B Fotorecettori

Le degenerazioni dei fotorecettori sono la forma più comune di cecità nel mondo occidentale e comportano la perdita della vista dovuta alla distrofia e/o morte dei fotorecettori retinici. Queste patologie possono essere approssimativamente divise in quelle condizioni che inizialmente colpiscono i fotorecettori a bastoncello, come la retinite pigmentosa (RP), e quelle che inizialmente colpiscono i fotorecettori a cono, come la degenerazione maculare.141 Mentre la degenerazione dei fotorecettori può anche essere causata indirettamente da difetti primari nel RPE, che svolge una funzione importante nella salute e nell’omeostasi dei fotorecettori, questo argomento sarà discusso in una sezione successiva (vedi Sezione II.C).

I fotorecettori sono cellule sensoriali altamente polarizzate che consistono in un segmento interno (IS) che è collegato ad un segmento esterno (OS) da un cilium altamente modificato (Fig. 5).189 Nei fotorecettori maturi, le proteine che sono necessarie per la crescita e il mantenimento degli OS dei fotorecettori, così come per la fototrasduzione, sono trasportate lungo microtubuli polarizzati dall’IS basale all’OS apicale. I fotorecettori sono simili alle cellule epiteliali in quanto le loro superfici sono divise in domini apicali e basolaterali da giunzioni cellulari. I loro centrosomi si trovano sulla superficie apicale, mentre i loro nuclei risiedono basalmente.190 Il corretto sviluppo e il successivo mantenimento dei fotorecettori dei vertebrati si basa sull’istituzione di una corretta polarità apicale-basale, così come la funzione del macchinario di trasporto. Non è quindi sorprendente che degli oltre 100 loci genetici noti per causare degenerazioni dei fotorecettori nei vertebrati, la maggior parte riguarda la struttura e la funzione dell’OS.191

Fig. 5. Struttura dei fotorecettori del bastone e del cono. Le cellule dei fotorecettori sono composte da un segmento esterno che contiene dischi di membrana legati al pigmento visivo. Il segmento interno è il corpo cellulare polarizzato del fotorecettore, dove il nucleo risiede basalmente e il cilio ha origine apicalmente e si estende nel OS. Il terminale sinaptico forma connessioni sinaptiche con gli interneuroni della retina, trasmettendo l’input visivo.161,188

Schermi genetici nello zebrafish hanno fatto luce sulle basi molecolari di queste funzioni cellulari attraverso l’isolamento di mutanti in cui lo sviluppo e/o il mantenimento dei fotorecettori sono difettosi.24,192,193 Uno di questi mutanti, occhi a mosaico (moe), è stato trovato a contenere caratteristiche apicali estese nei fotorecettori.20,21 Il locus moe codifica una proteina contenente il dominio FERM che forma un complesso con le proteine Crumbs, che a loro volta hanno dimostrato di essere critiche per la polarità apicale-basale in Drosophila, così come nei vertebrati.194-196 È interessante notare che le mutazioni nell’ortologo umano di Crumbs, CRB1, sono associate a distrofie dei fotorecettori retinici come RP 12197 e l’amaurosi congenita di Leber (LCA1; Rif. 198,199). Altri mutanti di zebrafish, come nagie oko (nok) e heart and soul (has) non solo fenocopiano il fenotipo del mutante Moe, ma le proteine che codificano (Pals1 e PKCi, rispettivamente) interagiscono anche biochimicamente con Moe.20 Inoltre, il knockdown con morfolino di crb2b, un paralogo di Crumbs di zebrafish, risulta nella riduzione delle dimensioni di IS.14 Questi studi hanno quindi iniziato a scoprire il ruolo del complesso Crumbs nello sviluppo e nella malattia dei fotorecettori dei vertebrati.

La formazione di una corretta polarità apicale-basale dipende non solo dalla corretta funzione dei determinanti della polarità cellulare, ma anche dal loro trasporto e localizzazione. I fotorecettori nella retina mutante ale oko (ako) accumulano i determinanti apicali Pals1 e PKCλ nei loro corpi cellulari e mostrano un’estesa morte dei fotorecettori alla fine dello sviluppo.19 Il locus ako codifica la subunità p50 del complesso dynactin, che ha un ruolo importante nel trasporto del carico lungo i microtubuli come parte del complesso motore dynein.200 In un altro mutante, mikre oko (mok), che possiede una mutazione in dynactin-1, la degenerazione retinica è almeno parzialmente dovuta alla cattiva localizzazione dei nuclei dei fotorecettori. Sorprendentemente, a differenza dei mutanti ako, i determinanti apicali come Crumbs e aPKCλ non sono mal localizzati, suggerendo che la degenerazione in questi mutanti non è dovuta alla perdita di polarità cellulare. La dislocazione sperimentale del nucleo tramite la sovraespressione del motore dineina ha portato alla morte delle cellule dei fotorecettori, sostenendo il ruolo della posizione nucleare nella sopravvivenza dei fotorecettori.201 Mentre i difetti di posizionamento nucleare nei fotorecettori mok sembrano avere un ruolo autonomo delle cellule, altri componenti non autonomi delle cellule sembrano avere un ruolo nella degenerazione mok. Le analisi a mosaico hanno rivelato che i fotorecettori mutanti mostrano un aumento di 2,5 volte nella sopravvivenza quando sono collocati in un ambiente wild-type.17 Questa scoperta suggerisce che la salute e la sopravvivenza dei fotorecettori dipendono dalle indicazioni ambientali delle cellule circostanti. Questi risultati sono coerenti con i difetti associati ad alcune degenerazioni umane, come la RP, dove un difetto iniziale nella rodopsina specifica dei bastoncelli alla fine porta alla perdita sia dei bastoncelli che dei coni.202

Il trasporto dal corpo cellulare all’OS è anche importante per sostituire i componenti dell’OS che vengono persi a causa della continua fagocitosi degli OS dei fotorecettori da parte della RPE sovrastante.203 Nei fotorecettori, come nelle ciglia, il trasporto avviene tramite un processo noto come Trasporto Intraflagellare (IFT) e le mutazioni nei geni componenti IFT come ift57, ift80, ift88, e ift172 provocano l’atrofia della OS e/o la perdita completa della OS nei pesci zebra.24-Le mutazioni nel gene elipsa, che codifica una proteina che si pensa faciliti l’IFT,35 portano alla perdita precoce dei fotorecettori,22 mentre il knockdown con morfolino di più subunità del motore IFT retrogrado dynein-2 ha evidenziato l’importanza dell’IFT nel corretto allungamento dell’OS e nella funzione visiva.204 Le degenerazioni dei fotorecettori legate alla IFT difettosa sono alcuni dei molti fenotipi legati alle ciglia associati alla sindrome di Bardet-Biedl (BBS),205 e l’ulteriore studio della funzione dei componenti della IFT nello zebrafish potrebbe rivelarsi strumentale per ottenere una migliore comprensione delle cause molecolari alla base delle patologie oculari legate alla BBS.

Mentre i mutanti descritti finora in questa sezione sono stati isolati in schermi genetici utilizzando principalmente metodi istologici per rilevare i difetti dei fotorecettori, altri sono stati isolati in schermi comportamentali.15,82,206,207 Uno di questi schermi ha sfruttato la capacità dello zebrafish di esibire un comportamento dipendente dalla visione già a partire da 3 dpf (giorni dopo la fecondazione). Brockerhoff et al.15 hanno usato per la prima volta il saggio di risposta optocinetica (OKR) su embrioni mutagenizzati per rilevare difetti nella funzione visiva. Un secondo test ha coinvolto l’uso di registrazioni di elettroretinogramma (ERG) per identificare se le mutazioni isolate influenzano la funzione retinica esterna. Da questo schermo, sono stati isolati 18 mutanti che sono stati determinati per avere una ridotta funzione visiva. Uno, nessuna risposta optocinetica a (noa), non possedeva anomalie grossolane dei fotorecettori a 5 dpf (giorni dopo la fecondazione), ma è stato trovato cieco, oltre che letargico, ed è morto prematuramente. L’analisi della mutazione noa ha rivelato una carenza in una subunità del complesso piruvato deidrogenasi (PDH), che regola la produzione di energia nelle cellule. La linea mutante noa è stata usata come modello per lo studio della carenza di PDH (OMIM 245348), un disturbo umano che, come il modello del pesce zebra, provoca cecità, difetti neurologici e morte precoce.16 Poiché gli attuali trattamenti per la carenza di PDH negli esseri umani hanno avuto un successo limitato, Taylor et al. hanno utilizzato i mutanti noa per testare una dieta chetogenica che ha mostrato un certo successo nell’alleviare i sintomi della carenza di PDH in un numero limitato di pazienti umani. La somministrazione di questa dieta speciale ha ripristinato il comportamento normale nei mutanti noa, evidenziando il potenziale di studiare le terapie per la carenza di PDH nella linea mutante noa.

Un altro mutante, nessuna risposta optocinetica f (nof) è stato trovato in possesso di una mutazione nella subunità α della transducina conica (Tcα), una proteina G necessaria per la fototrasduzione. Nei pazienti umani che soffrono di una condizione nota come acromatopsia (OMIM 139340), le mutazioni in Tcα sono alla base della perdita della visione dei colori. Nei mutanti Nof, lo sviluppo del cono avviene normalmente; essi sono, tuttavia, fino a 1000× meno sensibili alla luce, come rilevato da registrazioni di singoli fotorecettori. Ampia analisi delle risposte alla luce del cono ha rivelato che la fototrasduzione residua è dipendente dalla luce, ma indipendente dalla transducina. L’afflusso di Ca+ 2, che è importante per l’adattamento alla luce dei fotorecettori e che in precedenza si pensava fosse controllato dalla trasducina, era ancora rilevabile nei mutanti nof. Questo studio ha quindi rivelato che una parte dell’afflusso di Ca+ 2 nei fotorecettori del cono potrebbe essere indipendente dalla transducina.

In uno screening separato, sono state eseguite mutazioni dominanti che causano degenerazione dei fotorecettori nello zebrafish adulto, al fine di isolare mutanti genetici che potrebbero essere successivamente utilizzati per studiare la cecità notturna ereditaria umana come la RP.37,38 Nel caso della RP, molti loci genetici sono alla base di questo gruppo di disturbi. Tuttavia, solo circa la metà dei casi di RP dominante sono stati collegati a mutazioni specifiche al momento in cui è stato eseguito lo screening.38 Li et al. hanno quindi sottoposto a screening zebrafish adulti mutagenizzati utilizzando una nota risposta di fuga esibita dai pesci. Una mancanza di tale risposta a un segnale minaccioso è stata interpretata come una perdita della vista, che è stata successivamente confermata utilizzando registrazioni ERG. In tutto, sono stati isolati sette mutanti eterozigoti (cecità notturna a, b, c, d, e, e f), sei dei quali hanno mostrato una degenerazione dei fotorecettori.38,39,208,209 Quattro dei sei sono risultati embrionalmente letali come omozigoti, suggerendo che i geni mutati alla base dei fenotipi dei fotorecettori hanno altre funzioni critiche durante lo sviluppo embrionale. Questa scoperta evidenzia l’importanza di tali schermi per l’identificazione di mutazioni dominanti che potrebbero non essere facilmente isolate nello screening tradizionale a causa della letalità embrionale precoce.