I ceppi globali bla KPC-E. coli sono diversi, anche all’interno del ST più prevalente, ST131, con prove di trasmissione locale

45 isolati sono stati ottenuti da 21 città in 11 paesi in quattro continenti (2010-2013; risultati di tipizzazione di laboratorio precedenti riassunti nella tabella S1). Un isolato era bla KPC-negativo sul sequenziamento del genoma intero (WGS; ecol_252), avendo potenzialmente perso bla KPC durante la conservazione o la sub-coltura nel periodo di tempo intercorso tra quando la tipizzazione originale è stata intrapresa e la successiva estrazione del DNA e la preparazione per WGS. Per un isolato i dati WGS non erano coerenti con i risultati della tipizzazione di laboratorio (ecol_451), probabilmente rappresentando un errore di laboratorio; ecol_252 ed ecol_451 sono stati quindi esclusi dalle analisi successive. Gli altri 43 isolati sono stati sequenziati con successo (per le metriche di qualità vedi Tabella S1). Tra questi 43 isolati, ventuno diversi ST di E. coli erano rappresentati (Tabella 1; predetto in silico da WGS), tra cui: ST131 , ST410 , ST38 , ST10, ST69 (gli isolati rimanenti ST singolari).

Di 16.053 open reading frame (ORF) annotati identificati in tutti gli isolati di KPC-E. coli, solo 2.950 (18,4%) erano condivisi in tutti gli isolati (“core”), e altri 222 (1,4%) nel 95- < 100% degli isolati (“soft core “27). A livello nucleotidico c’erano 213.352 varianti a singolo nucleotide (SNV) nel genoma del nucleo, coerentemente con la diversità di specie precedentemente osservata28. I profili dei geni di resistenza variavano anche notevolmente tra i ceppi, con alcuni che ospitavano diversi meccanismi di resistenza a beta-lattamici, aminoglicosidi, tetracicline e fluorochinoloni (ad esempio ecol_224) e altri che contenevano solo bla KPC (ad esempio ecol_584; Fig. 1). Per i 16 ceppi KPC-ST131, 4.071/7.910 (51%) ORF erano core, con 6.778 SNVs attraverso il genoma core di questi isolati, ancora una volta coerente con precedenti studi globali della diversità ST13123, 24 (Figura S1). I genomi accessori erano altamente concordanti per alcuni (ad esempio ecol_356/ecol_276/ecol_875), ma non tutti (ad esempio ecol_AZ159/ecol_244) gli isolati che erano strettamente correlati nei loro genomi centrali, sostenendo dinamiche evolutive altamente variabili tra i genomi centrali e accessori (Fig. 1). La distribuzione geografica degli isolati strettamente correlati sia nei genomi del nucleo che in quelli accessori supporta la trasmissione locale (ad esempio ecol_AZ166, ecol_AZ167 ) di particolari ceppi di KPC-E. coli. L’omologia dei motivi genetici di accompagnamento intorno ai geni bla KPC in queste coppie di isolati strettamente correlati sarebbe anche coerente con questa ipotesi, e meno coerente con eventi di acquisizione multipla di bla KPC all’interno dello stesso background genetico, soprattutto data la diversità nelle sequenze di accompagnamento di bla KPC osservate nel resto del set di dati (vedi sotto).

Filogenesi di KPC-Escherichia coli identificata dagli schemi di sorveglianza globale della resistenza ai carbapenemi, 2008-2013. I pannelli a destra della filogenesi rappresentano i meccanismi genetici di resistenza comuni (dettagli completi sulla tipizzazione dei geni di resistenza nella tabella S2), i componenti del genoma principale e accessorio. Per il pannello del genoma accessorio, il blu rappresenta le regioni annotate che sono presenti e il bianco quelle che sono assenti.

I geni bla KPC sembrano attualmente limitati a contesti plasmidici in E. coli, ma possono esistere in copie multiple su strutture plasmidiche singole o in plasmidi ad alto numero di copie

Trentaquattro isolati (80%) contengono bla KPC-2, e nove isolati (20%) bla KPC-3. L’integrazione cromosomica di bla KPC è stata descritta in altre Enterobacteriaceae, Pseudomonas e Acinetobacter spp. ma rimane rara5, 29, 30. Non c’erano prove di integrazione cromosomica di bla KPC sia nelle 18 strutture cromosomiche ricostruite dal sequenziamento long-read, o in base alla revisione delle annotazioni nei contigs contenenti bla KPC (derivati da Illumina de novo assemblies) per gli altri 25 isolati. Gli alleli bla KPC non sono stati segregati da ST.

Le stime del numero di copie bla KPC per cromosoma batterico variavano tra <1 (ecol_879, ecol_881) e 55 (ecol_AZ152). In nove casi questa stima era ≥10 copie di bla KPC per cromosoma batterico (ecol_276, ecol_356, ecol_867, ecol_869, ecol_870, ecol_875, ecol_AZ150, ecol_AZ152, ecol_AZ159, Tabella S2). Sei di questi isolati contenevano bla KPC in un contesto plasmidico simile al col, in due casi il tipo di rep del plasmide era sconosciuto, e in un caso era un replicone IncN. Il numero di copie del plasmide è associato a livelli più alti di resistenza agli antibiotici se il gene rilevante si trova su un’unità ad alta copia. È interessante notare che i plasmidi ad alto numero di copie sono postulati per avere maggiori possibilità di fissarsi nelle cellule discendenti, in quanto si distribuiscono più adeguatamente per caso e senza la necessità di sistemi di partizione31, e di essere trasferiti in qualsiasi evento di coniugazione, sia direttamente che indirettamente32,33,34.

Le popolazioni di plasmidi bla KPC e non-bla KPC nei ceppi globali di KPC-E. coli sono estremamente diverse

La tipizzazione del plasmide Inc ha rivelato la presenza di una mediana di quattro tipi di repliconi plasmidici per isolato (range: 1-6; IQR: 3-5), che rappresentano una grande diversità (Tabella 1). Tuttavia, i repliconi IncN, col, IncFIA e IncI1 erano sproporzionatamente sovrarappresentati in alcuni ST (p < 0,05; Tabella 1). Tra i 18 isolati che sono stati sottoposti a sequenziamento PacBio, abbiamo identificato 53 plasmidi chiusi, non-bla KPC, che vanno da 1.459 bp a 289.903 bp (Tabella S1; almeno quattro ulteriori, strutture plasmidiche parzialmente complete erano presenti). Di questi plasmidi non-bla KPC, 10 (dimensioni: 2.571-150.994 bp) avevano <70% di somiglianza (definita dall’identità di sequenza percentuale moltiplicata per la proporzione di lunghezza di query dimostrando omologia) ad altre sequenze disponibili in GenBank, evidenziando che una parte del “plasmidoma” in KPC-E. coli rimane incompletamente caratterizzato. Per gli altri 43 plasmidi, la corrispondenza principale in GenBank era un plasmide di E. coli in 35 casi, K. pneumoniae in 5 casi, e Citrobacter freundii, Shigella sonnei, Salmonella enterica in 1 caso ciascuno (Tabella S3).

Ventidue strutture plasmidiche bla KPC sono stati completamente risolti (17 da Pacbio dati solo, quattro da Illumina dati solo, 1 da entrambi PacBio e Illumina dati), che vanno da 14.029 bp a 287.067 bp (mediana = 55.590 bp; IQR: 23.499-82.765 bp). Questi plasmidi contenenti bla KPC, e sei casi aggiuntivi in cui bla KPC è stato identificato su un replicon-contenente contig, erano altamente diversificati in base alla tipizzazione Inc (Tabella S1). IncN era il tipo più comune (n = 8/28 strutture bla KPC tipizzabili; 29%), seguito da piccoli plasmidi simili a col (n = 6/28; 21%). Altri tipi meno comuni erano: A/C2, FII(k), U (tutti n = 2); e L/M, P, Q1 e R (tutti n = 1). Quattro (14%) plasmidi bla KPC erano costrutti multi-replicon, vale a dire: col/repA, FIB/FII, FIA/FII, e FIA/FII/R.

I plasmidi comuni IncN si sono dispersi globalmente all’interno di E. coli

Da GenBank, abbiamo selezionato tutte le sequenze uniche e completamente sequenziate di plasmidi IncN-bla KPC (Tabella S4) per il confronto, risalenti già al 2005, circa al tempo delle prime segnalazioni di E. coli produttore di KPC. I dorsali del plasmide e le sequenze che circondano bla KPC in questi 16 riferimenti plasmidici e un sottoinsieme di 12 sequenze di studio (vedi “Metodi”) erano coerenti con le acquisizioni multiple di due noti complessi IncN-Tn4401-bla KPC in E. coli ST divergenti: in primo luogo, all’interno di uno sfondo Plasmid-9 (FJ223607, 2005, USA) simile, e in secondo luogo, all’interno di un elemento Tn2/3-like in uno sfondo Plasmid-12 (FJ223605, 2005, USA) simile.

In primo luogo, sono state identificate somiglianze genetiche tra Plasmide-9, pKPC-FCF/3SP, pKPC-FCF13/05, pCF8698, pKP1433 (che rappresenta un ibrido IncN), e i plasmidi bla KPC degli isolati ecol_516, ecol_517, ecol_656, ed ecol_736 (questo studio). Il plasmide-9 contiene elementi Tn4401b duplicati in orientamento inverso con quattro diverse sequenze di 5 bp di accompagnamento in una disposizione atipica all’interno di un introne di gruppo II35. Le strutture della spina dorsale degli altri plasmidi di questo gruppo sono coerenti con un evento separato di acquisizione di un elemento Tn4401b tra le regioni pld e traG all’interno di una versione ancestrale della struttura di Plasmid-9, con la generazione di una duplicazione del sito bersaglio (TSD) TTCAG fiancheggiante (etichettato come Plasmid 9-like plasmid (hypothetical), Fig. 2). La diffusione internazionale seguita dall’evoluzione locale sia all’interno che tra le specie spiegherebbe le differenze tra i plasmidi, tra cui: (i) variazione a livello nucleotidico (osservata in tutti i plasmidi); (ii) piccoli eventi di inserimento/cancellazione (osservati in tutti i plasmidi); (iii) eventi di inserimento/cancellazione più grandi mediati da elementi trasponibili (ad esempio pCF8698_KPC_2); e (iv) probabile ricombinazione omologa, con conseguente variazione a grappolo all’interno di un backbone plasmidico simile (ad esempio ecol_656/ecol_736), così come riarrangiamenti più distinti, compresa la formazione di plasmidi “ibridi” (ad esempio pKP1433) (Fig. 2).

Schema di confronto dei plasmidi FJ223607-like (Plasmid 9-like) IncN (pubblicamente disponibili; questo studio), e la loro origine geografica / data di isolamento. I nomi delle sequenze dei plasmidi in rosso sono quelli di questo studio, derivati dai dati PacBio e dalle strutture dei plasmidi chiusi (ecol_517, ecol_656) o incompleti (ecol_516, ecol_736) derivati dai dati Illumina. Le barre allineate adiacenti ai nomi dei plasmidi rappresentano le sequenze del plasmide: il grigio chiaro denota le regioni con il 100% di identità di sequenza; il nero rappresenta la diversità nucleotidica tra le sequenze e le linee sottili rappresentano gli indel. Le sequenze di codifica sono rappresentate da frecce grasse sotto le barre di sequenza individuale e sono codificate a colori secondo la chiave di colore. L’inserto schematico che descrive la variazione genetica tra le sequenze raffigura esempi di eventi evolutivi identificati: (a) cambiamento a livello di singolo nucleotide, (b) piccoli indel (≤100 bp), (c) grandi indel (>100 bp), (d) eventi di ricombinazione.

Nel plasmide-12 (FJ223605), Tn4401b si è inserito in un elemento ibrido Tn2-Tn3-like (con associati geni di resistenza ai farmaci tra cui bla TEM-1, bla OXA-9, e diversi geni di resistenza aminoglicoside), anche se in assenza di duplicazione della sequenza bersaglio, forse come risultato di un evento di trasposizione replicativa intra-molecolare che genera sequenze di siti bersaglio non corrispondenti (L TSS = TATTA; R TSS = GTTCT). Questo complesso è a sua volta situato tra due IS15DIV (IS15Δ)/IS26-come elementi fiancheggiati da 8 bp ripetizioni invertite, e situato tra il traI (891 bp dalla fine 3′) e pld loci (~ 28 Kb; Fig. 3A). I componenti della spina dorsale del Plasmide-12 IncN sono coerenti con quelli visti in un focolaio NIH5 e in una versione riarrangiata in un focolaio dell’Università della Virginia (CAV1043; 2008)6. Da questo studio, i plasmidi da ecol_224, ecol_881, ecol_AZ159, ecol_422, e scaffold da ecol_AZ151, ecol_744, ecol_AZ150 tutti condividono strutture quasi identiche a Plasmid-12, con variazione a livello di nucleotide cluster presente nei geni traJ-traI, coerente con un evento di ricombinazione omologa che colpisce questa regione, e la prova di sporadici eventi di inserimento / delezione (Fig. 3A). Tuttavia, le strutture bla KPC-Tn4401 in questi isolati sono quasi interamente degradate dalla presenza di altri elementi genetici mobili (MGE), compresi gli elementi Tn2/Tn3-like, ISKpn8/27 e Tn1721. In ecol_224, bla KPC-2 è stato inserito nel backbone IncN come parte di due ripetizioni, strutture invertite Tn3-like, fiancheggiate da un TTGCT TSD, e più vicino a traI (136 bp dall’estremità 3′) rispetto al già citato complesso IS15DIV (IS15Δ)/IS26-like nel Plasmide-12 (Fig. 3B). Anche se non è possibile tracciare con precisione la storia evolutiva di questa regione genomica dati i dati disponibili, la presenza di firme condivise di questa struttura in ecol_422, ecol_744, ecol_881, ecol_AZ159, ecol_AZ150 e ecol_AZ151 suggeriscono una comune acquisizione, e molteplici riarrangiamenti successivi mediati dalla presenza del gran numero di MGEs fiancheggiando bla KPC-2.

Schema di confronto dei plasmidi IncN KPC FJ223605-like (Plasmid-12-like) da questo studio. Pannello 3A. Origine geografica, date di isolamento e allineamento complessivo delle strutture plasmidiche/contig. I nomi delle sequenze dei plasmidi in rosso sono quelli di questo studio, derivati dai dati PacBio e dalle strutture plasmidiche chiuse (ecol_224, ecol_422, ecol_881, ecol_AZ159) o incomplete (ecol_744, ecol_AZ151, ecol_AZ150) derivati dai dati Illumina. Le barre allineate adiacenti ai nomi dei plasmidi rappresentano le sequenze del plasmide: il grigio chiaro denota le regioni con il 100% di omologia di sequenza; il nero rappresenta la diversità nucleotidica tra le sequenze; e le linee sottili rappresentano gli indel. Le sequenze di codifica sono rappresentate da frecce grasse sotto le barre di sequenza individuale e sono codificate a colori secondo la chiave di colore. L’inserto schematico che descrive la variazione genetica tra le sequenze raffigura esempi di eventi evolutivi identificati: (a) cambiamento a livello di singolo nucleotide, (b) piccoli indel (≤100 bp), (c) grandi indel (>100 bp), (d) eventi di ricombinazione. Pannello 3B. Primo piano della regione tra traI e pld contenente bla KPC-2 solo negli isolati di studio. Le sequenze di codifica sono codificate a colori come in Fig. 3A; le regioni di sequenza a cui si fa riferimento nel testo sono annotate.

I plasmidi simili a coli possono rappresentare un importante vettore di trasmissione per bla KPC in E. coli

Piccoli plasmidi col-like erano il secondo tipo più comune di plasmide portatore di bla KPC in E. coli (n = 5), ma tre di questi erano identici (bla KPC-2, 16.559 bp), tutti isolati a Pittsburgh, USA, da isolati ST131 in un periodo di due anni (ecol_276 , ecol_356 , ecol_875 ). Questi tre isolati contenevano inoltre repliconi FIA, FIB, FII, X3 e X4, suggerendo una persistenza stabile di un ceppo clonale + plasmidi nel tempo, coerente con entrambe le analisi SNV/core e del genoma accessorio (Fig. 1, Figura S1).

Gli altri due plasmidi simili a col rappresentano effettivamente brevi tratti di DNA che codificano diversi geni di mobilizzazione (mbeA/mbeC/mbeD) imbrigliati nei moduli Tn4401/bla KPC. Le sequenze di 5 bp che fiancheggiano Tn4401 erano coerenti con la trasposizione diretta, intermolecolare in entrambi i casi (ecol_870: TGTTT-TGTTT; ecol_867: TGTGA-TGTGA). Un plasmide co-integrato col/repA è stato anche osservato in questo set di dati (ecol_AZ161), in cui Tn4401b è stato inserito tra le sequenze di firma colE3 e un elemento Tn3 (Tn4401 TSS: AGATA-GTTCT). La formazione di tali strutture plasmidiche co-integrate in E. coli è stato descritto in precedenza36, compreso quello di una struttura plasmidica fusa col/pKpQIL-like (pKpQIL è storicamente associato a bla KPC)37.

I plasmidi col-like sono stati associati ai produttori di KPC in altri studi regionali più piccoli21, 38. È preoccupante che questi piccoli vettori abbiano dimostrato di essere responsabili della diffusione interspecie dei geni qnr che mediano la resistenza al fluorochinolone, anche in assenza di qualsiasi evidente pressione di selezione antimicrobica39. L’associazione significativa di plasmidi col-like con particolari ST di E. coli (prevalentemente ST131) in questo studio potrebbe essere una spiegazione per la rappresentazione sproporzionata di bla KPC in questo lignaggio.

Le diverse sequenze di siti bersaglio (TSS) di Tn4401 da 5 bp supportano un’elevata mobilità del trasposone

Le isoforme complete di Tn4401 che fiancheggiano bla KPC-2 o bla KPC-3 sono state osservate solo in 24/43 (56%) isolati, compreso Tn4401a/a-like (n = 10; un isolato con una rottura del contig a monte di bla KPC), Tn4401b (n = 12) e Tn4401d (n = 2) varianti. Sono state identificate undici diverse coppie di sequenze di siti bersaglio (TSS) da 5 bp, di cui 7 (64%) non sono state osservate in nessun plasmide di confronto scaricato da GenBank (Tabella S5). Tn4401a aveva tre diverse TSS da 5 bp, Tn4401b sette, e Tn4401d una. La maggior parte rappresentava TSDs, ma in tre casi diversi 5 bp TSSs erano fiancheggianti Tn4401, coerente con entrambi diretti inter- e replicativi intra-molecolare eventi di trasposizione.

Dalla serie completa di plasmidi GenBank e in vitro trasposizione esperimenti effettuati da altri, 30 diversi tipi di 5 bp coppie TSS sono stati caratterizzati, sette in ambiente sperimentale solo40. I plasmidi scaricati provengono da una gamma di specie e punti di tempo (2005-2014), anche se possono sotto-rappresentare più ampio Tn4401 inserimento diversità sito come risultato di bias di campionamento. I nostri dati, tuttavia, sarebbero coerenti con una significativa mobilità Tn4401 all’interno di E. coli in seguito all’acquisizione di diverse isoforme Tn4401 e/o rappresentano eventi multipli di importazione in E. coli da altre specie.

La tradizionale associazione di bla KPC con Tn4401 è stata significativamente erosa nei plasmidi KPC in E. coli

In particolare, negli altri 19/43 (44%) isolati la struttura Tn4401 era stata degradata attraverso la sostituzione con MGE, solo alcuni dei quali sono stati precedentemente descritti41, 42. Due isolati avevano nuove strutture Tn4401Δb (troncamenti a monte da IS26 o IS26-ΔIS5075 ). Una struttura simile a Tn4401e (delezione di 255 bp a monte di bla KPC) era presente in tre isolati (ecol_227, ecol_316, ecol_583): questa è stata ulteriormente caratterizzata in un assemblaggio completo del plasmide PacBio (ecol_316) e rappresenta un riarrangiamento nel sito del TSS L dell’elemento ISKpn7. In questo plasmide, un secondo elemento Tn4401 parziale era presente senza bla KPC, che sarebbe coerente con un evento di trasposizione intra-molecolare incompleto, replicativo (GGGAA = L TSS e R TSS sui due elementi Tn4401b, in orientamento inverso). Altri motivi che fiancheggiano bla KPC includono: elementi ibridi Tn2/Tn3-ISKpn8/27-bla KPC (n = 1; ecol_224); IS26-ΔtnpR(Tn3)-ISKpn8/27- bla KPC-ΔTn1721-IS26 (n = 5; ecol_AZ153-AZ155, ecol_AZ166, ecol_AZ167); ISApu2-tnpR(Tn3)-ΔblaTEM -bla KPC- korC-klcA-ΔTn1721-IS26 (n = 1; ecol_542); IS26-tnpR(Tn3)-ΔblaTEM -bla KPC-korC-IS26 (n = 1; ecol_545); elementi ibridi Tn2/Tn3 + ΔblaTEM-bla KPC-ΔTn1721 (n = 2; ecol_744, ecol_422), elementi Tn3-Δbla TEM-bla KPC- ΔTn1721 (n = 4; ecol_881, ecol_AZ151, ecol_AZ159, ecol_AZ150) e ΔTn3-Δ -ΔIS3000 (Tn3-like) (n = 1; ecol_AZ152). Non siamo stati in grado di valutare il contesto fiancheggiatore di bla KPC in ecol_452 a causa delle limitazioni dell’assemblaggio.

Questa apparente diversità in MGEs acquisiti indipendentemente intorno al gene bla KPC estende i mezzi con cui bla KPC può essere mobilitato. È interessante notare che, come osservato in precedenza43, tutte le sequenze degradate Tn4401 in questo set di dati sono stati associati con tratti variabili di fiancheggiare sequenze Tn2/3-like, suggerendo che l’inserimento di Tn4401 in un contesto Tn2/Tn3-like può aver permesso quest’ultimo di agire come un hotspot per l’inserimento di altri MGEs6. Una scoperta particolare di nota è l’associazione con IS26, che è stato collegato alla diffusione di diversi altri geni di resistenza in E. coli, tra cui CTX-M ESBLs24, 44; è in grado di aumentare l’espressione dei geni di resistenza strettamente co-located45; partecipa alla formazione di co-integrati e quindi riarrangiamento del plasmide46; e migliora il verificarsi di altri eventi di trasferimento IS26-mediato in plasmidi che ospitano IS26 46.

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