmetrici propazina e simazina sono stati degradati ad un tasso più lento dell’atrazina. Né LiPs né MnPs hanno trasformato l’atrazina e i suoi metaboliti N-dealchilati. È stato dimostrato che l’atrazina N-dealchilazione è diminuita in presenza di un inibitore del citocromo P450. Inoltre, la degradazione dell’erbicida è stata sostenuta dal micelio. Pertanto, il coinvolgimento del citocromo P450 nella degradazione dell’atrazina è stato assunto. Questi dati sono in linea con lo studio precedentemente pubblicato sulla degradazione dell’atrazina da parte di Pleurotus pulmonarius, che ha coinvolto enzimi quali lipossigenasi, perossidasi e citocromo P-450. Mn2+, che attiva questi enzimi, ha stimolato la trasformazione dell’atrazina in metaboliti N-dealchilati e propilidrossilati, mentre gli antiossidanti e gli inibitori della lipossigenasi e della perossidasi (acido nordiidroguaiaretico) e del citocromo P-450 (piperonil butossido) ne hanno soppresso la degradazione.

Per analizzare i dati presentati nella tabella 2, il tasso di scomparsa dell’erbicida è stato calcolato come il rapporto tra la scomparsa (%) e la durata della degradazione (giorni), seguito da un calcolo del valore medio per ogni erbicida (Fig. 1). Prendendo in considerazione l’effetto delle condizioni di coltivazione sulla degradazione degli erbicidi da parte dei funghi, solo i dati sulle condizioni stazionarie su mezzi liquidi sono stati trattati in questo modo.

I risultati ottenuti corrispondono bene allo studio, dove è stato stabilito che la presenza di gruppi alchilici è necessaria per la degradazione degli erbicidi s-triazinici da parte di P. chrysosporium tramite mono N-dealchilazione. Inoltre, la capacità dei funghi WRF di degradare le s-triazine sembra migliorare con l’aumento della quantità di gruppi alchilici esattamente ramificati. Tuttavia, studi quantitativi dettagliati sull’attività di degradazione della struttura dovrebbero essere condotti per provare o confutare questa osservazione preliminare. Un’altra importante conclusione è una marcata influenza negativa del cloro nella molecola dell’erbicida sul tasso di degradazione, che può essere vista dal confronto del tasso di degradazione del nitrofene (un atomo di cloro) e del clornitrofene (tre atomi di cloro) e il più alto tasso di degradazione del bentazon, che è l’unico erbicida senza cloro nella gamma presentata (Fig. 1). Pertanto, i dati presentati in Fig. 1 dimostrano chiaramente la necessità di ulteriori studi QSAR. Insieme alla conoscenza delle principali vie enzimatiche di degradazione degli erbicidi, quest’ultima migliorerà significativamente la valutazione preliminare della capacità di degradazione della WRF in relazione all’erbicida di struttura nota.

I dati contraddittori sulla partecipazione degli enzimi ligninolitici nella degradazione e trasformazione degli erbicidi non hanno permesso di stabilire il loro ruolo preciso in questi processi. Abbiamo riassunto i dati sull’efficienza dei singoli enzimi ligninolitici, le loro miscele e gli enzimi – sistemi redox-mediatore nella degradazione degli erbicidi nella tabella 3. Come si può vedere, nessuna degradazione di diketonitrile, diuron, atrazina, cloronitrofene, nitrofene, glifosato è stato osservato per MnP e LiP estratti grezzi ed enzimi purificati da P. chrysosporium, Trametes versicolor, e Coriolus versicolor anche in presenza di redox-mediatori. Tuttavia, MnP da P. chrysosporium ha degradato Irgarol 1081 fino al 37% dopo 24 ore e LiP da P. chrysosporium ha degradato bentazon fino al 100% dopo 4 ore. Inoltre, bentazon è stato efficacemente trasformato da laccasi con catecolo, laccasi, e MnP estratti grezzi con redox-mediatore ABTS, MnP ricombinante. Analisi dei dati riassunti nella tabella 3 trarre la conclusione che MnP, laccasi, e laccasi – sistemi redox-mediatore sono gli strumenti più efficienti per la degradazione di una vasta gamma di erbicidi – diketonitrile, glifosato, Pesticida Mix 34, cloroxuron, atrazina, e dymron , tuttavia, con poche eccezioni, vale a dire, choronitrofen e nitrofen . Va sottolineato che l’efficienza dei sistemi laccasi – redox-mediatore verso diversi erbicidi dipende fortemente dal redox-mediatore utilizzato, che a sua volta dipende dai meccanismi di ossidazione dei mediatori da parte dell’enzima e dalla reattività degli intermedi dei mediatori.

In the study of atrazine degradation with purified laccase from Coriolopsis fulvocinerea, non è stata osservata alcuna degradazione dell’erbicida (Koroleva & Gorbatova, dati non pubblicati). Lo screening dei mediatori redox (siringaldezina, PF6, , HBT) ha rivelato che solo HBT ha causato la diminuzione della concentrazione di atrazina nel sistema laccasi-atrazina-redox-mediatore. Uno studio più dettagliato dei componenti del sistema modello “atrazina/laccasi/HBT” ha mostrato che l’HBT stesso ha reagito con l’atrazina e altri derivati dell’atrazina contenenti cloro direttamente, senza il coinvolgimento della laccasi, e non ha interagito con i derivati idrossi dell’atrazina. È noto che HBT in soluzione acquosa può passare in forma ionica. Pertanto, è stato suggerito che si possono formare due prodotti, entrambi composti da HBT e atrazina, con la formazione di legami (-N-O-C-) in posizione (2) dell’atrazina. L’aggiunta di laccasi a una soluzione di HBT/Atr ha portato alla formazione di diversi prodotti, uno dei quali ha un tempo di ritenzione corrispondente a quello del composto HBT-Atr. Nelle reazioni enzimatiche, si sono formati altri due prodotti con tempi di ritenzione di 15,3 min e 19,4 min, che sono stati identificati come deetilatrazina (DEA) e il composto formato dall’interazione di DEA e HBT. Quindi, l’aggiunta dell’enzima ha portato alla formazione di nuovi prodotti diversi da quelli formati nella reazione di HBT con l’atrazina. Il sistema modello “atrazina/laccasi/HBT” è stato studiato a diversi rapporti molari di atrazina/mediatore (da 9:1 a 1:9) e a due diverse concentrazioni di enzima (0,02 μm e 1,0 μm). La più profonda conversione di atrazina – fino al 70% in 10 giorni – è stata osservata con un rapporto HBT/Atr di 9/1 e una concentrazione di enzima di 0,02 μm. La risonanza magnetica nucleare protonica (1H-NMR) e l’HPLC-MS/MS hanno permesso di confermare l’identificazione del prodotto nei sistemi modello “Atr/HBT” e “Atr/HBT/laccasi”: la formazione di Atr-HBT nel sistema “Atr/HBT”, e DEA e DEA-HBT nel sistema “Atr/HBT/laccasi”. L’Atr-HBT esisteva in due forme: protonato (M.W. 315 g/mol) e diprotonato (M.W. 316 g/mol). Nella reazione “Atr/HBT/laccasi” si forma la DEA, così come le forme protonate (M.W. 287 g/mol) e diprotonate (M.W. 288 g/mol) del prodotto DEA-HBT. Sulla base dei dati ottenuti per le cinque strutture stabilite dei prodotti, abbiamo proposto lo schema di ossidazione dell’atrazina da parte del sistema “laccasi/HBT” (Fig. 2), che include fasi nonenzimatiche ed enzimatiche (Fig. 3).

Durante lo stadio nonenzimatico, si forma un prodotto composto da atrazina e HBT. Poiché i substrati e i prodotti nel sistema “Atr/HBT” sono in equilibrio, l’aggiunta di laccasi alla reazione causa l’ossidazione di HBT e la formazione del radicale HBT. Il radicale HBT reagisce con il composto Atr-HBT e innesca la dissociazione dei legami (-NH-CH-), con conseguente formazione di DEA-HBT e alcol etilico. A sua volta, DEA-HBT si decompone per formare due prodotti: DEA e HBT. La capacità di HBT di formare forme tautomeriche e di reagire direttamente con l’atrazina ha suggerito che HBT si degradasse nella miscela di reazione. Tuttavia, secondo lo schema proposto, durante l’idrolisi di DEA-HBT, si sono formati DEA e HBT. Questo potrebbe essere uno dei motivi dell’efficacia dell’HBT come mediatore redox nel sistema laccasi – mediatore redox.

L’alto potenziale delle WRF e dei loro enzimi ligninolitici nella trasformazione degli erbicidi è ben documentato. Tuttavia, i meccanismi di degradazione e i percorsi di degradazione per molti erbicidi non sono ancora esplorati. Sono necessari ulteriori studi per chiarire il meccanismo di degradazione degli erbicidi da parte delle WRF e degli enzimi ligninolitici e per identificare i metaboliti formati.