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Cos’è l’imaging a largo campo?

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Introduzione

Ogni tecnica di microscopia in cui l’intero campione è esposto alla luce è conosciuta come imaging ‘widefield’. La controparte di widefield è la confocale, dove i fori di spillo sono usati per bloccare la maggior parte della luce da e verso il campione. Questo articolo discuterà l’imaging a campo largo e le tecniche a campo largo più utilizzate in microscopia.

Microscopi a campo largo

In campo largo, l’intero campione è illuminato da una sorgente luminosa a lampada dal basso (un microscopio verticale) o dall’alto (un microscopio invertito). I microscopi verticali sono spesso utilizzati con campioni fissi come cellule o tessuti che sono stati trattati e montati su vetrini da microscopio, mentre i microscopi invertiti sono spesso migliori per l’imaging di un campione immerso in un liquido, in quanto in genere affonda sul fondo ed è più facile da vedere dal basso con gli obiettivi del microscopio. Questo permette l’imaging di cellule in sospensione, dato che le cellule studiate nelle scienze della vita sono tipicamente o aderenti (crescono attaccate a una superficie) o crescono in sospensione (cellule sospese in un liquido). Esempi di un microscopio verticale e rovesciato possono essere visti in Fig.1.

Figura 1: Microscopi verticali e rovesciati. Sinistra) Microscopio verticale: immagine osservata dall’alto e illuminata dal basso. Destra) Microscopio invertito: immagine osservata dal basso e illuminata dall’alto. Entrambi i microscopi possono anche usare l’illuminazione epifluorescente dove la fonte di luce e l’immagine passano attraverso gli stessi obiettivi. La transilluminazione include tecniche come il contrasto di fase e il DIC, discusse di seguito. Immagine da Molecular Probes.

I microscopi a campo largo usano tipicamente una fonte di luce bianca (come una lampada) è sufficiente con alcuni filtri per il lavoro in fluorescenza. Questo rende anche l’imaging più semplice e le dimensioni dei file delle immagini più piccole, rendendo più facile lavorare con il widefield per applicazioni come la documentazione cellulare.

Tecniche widefield

Esempi di tecniche di microscopia widefield sono brightfield, contrasto di interferenza differenziale (DIC), contrasto di fase e fluorescenza widefield.

La microscopia brightfield è una forma accessibile di microscopia, dove un intero campione è illuminato da una luce brillante. Questo approccio comporta poca preparazione del campione e può essere utilizzato per controllare rapidamente e facilmente le cellule vive o per produrre dati supplementari. Tuttavia, l’uso di un agente di contrasto è altamente raccomandato in quanto la maggior parte dei campioni di cellule sono trasparenti e saranno difficili da risolvere senza una macchia o un colorante. Le cellule sono per lo più acqua e quando vengono riprese su vetro trasparente o plastica, può essere difficile individuare le strutture più piccole senza un contrasto aggiuntivo.

Per il contrasto di interferenza differenziale (DIC), il campione è illuminato da una luce divisa in due fasci di luce polarizzati, quando questi fasci si ricombinano le differenze di spostamento di fase appaiono come contrasto nell’immagine finale. Analogamente al contrasto di fase, questa tecnica non è adatta a campioni più spessi e richiede un setup più tecnico di altre tecniche.

La microscopia a contrasto di fase fornisce un contrasto migliore del campo chiaro utilizzando la luce diffusa dal campione. Illuminando il campione con un anello di luce e avendo un altro anello di fronte al mirino del microscopio, le parti del campione che diffondono la luce in modo diverso appaiono più scure o più chiare sull’immagine, dando più contrasto rispetto alla microscopia standard in campo chiaro. Questo contrasto migliorato non si vede sui campioni più spessi perché produce artefatti, ma funziona bene con le colture cellulari. Un esempio di questi anelli può essere visto in Fig.2.

Figura 2: L’immagine in alto mostra un cursore del microscopio per campo chiaro e contrasto di fase, con il cerchio più a destra usato per campo chiaro e gli altri due usati per contrasto di fase, a seconda dell’ingrandimento (4x e 10/20/40x come mostrato). L’immagine in basso mostra i campioni ripresi con DIC o contrasto di fase e le differenze tra queste tecniche. Immagini adattate da Eurotek, Olympus.

La microscopia a fluorescenza a campo largo è simile al campo chiaro, ma vengono usate specifiche lunghezze d’onda della luce per eccitare molecole fluorescenti con cui il campione è stato pretrattato (anche se alcuni campioni sono naturalmente autofluorescenti). I campioni possono essere colorati con marcatori fluorescenti per proteine specifiche o componenti cellulari, e poi la luce di emissione della fluorescenza da questi marcatori forma un’immagine. Il segnale di fluorescenza significa che c’è un contrasto migliore rispetto ad altre tecniche, poiché usando lunghezze d’onda specifiche della luce solo le molecole fluorescenti emettono luce, invece di illuminare l’intera immagine. Tuttavia, poiché l’intero campione è illuminato con questa luce, i segnali di fluorescenza provenienti dall’esterno dell’area di visualizzazione possono causare una fluorescenza di fondo e immagini sfocate.

Figura 3: microscopia DIC vs contrasto di fase vs fluorescenza per lo stesso campione di neuroni. Sinistra) DIC, le cellule possono essere identificate ma gli assoni no, il contrasto è scarso. Centro) Contrasto di fase, maggiore contrasto del DIC con cellule e assoni facilmente identificati. Destra) Fluorescenza ad ampio campo, cellule e assoni facilmente identificati, con proteine selezionate ulteriormente evidenziate a colori dai marcatori fluorescenti (verde per la β-tubulina, un marcatore neuronale, blu per il DAPI, un marcatore del nucleo). Immagine da Leica Microsystems: Introduction to Widefield Microscopy.

Out-Of-Focus Light

Lo svantaggio principale è che mentre l’intero campione è illuminato, mentre il piano focale riceve la luce e può generare un’immagine, i piani sopra e sotto il piano focale ricevono anche la luce, con conseguente luce fuori fuoco che causa il degrado delle immagini. Specialmente per l’eccitazione della fluorescenza, la risoluzione di un sistema ad ampio campo è limitata a causa della fluorescenza di fondo anche essere catturato dalla fotocamera e diminuendo il rapporto segnale-rumore.

Alcune tecniche widefield evitano questo problema, come la microscopia a illuminazione strutturata (SIM), che utilizza modelli di luce per generare un modello complesso, l’imaging basato sull’interferenza del modello consente livelli di super-risoluzione di dettaglio, risolvendo oggetti piccoli come 200 nm. Maggiori informazioni sulla SIM possono essere lette nella nota dell’applicazione SIM sul nostro sito web.

Sommario

L’imaging a campo largo è il fondamento della maggior parte degli studi cellulari, permettendo ai ricercatori di visualizzare rapidamente e facilmente i campioni con bassi livelli di preparazione del campione o competenze tecniche necessarie. Dal campo chiaro all’imaging a fluorescenza, il widefield è una tecnica potente e varia con cui molti ricercatori hanno familiarità. Anche se la tecnica può mancare di risoluzione rispetto alla confocale o ad altre applicazioni di microscopia avanzata, l’imaging a campo largo ha un posto fisso nella ricerca e continuerà a svilupparsi nel tempo.