Di Sara Ryding, B.Sc.Reviewed by Deepthi Sathyajith, M.Pharm.

Whole genome bisulfite sequencing, o WGBS, è una tecnica di sequenziamento di nuova generazione per analizzare la metilazione del DNA.

Image Credit: Egorov Artem /

La metilazione del DNA è un meccanismo epigenetico per regolare l’espressione genica e comporta l’aggiunta di un gruppo metile a una base citosina. Modelli anormali di metilazione sono stati associati a diverse condizioni e malattie, come il cancro. Dallo sviluppo del WGBS, è stato applicato per studiare la riprogrammazione epigenetica, le firme epigenetiche e altro.

Metodologia di base

WGBS combina l’uso del trattamento con bisolfato di sodio e il sequenziamento del DNA ad alta produttività. Il bisolfito di sodio protegge le citosine metilate, o metilcitosine, dalla conversione, mentre le citosine non metilate vengono convertite in uracile.

Le citosine non metilate sono poi ulteriormente convertite in timina dopo la PCR, il che significa che i risultati del sequenziamento mostrano prevalentemente basi di adenina, guanina e timina, con tutte le basi di citosina che indicano siti di citosina metilata.

Il metodo fu inizialmente tentato su Aradopsis thaliana, una pianta, a causa del suo genoma relativamente piccolo. Da allora si è dimostrato capace di analizzare circa il 90% di tutte le citosine che sono state tentate. La tecnica WGBS è stata applicata ai genomi dell’uomo, del topo, del mais e della soia.

Applicazioni delle cellule staminali

Le cellule staminali sono cellule indifferenziate che conservano la capacità di diventare qualsiasi tipo di cellula, come neuroni o cellule muscolari. Questo le rende di grande interesse per i biologi dello sviluppo ed eventuali applicazioni in medicina, per capire cosa le rende diverse dalle cellule mature.

Le prime mappe di risoluzione a base singola del genoma delle citochine metilate nelle cellule staminali embrionali umane e nei fibroblasti fetali hanno mostrato grandi differenze tra i due. Nelle cellule embrionali, quasi un quarto di tutta la metilazione identificata era in un contesto di guanina non-citosina (CG), mentre nelle cellule fetali il 99,98% delle metilcitosine era nel contesto GC.

Il contesto non-CG significa che era in CHG o CHH, dove H rappresenta l’adenina, la timina o la citosina. Prima di questo, si credeva prevalentemente che quasi tutta la metilazione del DNA dei mammiferi avvenisse nel contesto CG, mentre questo studio ha indicato che può essere una caratteristica generale nelle cellule staminali embrionali umane.

La metilazione non-CG sembrava essere persa durante la differenziazione. La metilazione non-CG è stata ripristinata quando le cellule fetali sono state manipolate in cellule staminali pluripotenti indotte. Questo dimostra anche che la metilazione CHG e CHH non è dovuta a differenze genetiche, ma è invece una caratteristica delle cellule staminali embrionali.

Lo studio precedente ha indicato che le cellule staminali, sia quelle pluripotenti indotte che quelle embrionali, condividono caratteristiche epigenetiche attraverso la metilazione. Le cellule staminali sono tremendamente importanti per scopi terapeutici e per lo studio delle malattie. Differiscono dalle cellule somatiche per trasformazioni epigenomiche, piuttosto che genetiche, rendendo lo studio del loro modello di metilazione molto interessante.

Uno studio successivo si è concentrato sulle differenze tra le cellule staminali embrionali e le cellule staminali pluripotenti indotte e ha scoperto che mentre il loro modello di metilazione è molto simile a livello globale, le cellule staminali pluripotenti indotte mostrano una variazione sostanziale nella riprogrammazione rispetto alle cellule staminali embrionali. Così, mentre il WGBS ha aiutato a chiarire molto sulle cellule staminali, rimangono ancora alcune domande.

WGBS nella biologia dello sviluppo

La metilazione del DNA è importante durante il normale sviluppo nei mammiferi. In particolare, la metilazione non-CG è diffusa nelle cellule staminali pluripotenti e negli ovociti.

I ricercatori hanno usato il WGBS per esplorare ulteriormente questo concetto e hanno scoperto che quasi due terzi di tutta la metilazione negli ovociti delle vescicole germinali del topo avviene in un contesto non-CG. Hanno anche scoperto che la metilazione dei siti non-CG si accumula durante la crescita dell’ovocita.

La metilazione non-CG sembra dipendere da alcune metiltransferasi in particolare, cioè il complesso delle metiltransferasi del DNA, cioè il complesso Dnmt3s-Dnmt3L. Al contrario, Dnmt1 sembrava mantenere la metilazione CG.

L’eredità della programmazione epigenetica è più comune nelle piante che nei mammiferi. Uno studio incentrato sulla metilazione ha scoperto che, utilizzando WGBS, la linea germinale delle piante ha conservato la metilazione CG e CHG. Questo è in contrasto con i mammiferi dove la metilazione CHH è persa nelle microspore e nelle cellule spermatiche. Tuttavia, viene ripristinata dalla metiltrasferasi del DNA de novo guidata da un piccolo RNA dopo la fecondazione.

WGBS per la diagnosi precoce delle malattie

Gli studi hanno dimostrato che WGBS può essere usato per rilevare la metilazione anormale attraverso lo screening di specifici geni soppressori iper-metilati come si è visto nei tumori come la leucemia promielocitica acuta, il cancro gastrico e così via.

Applicazioni di WGBS nelle scienze forensi

Sono stati condotti studi forensi su campioni di macchie di sangue essiccate usando WGBS dopo l’estrazione del DNA. L’uso di WGBS fornisce campioni di alta qualità che migliorano l’analisi della metilazione del DNA sulle macchie forensi.

In sintesi, WGBS sta diventando sempre più popolare nello studio della metilazione del DNA grazie alla capacità di questa tecnica di stimare la metilazione del DNA del DNA genomico convertito con bisolfito ad una risoluzione del singolo nucleotide.

Anche se il WGBS è uno strumento molto efficiente per la comprensione della riprogrammazione epigenetica, è di uguale importanza sviluppare e mantenere una tecnologia di sequenziamento ad alto costo che possa essere utilizzata in vari campi della ricerca scientifica.

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Written by

Sara Ryding

Sara è una scrittrice appassionata di scienze biologiche specializzata in zoologia e ornitologia. Attualmente sta completando un dottorato alla Deakin University in Australia che si concentra su come i becchi degli uccelli cambiano con il riscaldamento globale.

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