Gli effetti misurati di Wnt3a sulla proliferazione delle cellule HEK293T dipendono dal test applicato
Abstract
La via di segnalazione Wnt è stata associata a molti processi cellulari essenziali. Questo studio mira ad esaminare gli effetti della segnalazione Wnt sulla proliferazione delle cellule HEK293T coltivate. Le cellule sono state incubate con Wnt3a, e l’attivazione della via Wnt è stata seguita dall’analisi del livello della proteina β-catenina e dei livelli di espressione dei geni target MYC e CCND1. Il livello della proteina β-catenina è aumentato fino a quattro volte. Mentre i livelli di mRNA di c-Myc e di ciclina D1 sono aumentati leggermente, i livelli di proteina sono aumentati fino a un fattore di 1,5. Notevolmente, i test MTT e BrdU hanno mostrato risultati diversi nel misurare il tasso di proliferazione delle cellule HEK293T stimolate da Wnt3a. Nei saggi BrdU si è potuto rilevare un aumento del tasso di proliferazione, che era correlato alla concentrazione di Wnt3a applicata. Al contrario, questa correlazione non ha potuto essere mostrata nei test MTT. I risultati MTT, che si basano sull’attività mitocondriale, sono stati confermati dall’analisi del complesso succinato deidrogenasi tramite immunofluorescenza e dal western blotting. Nel complesso, il nostro studio dimostra che Wnt3a attiva la proliferazione delle cellule HEK293. Questi effetti possono essere rilevati misurando la sintesi del DNA piuttosto che misurando i cambiamenti dell’attività mitocondriale.
1. Introduzione
La via di segnalazione Wnt è nota per svolgere un ruolo chiave nella regolazione della differenziazione cellulare, proliferazione, sopravvivenza e apoptosi. Le proteine Wnt sono una famiglia altamente conservata di glicoproteine lipidiche secrete e modificate ricche di cisteina che attivano cascate di segnalazione all’interno della cellula legandosi a un membro della famiglia Frizzled (Fz) di recettori accoppiati a proteine G sulla matrice extracellulare. Ci sono 19 membri di Wnts vertebrati, che possono essere raggruppati in due classi principali in base alla loro capacità di stabilizzare la β-catenina citosolica: percorso canonico e non canonico. Lavori recenti hanno anche dimostrato che alcuni ligandi Wnt, come Wnt5a, sono in grado di attivare più di una via di segnalazione Wnt, quindi la classificazione strettamente binaria sta diventando sempre più obsoleta. Il malfunzionamento della via di segnalazione Wnt è legato a diverse malattie come l’osteoporosi, il morbo di Crohn, il morbo di Alzheimer, la schizofrenia e soprattutto il cancro.
Il ligando Wnt3a appartiene alla segnalazione Wnt β-catenina dipendente (canonica), che si lega ai recettori transmembrana frizzled. In seguito, il complesso recettoriale LRP5 (low-density lipoprotein receptor-related protein 5) o LRP6 attiva le proteine disordinate citoplasmatiche, che innescano l’inibizione della glicogeno sintasi chinasi 3β (GSK-3β). La protooncoproteina β-catenina si accumula nel citoplasma come conseguenza del disassemblaggio del complesso di distruzione formato da adenomatosi poliposi coli (APC), AXIN e GSK-3β. Così, la β-catenina può essere traslocata nel nucleo dove attiva la trascrizione di geni bersaglio mediata dal fattore di trascrizione specifico delle cellule T (TCF)/fattore di potenziamento linfoide (LEF). Questi geni sono responsabili della regolazione di processi fisiologici essenziali nello sviluppo embrionale e adulto come la proliferazione cellulare, la differenziazione, la morfogenesi e l’adesione cellulare.
Con l’indicazione della proliferazione, c’è una complessa interazione tra la segnalazione canonica Wnt e il ciclo cellulare. La via di segnalazione Wnt/β-catenina è significativa nello stimolare la progressione della fase G1 inibendo GSK-3β, che regola gli effettori del ciclo cellulare e i regolatori della crescita.
Un gene bersaglio diretto della via di segnalazione Wnt/β-catenina è il protooncogene MYC, che è stato identificato come un bersaglio Wnt nelle cellule del cancro del colon. Il regolatore di trascrizione c-Myc controlla molte funzioni cellulari, in particolare la regolazione della progressione del ciclo cellulare. Il gene codificante della ciclina D1 CCND1 è anche un gene bersaglio della via Wnt/β-catenina, che è stato descritto nelle cellule del cancro del colon. La ciclina D1 come attivatore della chinasi dipendente dalla ciclina (cdk) 4 o cdk 6 guida la transizione di fase G1/S.
Ci sono diversi modi per misurare la proliferazione cellulare indotta da Wnt3a. Un metodo non radioattivo è un test immunologico basato sull’incorporazione di 5-bromo-2′-deossiuridina (BrdU) nel DNA per determinare la sintesi del DNA, che si correla alla transizione di fase S e quindi alla proliferazione cellulare. Un altro metodo utilizza la misurazione dell’attività mitocondriale delle cellule vitali. Nel saggio MTT un prodotto formazan blu insolubile è prodotto dalle deidrogenasi mitocondriali per riduzione di MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio bromuro).
In questo studio abbiamo studiato la proliferazione delle cellule HEK293T sotto l’influenza dei ligandi Wnt3a usando il MTT e il saggio BrdU. Inoltre confrontiamo i risultati di questi saggi con l’attività mitocondriale delle cellule trattate con Wnt3a, misurata dall’immunocolorazione della proteina SDHA (succinato deidrogenasi complesso subunità A).
2. Materiali e metodi
2.1. Cellule e coltura cellulare
Le cellule di rene embrionale umano, HEK293T, sono state coltivate in mezzo Dulbecco modificato di Eagle (DMEM) integrato con 10% di siero fetale bovino (PAN Biotech, Aidenbach, Germania), 1% di aminoacidi non essenziali e 1% di penicillina/streptomicina (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) a 37°C in 5% di CO2.
2.2. Saggi di proliferazione
I saggi MTT e BrdU sono stati eseguiti su piastre da 96 pozzetti. Diecimila cellule sono state seminate per pozzetto e le cellule sono state stimolate con dosi crescenti di Wnt3a (R&D Systems, Minneapolis, USA), cioè 0, 10, 50, 100, 150 e 200 ng/mL, per 24, 48 e 72 ore. MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) è stato sciolto in PBS a 5 mg/mL e 20 μL di soluzione MTT sono stati aggiunti ad ogni pozzetto seguiti da un’incubazione di tre ore a 37°C in 5% CO2. Il mezzo con MTT è stato poi sfogliato e sono stati aggiunti 200 μL di DMSO. Per sciogliere i cristalli, le cellule sono state agitate per 15 minuti a temperatura ambiente. Le piastre sono state lette con un lettore ELISA (Tecan Group Ltd., Männedorf, Svizzera) a 590 nm. Per il dosaggio di BrdU è stato utilizzato un kit commerciale “Cell Proliferation ELISA BrdU colorimetric” (Roche, Mannheim, Germania) secondo le istruzioni del produttore. Dopo l’aggiunta della soluzione di etichettatura BrdU le cellule sono state incubate per tre ore a 37°C in 5% CO2. Dopo il lavaggio finale sono stati aggiunti alle cellule 100 μL/pozzetto di soluzione di substrato e la reazione è stata fermata dopo 15 minuti di incubazione a temperatura ambiente utilizzando acido solforico. Le piastre sono state lette immediatamente da un lettore ELISA a 450 nm. Tutti i saggi sono stati fatti in triplicato. Per la calibrazione le cellule sono state seminate in numeri diversi (da 0,1 × 104 a 3 × 104).
2.3. Immunocitochimica e microscopia a fluorescenza
Le cellule HEK293T sono state seminate in piastre da 24 pozzetti e trattate con 0-200 ng/mL Wnt3a ad una confluenza del 30% e fissate in formaldeide al 4% dopo 24, 48 e 72 ore. È stato aggiunto l’anticorpo SDHA (Abcam, Cambridge, UK) ad una diluizione di 1 : 200 e le cellule sono state incubate per un’ora. I nuclei delle cellule sono stati controcolorati con DAPI per 5 minuti. Le cellule sono state analizzate tramite microscopia a fluorescenza (Observer. Z1 di Zeiss, Jena, Germania) e il software di accompagnamento AxioVision 4.7.
2.4. Elettroforesi su gel delle proteine e Western Blot
Utilizzando il Bradford-Assay sono state determinate le concentrazioni di proteine nei lisati di cellule intere. Quantità uguali di proteine sono state caricate su gel di SDS-poliacrilamide (NuPAGE, 4-12%, Life Technologies, Carlsbad, USA). I gel sono stati eseguiti a 150 V per 1 ora e trasferiti su membrane di nitrocellulosa tramite il sistema iBlot (Life Technologies). Le membrane sono state analizzate usando anticorpi primari contro SDHA, β-catenina, c-Myc, ciclina D1, e β-actina (Cell Signaling, Cambridge, UK), diluiti 1 : 1000 in TBS-Tween con 3% di latte, seguiti da incubazione con un appropriato anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (diluizione 1 : 2000). Le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando la rilevazione ECL. Isolamento dell’RNA e RT-PCR
L’RNA totale è stato isolato usando NucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel, Düren, Germania) e 1 μg di RNA è stato invertito con Verso cDNA-Kit (Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germania) in un volume di 40 μL. Le sequenze dei primer (MWG, Monaco, Germania) utilizzati per la PCR semiquantitativa con trascrittasi inversa sono per GAPDH 5′-catggtgctgagatttgccaac-3′ (avanti) e 5′-tcaaccttgaccttcatcac-3′ (indietro), per MYC 5′-ccgagcaaggacgcgactctc-3′ (avanti) e 5′-gcctttcagagaagcgggtcct-3′ (indietro), e per CCND1 5′-gcctgaacctgaggagcccca-3′ (avanti) e 5′-gtcacacttgatcactgg-3′ (indietro). L’amplificazione PCR è stata eseguita utilizzando My Taq Red Mix (Bioline, Luckenwalde, Germania) secondo il protocollo del produttore. La reazione è stata eseguita con denaturazione preliminare per 2 minuti a 94°C, seguita da 30 cicli di denaturazione a 94°C per 1 minuto, annealing a 55°C (CCND1), 57°C (GAPDH), o 60°C (MYC) per 30 secondi, ed estensione a 72°C per 1 minuto. La fase finale di estensione è durata 10 minuti a 72°C. I prodotti di PCR sono stati analizzati mediante elettroforesi su un gel di agarosio all’1,5%.
2.6. Analisi dei dati
Il software Microsoft Excel è stato utilizzato per la gestione dei dati, compreso il calcolo delle deviazioni standard. I western blot e i gel di agarosio sono stati scansionati con il sistema di documentazione su gel Quantum ST4 (Vilber Lourmat, Eberhardzell, Germania). Le bande sono state quantificate utilizzando il software ImageJ (Wayne Rasband, NIH, Bethesda, USA).
3. Risultati
3.1. Effetti di Wnt3a sull’induzione di β-Catenina e dei tipici geni bersaglio di Wnt
Per dimostrare l’attivazione della via Wnt, abbiamo rilevato la quantità di concentrazione della proteina β-catenina nelle cellule HEK293T dopo il trattamento con Wnt3a (Figura 1). Dopo 24 ore di trattamento, la concentrazione della proteina β-catenina è aumentata con concentrazioni crescenti di Wnt3a. La più alta concentrazione di proteina β-catenina è stata identificata a 24 ore con una concentrazione di 200 ng/mL di Wnt3a. Qui la quantificazione ha mostrato un aumento di quattro volte rispetto al controllo. Ai punti di tempo 48 e 72 ore dopo il trattamento, l’effetto dell’induzione della β-catenina non è più chiaramente riconoscibile. Inoltre abbiamo analizzato la regolazione dei geni bersaglio Wnt CCND1 e MYC dopo il trattamento con Wnt3a sia tramite RT-PCR semiquantitativa che tramite western blot (Figure 2 e 3). Un livello basale di c-Myc e ciclina D1 è stato rilevato nelle cellule non trattate. I risultati della RT-PCR hanno mostrato cambiamenti marginali nella quantità di MYC cDNA e un’induzione di CCND1 dopo 24 e 48 ore con 10 ng/mL Wnt3a, così come dopo 72 ore con una concentrazione di 100-200 ng/mL Wnt3a. Un livello proteico leggermente aumentato di c-Myc è stato osservato con una concentrazione di 50 ng/mL dopo 24 ore. La quantificazione western blot della ciclina D1 ha mostrato un aumento di un fattore 1,5 con una concentrazione di Wnt3a da 50 a 200 ng/mL dopo 24 ore. Il livello proteico di c-Myc è salito allo stesso modo con la concentrazione di 50 ng/mL di Wnt3a dopo 24 ore.
3.2. Saggi di proliferazione cellulare
Per studiare gli effetti delle proteine Wnt sulla crescita cellulare, le cellule HEK293T sono state coltivate in piastre da 96 pozzetti per 24 ore prima di essere trattate con concentrazioni di proteine Wnt3a di 0, 10, 50, 100, 150, o 200 ng/mL, rispettivamente. Dopo 24, 48 e 72 ore di incubazione, sono stati eseguiti i test MTT e BrdU. I saggi BrdU mostrano una chiara tendenza; con concentrazioni crescenti di Wnt3a la lettura associata è aumentata (Figura 4(a)), in cui Wnt3a indica il più alto tasso di crescita dopo 48 ore e una concentrazione di 200 ng/mL.
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In contrasto con i saggi BrdU, i saggi MTT non hanno mostrato una correlazione tra le concentrazioni di Wnt e il numero di cellule. I numeri delle cellule sono rimasti tutti più o meno gli stessi o sono diminuiti rispetto ai loro relativi controlli (vedi Figura 4(b)).
3.3. Attività mitocondriale
Per comprovare ulteriormente il ruolo di Wnt3a in relazione all’attività mitocondriale nelle cellule HEK293T, le quantità di proteina SDHA sono state determinate tramite western blot e analisi immunocitochimica. La succinato deidrogenasi (SDH) con la sua subunità SDHA è un componente chiave del ciclo dell’acido citrico, che è coinvolto nel complesso II della catena mitocondriale di trasporto degli elettroni ed è responsabile del trasferimento di elettroni dal succinato all’ubichinone. Le cellule sono state trattate allo stesso modo per gli esperimenti di analisi della proliferazione e incubate con l’anticorpo SDHA come descritto sopra. I risultati (Figura 5) hanno mostrato un segnale di fluorescenza crescente e anche un segnale più intenso al western blot rispetto al controllo dopo 24 ore di trattamento con Wnt3a. Dopo 48 ore il livello proteico registrato dalla microscopia ad immunofluorescenza o dall’analisi western blot non ha mostrato alcun cambiamento significativo. Dopo 72 ore di trattamento con Wnt3a è stato osservato anche un segnale decrescente in entrambi gli esperimenti. Il segnale più alto è stato misurato dopo 24 ore con 50 ng/mL Wnt3a.
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4. Discussione
Le proteine Wnt sono coinvolte in varie funzioni cellulari tra cui la regolazione dell’espressione genica per il ciclo cellulare e la proliferazione. Wnt3a è noto come promotore della proliferazione e della migrazione delle cellule epiteliali del cristallino umano, anche per la proliferazione dei fibroblasti o come regolatore della proliferazione delle cellule pancreatiche NIT-1 beta. MYC e CCND1 sono geni bersaglio della via di segnalazione Wnt nelle cellule di mammifero. Per esempio, Yoon et al. hanno esposto che la segnalazione Wnt attiva la biogenesi mitocondriale eseguendo uno schermo RNAi su larga scala; hanno identificato i geni che influenzano la funzione mitocondriale, tra gli altri MYC .
In questo lavoro abbiamo determinato gli effetti di Wnt3a sulla proliferazione delle cellule HEK293T. Per questo abbiamo applicato due saggi principali, che sono ampiamente utilizzati per l’analisi dei tassi di proliferazione delle cellule in coltura, vale a dire, il saggio MTT e il saggio BrdU. Così facendo, gli effetti specifici dei ligandi Wnt sulla sintesi del DNA e sull’attività mitocondriale sono stati rilevati e confrontati direttamente.
Per stabilire il nostro sistema e provare l’effetto di Wnt3a sul percorso Wnt nelle cellule HEK293T abbiamo dimostrato l’induzione di β-catenina dopo 24 ore di trattamento con Wnt3a e abbiamo analizzato i livelli di espressione di MYC e CCND1. Anche il livello di entrambi i geni target è aumentato dopo 24 ore di esposizione a Wnt3a. C-Myc ha un ruolo chiave nella progressione della fase G1; upregola la ciclina D1 e reprime p21 e p27 . La ciclina D1 a sua volta promuove la fosforilazione e l’inibizione del complesso retinoblastoma (Rb), che a sua volta upregola il livello della ciclina E. L’arricchimento della ciclina E porta alla transizione del checkpoint della fase G1/S.
Durante la fase G1 i mitocondri devono fornire un’elevata quantità di energia. Questa fase ossidativa è seguita da un periodo riduttivo durante la fase S-/G2-/M del ciclo cellulare, in cui avviene la replicazione del DNA e la proliferazione dei mitocondri.
I tassi di proliferazione di HEK293T trattati con Wnt3a erano diversi, quando misurati dai due saggi utilizzati in questo studio. Spieghiamo la differenza con i meccanismi di rilevamento dissimili di questi metodi. Il saggio MTT misura l’attività dei mitocondri; d’altra parte il saggio BrdU rileva la quantità relativa di DNA appena sintetizzato. Wagner et al. fanno riferimento ad una relazione altamente significativa tra BrdU e MTT nei loro risultati con la proliferazione dei linfociti canini, anche se il test BrdU si è dimostrato più sensibile del test MTT. L’effetto apparentemente negativo di Wnt3a sul numero di cellule potrebbe essere spiegato da un calo dell’attività mitocondriale. Il test BrdU, tuttavia, ha mostrato un effetto di promozione della sintesi del DNA in queste cellule. Gli esperimenti di attività mitocondriale hanno mostrato che solo dopo 24 ore di trattamento con Wnt3a il livello di SDHA era aumentato. L’attivazione con Wnt3a ricombinante non ha probabilmente alcun effetto sull’attività mitocondriale dopo 48 ore o più tardi. Secondo questo effetto limitato nel tempo è il segnale decrescente durante il test MTT dopo 48 e 72 ore. Questo è anche confermato dall’accumulo decrescente di β-catenina da parte di Wnt3a dopo 24 ore. Altre pubblicazioni sostengono questa ipotesi che le cellule trattate con Wnt3a indicano un aumento del livello di β-catenina solo durante un periodo di 24 ore. Spieghiamo i nostri risultati, che sono contrari all’effetto proliferante pubblicato di Wnt3a, con il fatto che la maggior parte degli studi ha utilizzato cellule sovraespresse Wnt3a, terreno condizionato da Wnt3a, o cellule private del siero con proteina Wnt ricombinante per l’attivazione della via di segnalazione Wnt/β-actina.
In conclusione, i risultati di BrdU e del test MTT sono difficilmente comparabili quando si misurano gli effetti di Wnt3a sul tasso di proliferazione delle cellule HEK293T. Le differenze possono essere spiegate dai loro diversi punti di applicazione, cioè l’attività mitocondriale e la sintesi del DNA. Per dare una prova definitiva sul tasso di proliferazione cellulare, l’interpretazione dei risultati di un singolo metodo potrebbe essere fuorviante. Per la valutazione della proliferazione cellulare, il conteggio diretto delle cellule con metodi ottici rispecchierebbe meglio la situazione reale. Sarebbe interessante confrontare i risultati corrispondenti con i risultati dei test biochimici come BrdU e MTT.
Conflitto di interessi
Gli autori dichiarano che non c’è nessun conflitto di interessi riguardo alla pubblicazione di questo articolo.
Riconoscimento
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal Ministero federale dell’istruzione e della ricerca (BMBF).