Articles

Genome-wide analisi rivelano il percorso IRE1a-XBP1 promuove la differenziazione delle cellule T helper risolvendo lo stress secretorio e accelerando la proliferazione

Marzo 14, 2021 by admin

In questo studio, per capire il ruolo del percorso IRE1a-XBP1, la nostra strategia di base è stata quella di utilizzare un modello in vitro differenziamento Th2 (Fig. 1b). Le cellule T helper naïve sono state attivate dall’attivazione TCR in piastre rivestite di anti-CD3e/CD28 in condizioni di differenziazione Th2 per 72 h, riposate per 42 h, e ristimolate dall’attivazione TCR usando piastre rivestite di anti-CD3e/CD28. Per perturbare il percorso IRE1a-XBP1, abbiamo usato un farmaco ben noto 4μ8c che blocca specificamente il percorso inibendo l’attività dell’endonucleasi IRE1a. Il farmaco è stato aggiunto ai mezzi di coltura alla concentrazione di 15-μM all’inizio della cultura e durante il passaggio dalla piastra di attivazione alla piastra di riposo. La scelta della concentrazione del farmaco è stata determinata dalla sua più alta efficienza di inibizione di IRE1a con la più bassa tossicità cellulare (file aggiuntivo 1: Figura S1). Abbiamo confrontato i trascrittomi dei linfociti Th2 naïve e ristimolati (trattati con il farmaco e non trattati) mediante sequenziamento dell’RNA, abbiamo identificato i siti di legame del fattore di trascrizione XBP1 nei Th2 riattivati mediante ChIPmentation (ChIP-sequencing) e abbiamo integrato i dati a livello di genoma per prevedere i bersagli diretti e il loro ruolo regolatore.

Le cellule T helper accendono il percorso IRE1a-XBP1 durante l’attivazione in vitro

Le cellule T helper attivate e differenziate secernono una grande quantità di citochine. Pertanto, un macchinario secretorio ben sviluppato è un prerequisito per le cellule per adattarsi a questo stress secretorio. Per prevedere il coinvolgimento della via ER-stress/UPR durante l’attivazione delle cellule T helper, abbiamo confrontato il trascrittoma delle cellule Th2 naïve e differenziate (Th2 ristimolate). I geni differenzialmente espressi ottenuti da questo confronto sono stati integrati nel percorso KEGG “Protein Processing in the Endoplasmic Reticulum” per visualizzare i componenti che sono up- o downregolati. L’analisi mostra che quando le cellule T helper naïve sono attivate e differenziate in cellule Th2, esse upregolano l’espressione dei geni coinvolti nella via dello stress ER (Additional file 1: Figura S2). Diversi fattori che sono stati precedentemente caratterizzati come controllori del ripiegamento e della secrezione delle proteine, tra cui XBP1 stesso, sono upregolati durante il differenziamento delle cellule T helper.

Per convalidare questa previsione, e indagare specificamente il coinvolgimento della via IRE1a-XBP1, abbiamo misurato l’espressione di IRE1a mRNA e proteina nei linfociti Th2 differenziati e riattivati in vitro (Fig. 1b). Le cellule sono state analizzate tramite qPCR e Western blot per confrontare l’mRNA e la proteina rispettivamente. Abbiamo trovato che sia l’mRNA che il livello della proteina sono stati aumentati nelle cellule T helper attivate (Fig. 1c, pannello sinistro e centrale). È noto che la fosforilazione di IRE1a denota il suo stato funzionale. Abbiamo osservato che la proteina è fosforilata nei linfociti Th2 attivati (Fig. 1c, pannello destro). Questo aumento della fosfo-IRE1a può essere spiegato dall’aumento della sintesi della proteina, anche se non possiamo escludere la possibilità di un aumento dell’attività chinasica e dell’autofosforilazione. L’analisi densitometrica della banda Western blot suggerisce che entrambi i meccanismi, upregulation della sintesi proteica e aumento della fosforilazione, sono coinvolti. L’upregolazione della proteina è aumentata di tre volte, ma la fosfo-proteina è aumentata di 4,5 volte (Fig. 1c).

IRE1a attivata giunge all’mRNA non giuntato XBP1 (XBP1u) e produce una isoforma di mRNA giuntata XBP1 (XBP1s). Abbiamo osservato aumenti nella forma spliced di XBP1 (XBP1s), sia a livello di mRNA che di proteine, su attivazione delle cellule T helper (Fig. 1d, e). La tunicamicina è stata usata come controllo positivo. Si tratta di un farmaco che inibisce la glicosilazione N-linked e quindi provoca l’accumulo di proteine unfolded (cioè, lo stress del reticolo endoplasmatico (ER)), e aumenta XBP1s aumentando l’attività IRE1a. L’inibizione specifica dell’attività dell’endonucleasi IRE1a trattando le cellule con 4μ8c ha abolito sia l’mRNA che le isoforme della proteina XBP1s, confermando che la formazione della forma spliced dipende dall’attività di IRE1a (Fig. 1d, e).

Questi risultati confermano che il percorso IRE1a-XBP1 è conservato nei linfociti Th2 e regolato durante l’attivazione delle cellule T helper in vitro. Successivamente, abbiamo deciso di indagare se questo vale anche in vivo.

In vivo le cellule T helper attivate upregolano il percorso IRE1a-XBP1

Per verificare se il percorso IRE1a-XBP1 è operativo nelle cellule T CD4+ in vivo, abbiamo infettato i topi C57BL/6 con il parassita elmintico Nippostrongylus brasiliensis, un modello ben noto di risposte immunitarie Th2-driven. Dopo 7 giorni post-infezione, abbiamo analizzato l’espressione della proteina XBP1s nelle cellule T helper mediante citometria a flusso. Abbiamo trovato le cellule T helper da topi infettati dal verme esprimono significativamente più XBP1s rispetto ai topi di controllo non infettati, suggerendo una upregolazione del percorso (Fig. 2).

Questi risultati confermano che il percorso è attivo in vivo. Pertanto, abbiamo deciso di analizzare il percorso utilizzando approcci a livello di genoma nei linfociti Th2.

L’analisi trascrittomica a livello di genoma dell’espressione genica differenziale rivela i geni regolati da IRE1a-XBP1

Per catturare un ruolo globale di regolazione genica del percorso IRE1a-XBP1, abbiamo confrontato cellule Th2 attivate in vitro con cellule con attività endonucleasica IRE1a inibita aggiungendo 4μ8c nei media di cultura cellulare. Abbiamo poi confrontato i trascrittomi dei linfociti Th2 attivati con o senza inibizione del percorso IRE1a-XBP1. I trascrittomi delle cellule Th2 trattate con 4μ8c e non trattate sono stati ottenuti dal sequenziamento dell’mRNA (RNA-seq). Controllo di qualità dei dati di sequenziamento RNA è mostrato nel file aggiuntivo 1: Figura S3. Confrontando i trascrittomi dei linfociti Th2 naïve e attivati, abbiamo trovato che 10995 geni sono stati regolati in modo diverso su attivazione Th2. L’inibizione del percorso IRE1a-XBP1 dal trattamento 4μ8c ha portato all’espressione differenziale di 3144 geni rispetto al controllo Th2 non trattato (Fig. 3a, Additional file 1: Figura S3 pannello destro). Duemilaseicento settanta di questi geni sono stati coinvolti nella differenziazione Th2 (Fig. 3a). Clustering gerarchico dei geni rivela i gruppi di geni up- e downregulated su 4μ8c trattamento (Additional file 1: Figura S3, destra). L’esame dettagliato di questi geni ha rivelato che molti sono associati con la risposta della proteina spiegata e lo stress ER, indicando un impatto importante del percorso IRE1a-XBP1 (Fig. 3b) su questi processi biologici. L’elenco completo dei geni differenzialmente espressi può essere trovato nel file aggiuntivo 2: Tabella S1. L’analisi Gene Ontology (GO) di questi geni differenzialmente espressi dopo il trattamento con 4μ8c alle cellule Th2 (cioè i geni regolati dal percorso IRE1a-XBP1) ha mostrato che essi sono arricchiti nei seguenti processi biologici: “Risposta allo stress ER” (GO:0006950), “Regolazione della trasduzione del segnale” (GO:0009966), “Produzione di citochine” (GO:0001816), “proliferazione cellulare” (GO:0008283), “ciclo cellulare” (GO:0007049), e risposta immunitaria (GO:0006955) (Fig. 3c). Questi cambiamenti nei modelli di espressione genica dopo l’inibizione di IRE1a suggeriscono un ampio coinvolgimento del fattore di trascrizione XBP1 nell’attivazione e proliferazione di Th2, così come la differenziazione. Pertanto, abbiamo cercato di trovare i modelli di occupazione della cromatina a livello genomico del fattore di trascrizione XBP1.

XBP1 ChIPmentation rivela XBP1 geni bersaglio diretto in cellule Th2

Per identificare il genoma-l’occupazione della cromatina XBP1, abbiamo eseguito la ChIPmentation, un metodo recentemente sviluppato che ha dimostrato di essere più veloce, più sensibile e robusto dei tradizionali approcci ChIP-seq, utilizzando un anticorpo ChIP-grade contro XBP1. Per la ChIP di XBP1 sono state utilizzate cellule Th2 differenziate e riattivate in vitro. Sono state eseguite due repliche biologiche indipendenti. Abbiamo ottenuto 19,3 milioni e 22,4 milioni di letture pair-end per ogni replica rispettivamente. Utilizzando MACS2 con un valore q inferiore a 0,01 e un arricchimento di fold superiore a 5, abbiamo identificato 9031 e 7662 picchi, rispettivamente, nei due replicati. L’analisi di sovrapposizione utilizzando bedtools ha suggerito che 5892 picchi erano presenti in entrambi i replicati. Pertanto, ci siamo concentrati solo su questi picchi 5892 per l’analisi a valle.

Come previsto, i picchi di legame sono stati identificati intorno alle regioni promotori in noti geni bersaglio XBP1, come Hspa5 che codifica ER-chaperone proteina BiP noto anche come Grp78; un evento di legame è stato osservato anche intorno al promotore di XBP1 stesso (Fig. 4a), indicando potenziale auto-regolazione di XBP1. Per scoprire le caratteristiche genomiche associate ai siti di legame di XBP1, abbiamo confrontato la sua posizione di picco con i geni RefSeq usando HOMER . La maggior parte dei picchi di legame XBP1 erano situati all’interno del promotore (definito come 1000 bp a monte e 500 bp a valle rispetto ai siti di inizio trascrizione annotati) (36%) e regioni introniche (35%), e distale evento vincolante intergenica (25%) sono stati osservati anche frequentemente (Fig. 4b). La distribuzione genomica dei picchi di XBP1 indica che si lega sia ai promotori che ai potenziali enhancer.

Per caratterizzare ulteriormente il regoloma di XBP1, abbiamo eseguito la scoperta di motivi de novo utilizzando HOMER per identificare i motivi del DNA arricchiti all’interno delle regioni di legame di XBP1. Il motivo principale identificato è la sequenza di consenso GCCACGT, che è quasi identica al motivo di legame XBP1 umano definito nelle linee cellulari del cancro al seno (Fig. 4c). Questo indica le specificità di legame altamente conservate di XBP1 tra l’uomo e il topo e tra i tipi di cellule. Il primo motivo arricchito nei nostri dati del mouse assomiglia anche il motivo XBP1 dal database JASPAR, sostenendo ancora una volta l’alta qualità dei nostri dati ChIPmentation. Il secondo motivo più arricchito è il motivo di legame NF-Y (Additional file 1: Figura S4C). È interessante notare che il motivo NF-Y è stato trovato frequentemente intorno alle regioni promotrici dei geni del ciclo cellulare, in particolare i geni coinvolti nella regolazione del ciclo cellulare G2/M. Sia il motivo XBP1 e il motivo NF-Y co-occorrono intorno a un sottoinsieme di 258 picchi di legame XBP1 (Fig. 4d), indicando una potenziale cooperazione tra XBP1 e NF-Y fattori di trascrizione per regolare un sottoinsieme di geni bersaglio. L’elenco dei geni bersaglio che sono potenzialmente co-regolati da XBP1 e NF-Y viene visualizzato nel file aggiuntivo 3: Tabella S2, e un elenco completo dei bersagli XBP1 è anche fornito nel file aggiuntivo 3: Tabella S2. I primi cinque motivi arricchiti sono visualizzati nel file aggiuntivo 1: Figura S4C. Per indagare le funzioni dei geni XBP1-bound, abbiamo usato GREAT per caratterizzare i picchi di legame XBP1. La maggior parte dei termini GO significativi sono legati al ripiegamento delle proteine e allo stress ER (Fig. 4e), che è coerente con il ruolo biologico noto di XBP1.

Insieme, gli esperimenti di ChIPmentation predicono un ruolo di XBP1 nel migliorare il ripiegamento delle proteine e la secrezione, così come l’attivazione dei linfociti Th2.

Integrazione dei dati trascrittomici e dei dati ChIP-seq per svelare la rete di regolazione genica controllata da XBP1

Per rivelare i geni target diretti regolati da XBP1 e la sua rete di regolazione trascrizionale, abbiamo integrato i dati trascrittomici a livello genomico e i dati di ChIPmentation. Un gene bersaglio diretto è definito dalla sua espressione differenziale sull’inibizione di IRE1a (cioè, il trattamento 4μ8c) e l’occupazione del fattore di trascrizione XBP1 al locus del gene. Abbiamo trovato 1143 geni bersaglio diretto in Th2, di cui 122 bersagli sono stati precedentemente segnalati come bersaglio diretto XBP1 in altri tipi di cellule (cioè, muscolo, β-cellula pancreatica e plasmacellula) (Fig. 5a). In questo contesto, 1021 geni possono essere considerati come Th2-specifici. L’azione di XBP1 sui suoi bersagli diretti non ha una direzione definita, contiene geni up- e downregolati. I primi 38 geni che seguono uno di questi modelli sono mostrati in Fig. 5b, e l’elenco completo può essere trovato nel file aggiuntivo 4: Tabella S3. Il più significativo processo biologico identificato e percorsi sono legati al ripiegamento delle proteine e ER-stress (Additional file 1: Figura S5), che sono coerenti con i suoi ruoli biologici noti, e comprendono anche nuovi bersagli Th2-specifici.

Nonostante la preponderanza del ruolo di XBP1 nel controllo di questo percorso, altri fattori di trascrizione sono anche trovati coinvolti. Per esaminare la cascata normativa che segue la regolazione di XBP1, abbiamo costruito una rete di regolazione trascrizionale estraendo i fattori di trascrizione annotati con picchi di ChIP-seq del promotore o esonico/intronico (Fig. 5c). L’elenco completo dei fattori di trascrizione può essere trovato nel file aggiuntivo 5: Tabella S4. Questa rete è stata ulteriormente completata con l’aggiunta di geni differenzialmente espressi che hanno annotato le interazioni con i fattori di trascrizione bersaglio nel database STRING (file aggiuntivo 6: Tabella S5).

I fattori di trascrizione che sono direttamente regolati da XBP1 possono essere classificati in tre grandi categorie funzionali coinvolti nei seguenti: risoluzione dello stress ER secretorio delle proteine, regolazione del ciclo cellulare e la proliferazione, e il controllo della funzione effettrice delle cellule immunitarie. I fattori di trascrizione coinvolti nello stress ER probabilmente facilitano la secrezione di citochine nel linfocita Th2. Questa previsione si basa sui rapporti precedenti da cellule secretorie come le cellule acinarie pancreatiche e le plasmacellule. Questi fattori di trascrizione, cioè Bhlha15, Atf3, Atf6, Atf6b, Atf4, e Creb3l2, hanno dimostrato di essere coinvolti nell’adattamento allo stress secretorio dell’ER.

Lo scopo della proliferazione cellulare e dei fattori di trascrizione legati al ciclo cellulare potrebbe essere quello di facilitare la rapida espansione controllata delle cellule Th2 attivate. I fattori legati alla risposta immunitaria sono probabilmente coinvolti nella differenziazione Th2 e nella produzione di citochine. Pertanto, abbiamo voluto testare l’effetto della downregulation di XBP1s nella secrezione di citochine, nella proliferazione cellulare e nella produzione di citochine.

La via IRE1a-XBP1 controlla la secrezione di citochine nelle cellule T helper

Il confronto genomico dei geni regolati da XBP1 predice che il fattore è coinvolto nella secrezione di citochine. Per convalidare questa previsione, abbiamo bloccato l’attività dell’endonucleasi IRE1a nelle cellule Th2 e abbiamo analizzato il surnatante della coltura cellulare per quantificare il livello di IL4 tramite ELISA. Abbiamo selezionato IL4 come citochina candidata testabile perché il suo mRNA e la sua proteina sono invariati dalla downregolazione di XBP1 (Additional file 1: Figura S6A pannello sinistro, Fig. 6 pannello sinistro e centrale della riga superiore). Abbiamo trovato che la secrezione di IL4 è significativamente inibita nelle cellule trattate con 4μ8c (Fig. 6, pannello destro della riga superiore). Come previsto, questo risultato supporta il coinvolgimento del percorso IRE1a-XBP1 nel facilitare la secrezione di citochine nelle cellule Th2 come previsto. L’inibizione del percorso durante la fase di ristimolazione non ha alcun effetto inibitorio significativo sulla secrezione di IL4 (Additional file 1: Figura S6B). Questo risultato suggerisce che la XBP1s è richiesta durante la differenziazione Th2, possibilmente per lo sviluppo di un efficiente macchinario secretorio.

La via IRE1a-XBP1 controlla l’espressione delle citochine IL13 e IL5

IL5 e IL13 sono due importanti citochine di tipo 2 che sono coinvolte in eosinofilia, allergie e infezioni da elminti. Abbiamo trovato che l’inibizione del percorso IRE1a-XBP1 sopprime significativamente l’espressione della proteina IL5 e IL13 e la secrezione nel mezzo di coltura (Fig. 6 pannelli di destra della riga centrale e inferiore). L’analisi bioinformatica del trascrittoma Th2 predice che il percorso IRE1a-XBP1 controlla positivamente l’espressione dei geni IL5 e IL13, perché entrambi i geni sono stati identificati come geni differenzialmente espressi su inibizione IRE1a (file aggiuntivo 2: Tabella S1). Abbiamo convalidato questa previsione con l’analisi dell’espressione genica mediata da RT-qPCR (Additional file 1: Figura S6A, pannello centrale e destro) e la citometria a flusso (Fig. 6). Questi risultati suggeriscono un coinvolgimento trascrizionale del percorso che regola IL5 e IL13. In particolare, i livelli di mRNA e di proteina di IL4 non sono influenzati, indicando una regolazione specifica di IL5 e IL13.

La viaIRE1a-XBP1 facilita la proliferazione delle cellule T helper dipendente dall’attivazione

Il tasso di proliferazione cellulare è un risultato dell’interazione dei regolatori positivi e negativi. Abbiamo osservato che i geni che codificano entrambi i regolatori positivi e negativi della proliferazione cellulare sono differenzialmente espressi quando il percorso IRE1a-XBP1 è stato bloccato da 4μ8c (Fig. 7a, pannello sinistro, file aggiuntivo 7: Tabella S6), di cui molti geni sono risultati essere obiettivi diretti di XBP1 (Fig. 7a, pannello destro, file aggiuntivo 8: Tabella S7). Questa osservazione predice un cambiamento nel tasso di proliferazione all’inibizione di IRE1a. Pertanto, eravamo interessati a verificare l’effetto di IRE1a-XBP1 inibizione sulla proliferazione cellulare. Abbiamo eseguito il test di proliferazione cellulare usando cellule Th2. Le cellule T CD4+ spleniche ingenue sono state marcate con CellTrace violet e attivate in condizioni di differenziazione Th2 in presenza o assenza di 4μ8c. Il decadimento del colorante fluorescente è stato monitorato dalla citometria a flusso. Abbiamo trovato che la downregulation di XBP1s inibisce significativamente la proliferazione cellulare (Fig. 7b), ma non induce la morte cellulare (Additional file 1: Figure S7).

Fig. 7

La viaIRE1a-XBP1 promuove la proliferazione cellulare Th2 dipendente dall’attivazione e il ciclo cellulare. a Pannello sinistro: clustering gerarchico dei geni differenzialmente espressi associati alla proliferazione cellulare nel trascrittoma Th2 trattato con 4μ8c e non trattato. Pannello destro: raggruppamento gerarchico dei geni bersaglio diretto di XBP1 che sono noti per essere coinvolti nella proliferazione cellulare. La heatmap mostra valori di espressione in scala denotati come riga Z-score, in rosso-blu scala di colore con il rosso che indica l’espressione aumentata e blu che indica l’espressione diminuita. b cellule T helper ingenue spleniche sono stati colorati con CellTrace Violet colorante e attivato per 72 h in condizioni di differenziazione Th2 e analizzati mediante citometria a flusso. Generazioni di cellule Th2 sono in “rosso” e 4μ8c-cellule trattate sono in “blu” nell’istogramma della proliferazione cellulare (pannello sinistro, un esperimento rappresentativo). Rappresentazione grafica dell’indice di divisione come ottenuto da cinque repliche biologiche indipendenti (pannello destro)

La proliferazione delle cellule T helper è associata alla differenziazione e alla produzione di citochine. La ridotta espressione di IL5 e IL13 (Fig. 6) potrebbe potenzialmente essere spiegata dal fatto che la proliferazione cellulare è ritardata. Tuttavia, se la ridotta proliferazione fosse la ragione principale della mancanza di secrezione, anche la produzione di IL4 sarebbe inibita. Tuttavia, non abbiamo osservato alcun cambiamento significativo nell’espressione di IL4 dopo l’inibizione di IRE1a (Fig. 6, Additional file 1: Figura S6A). Per esaminare ulteriormente questa discrepanza, abbiamo eseguito saggi di proliferazione cellulare utilizzando linee di topo IL13-GFP e IL4-GFP reporter. In IL4-GFP esprimendo cellule Th2, abbiamo osservato un’inibizione della produzione di IL4 nelle prime generazioni di divisione cellulare fino a 72 ore dopo il trattamento 4μ8c (Additional file 1: Figura S8). Ma a 96 ore, la differenza nell’espressione di IL4 diventa insignificante indipendentemente da quale generazione di divisione cellulare le cellule sono in. Questa osservazione suggerisce che il ritardo della proliferazione dovuto all’inibizione di IRE1a non è sufficiente per inibire l’espressione di IL4. Al contrario, in IL13-GFP, abbiamo osservato la diminuzione dell’espressione di IL13 fin dalla prima generazione e questo continua nelle generazioni successive (Additional file 1: Figura S9).

L’inibizione diIRE1a ritarda la progressione del ciclo cellulare attraverso la fase S e G2/M

L’analisi bioinformatica dei geni differenzialmente espressi (Th2 vs Th2 trattati con 4μ8c) e dei geni bersaglio diretti di XBP1 rivela diversi geni che sono coinvolti nel controllo della progressione del ciclo cellulare attraverso diverse fasi (cioè, G1, S, G2/M) sono stati raggruppati in due gruppi up- o downregolati (Fig. 8a). Abbiamo preso i geni differenzialmente espressi in 4μ8c-trattati Th2 rispetto al Th2 non trattati (valore p aggiustato < 0,05) (Fig. 8a, a sinistra, file aggiuntivo 9: Tabella S8) e i geni differenzialmente espressi XBP1 geni bersaglio diretto (Fig. 8a, a destra, file aggiuntivo 10: Tabella S9), e controllato per ruoli noti attraverso fasi distinte ciclo cellulare utilizzando sia un elenco curato manualmente basato su dati RNA-seq o database pubblicato. Abbiamo trovato molti geni da tutte le fasi del ciclo cellulare (cioè, G1, S, e G2/M) sono stati interessati. Per identificare le fasi del ciclo cellulare regolate dal percorso IRE1a-XBP1, abbiamo creato e utilizzato un ceppo di topo transgenico FUCCI (indicatore fluorescente del ciclo cellulare dell’ubiquitina) che esprime mCherry-tagged Cdt1 e mVenus-tagged Geminin protein. Il ceppo è simile a quello utilizzato in . Le cellule G1 sono mCherry + mVenus- (Q3; Fig. 8b), le cellule G1-S sono mCherry + mVenus+ (Q2; Fig. 8b), e SG2M sono mCherry- mVenus+ (Q1; Fig. 8b), mentre le cellule in mitosi ed entrando G1 sono mCherry- mVenus- (Q4; Fig. 8b). Abbiamo confrontato i profili del ciclo cellulare delle cellule Th2 trattate con veicolo e 4μ8c durante l’attivazione delle cellule T. Abbiamo trovato che le cellule si sono accumulate nella fase S e/o G2/M quando il percorso IRE1a-XBP1 è bloccato (Fig. 8b). Risultati simili sono stati ottenuti in un approccio diverso utilizzando il saggio di incorporazione BrdU con colorazione DAPI (Additional file 1: Figura S10).

L’espressione transgenica di XBP1s completa l’inibizione 4μ8c-mediata dell’attività endonucleasica IRE1a

Per verificare se i fenotipi osservati trattati con 4μ8c erano dovuti alla perdita di XBP1s, abbiamo eseguito saggi di complementazione trasducendo un vettore di espressione XBP1s nelle cellule Th2 in vitro. Il vettore codificava la forma spliced di XBP1 (XBP1s), la cui funzione è indipendente dalla funzione IRE1a. Abbiamo trovato che l’espressione ectopica stabile di XBP1s nega l’effetto del trattamento 4μ8c e non vi è alcun cambiamento significativo nel trascrittoma su trattamento 4μ8c quando le cellule Th2 sovraesprimono XBP1s (Additional file 1: Figura S11A). Le cellule Th2 che sovraesprimono XBP1s proliferano e si differenziano normalmente in presenza di 4μ8c (Additional file 1: Figura S11B e S11C rispettivamente). Questi risultati suggeriscono fortemente che i fenotipi osservati su trattamento 4μ8c sono dovuti alla perdita di XBP1s.

Digital Travel