Disegno dello studio e partecipanti

Abbiamo condotto uno studio prospettico sull’accuratezza diagnostica dell’Ultra sia sul tessuto FNA che sulla biopsia del nucleo linfonodale in pazienti con sospetta adenite tubercolare. Lo studio è stato eseguito presso il Groote Schuur Hospital, un centro accademico di riferimento terziario a Città del Capo, Sud Africa. I partecipanti allo studio ammissibili erano adulti (≥18 anni), sia ricoverati che ambulatoriali, con linfonodi ingrossati di >20 mm nel diametro più largo situati nella regione cervicale, ascellare o inguinale. I pazienti in terapia per la tubercolosi sono stati arruolati a condizione che questa fosse stata somministrata per <1 mese (le sotto-analisi sono state fatte in pazienti in terapia per la tubercolosi per <24 ore). I pazienti con controindicazioni alla biopsia con ago centrale (piastrine basse, altre coagulopatie e rischio di sanguinamento, clinicamente instabile, sito di biopsia non sicuro) sono stati esclusi. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti. Il Comitato Etico per la Ricerca Umana della Facoltà di Scienze della Salute dell’Università di Città del Capo ha approvato lo studio.

I pazienti provenivano da Groote Schuur e da ospedali di livello secondario e cliniche diurne nell’area di riferimento. Sono stati registrati i risultati delle indagini precedenti sulla tubercolosi (espettorato Xpert o coltura della tubercolosi da qualsiasi sito entro 3 mesi dal rinvio, o lipoarabinomannano (LAM) nelle urine). Sono stati ottenuti dettagli sullo stato dell’HIV, sul trattamento della tubercolosi e sull’ART.

Raccolta dei dati

Informazioni demografiche, sintomi, durata dei sintomi, risultato del test HIV e altre indagini sulla TB eseguite sono stati registrati al momento dell’arruolamento. Il performance status è stato classificato secondo l’Eastern European Cooperative Group (ECOG). Il sito della biopsia è stato registrato, insieme ad altri siti di linfoadenopatia. La presenza e la durata dei sintomi costituzionali (tosse, perdita di peso, sudorazione notturna) sono state specificamente indagate, così come la durata in cui il paziente ha notato la linfoadenopatia. Il sangue è stato prelevato per un emocromo completo con differenziale, lattato deidrogenasi e stato dell’HIV e, se positivo, un conteggio dei CD4 e una carica virale per chi è in ART.

Procedimenti di studio e raccolta dei campioni

FNA è stato eseguito utilizzando un ago 22G e una siringa da 5 mL; ulteriori procedure di studio sono state determinate dal volume del campione aspirato ottenuto come mostrato in Fig. 1. Una biopsia con ago centrale è stata eseguita solo quando < 0,5 mL di materiale caseoso è stato ottenuto dall’aspirato, a causa del rischio di causare un seno drenante. Inizialmente, quando sia un FNA che una biopsia sono stati eseguiti su un partecipante, l’Ultra è stato eseguito solo sul tessuto, ma c’è stato un cambiamento di protocollo dopo 25 pazienti e l’Ultra è stato eseguito sia sul FNA che sul tessuto sullo stesso paziente. Quando un paziente aveva sia un FNA che una biopsia con ago centrale, la coltura della TB veniva eseguita solo sul campione di tessuto. Per l’Ultra sul FNA, l’ago e la siringa sono stati lavati in un contenitore sterile contenente 2 mL di soluzione fisiologica. Uno striscio essiccato all’aria per gli AFB è stato fatto al letto del paziente da un secondo FNA. Per la coltura dal FNA, l’aspirato è stato risciacquato in un mezzo di coltura per micobatteri (Middlebrook 7H9 broth medium). La core-needle biopsy è stata eseguita da una pistola bioptica automatizzata (BARD Magnum™, CR Bard Inc., Covington, GA, USA) con un ago 14G. Se il linfonodo non era ovviamente palpabile, la biopsia è stata eseguita sotto guida ecografica. Due o tre carote sono state inviate in formalina per l’istologia (10-15 mm di lunghezza), un’altra carota è stata tagliata in due con una lama sterile e inviata per la coltura e la Ultra, entrambe in 2 ml di soluzione salina 0,9%. Se tutti i test eseguiti erano inconcludenti, il paziente veniva sottoposto a una ripetizione della biopsia con ago e nucleo o a una biopsia di escissione a discrezione del medico curante.

Procedure dello studio

Esami di laboratorio

I campioni di FNA e di tessuto sono stati trasportati entro 2 ore dalla raccolta in un laboratorio centralizzato e trattati individualmente utilizzando protocolli standardizzati da personale di laboratorio qualificato. Lo striscio fatto al letto del paziente è stato esaminato da Ziehl-Neelsen (ZN) per gli AFB. Il tessuto ottenuto con la biopsia con ago centrale è stato frantumato con pestello e mortaio. Una piccola porzione è stata spalmata su un vetrino ed esaminata con una macchia ZN per AFBs. La coltura micobatterica è stata eseguita utilizzando un sistema automatico di coltura micobatterica liquida (BACTEC™ MGIT™ 960; Becton, Dickinson and Company, New Jersey, USA). I linfonodi sono considerati un sito sterile e la decontaminazione non è stata eseguita prima della biopsia liquida. Se l’MGIT è risultato positivo, una goccia è stata inoculata su agar sangue al 2% e incubata per 24 ore per verificare la crescita batterica. Se non c’era crescita batterica, la MGIT veniva segnalata come positiva per il micobatterio, il campione veniva decontaminato con idrossido di sodio (1%) e N-acetil-L-cisteina e quindi veniva ripetuta la MGIT. Gli isolati positivi dai terreni di coltura sono stati identificati mediante colorazione acido-resistente seguita dal test MRTBDRplus (Hain LifeScience, Hehren, Germania) per confermare la presenza di M. tuberculosis e la sensibilità alla rifampicina e all’isoniazide.

Per l’Ultra, 1,4 mL di reagente del campione sono stati aggiunti a 0,7 mL di aspirato o campione di tessuto schiacciato. I risultati sono stati segnalati come: non valido (nessun controllo interno del test rilevato); non rilevato; o rilevato (con semi-quantitazione: traccia, molto basso, basso, medio o alto) e resistenza alla rifampicina (rilevato, non rilevato o indeterminato). Il personale che eseguiva l’ULTRA era cieco ai risultati clinici e ad altri risultati microbiologici.

La revisione istologica è stata eseguita da un patologo anatomico qualificato che era cieco ai risultati dell’ULTRA e non aveva accesso alla coltura, ma avrebbe potuto vedere i risultati degli AFB al microscopio. Se sono stati identificati granulomi, il patologo ha eseguito una colorazione ZN separata e una colorazione Periodic acid-Schiff (PAS) per i funghi.

Definizione dei casi e analisi statistica

Abbiamo assegnato i partecipanti a una delle tre categorie diagnostiche sulla base delle indagini cliniche, istologiche e microbiologiche. Tubercolosi definitiva (coltura positiva su FNA/tessuto per M. tuberculosis o AFB identificati su FNA/tessuto) Tubercolosi probabile (nessun’altra diagnosi che spieghi la linfoadenopatia con una o più delle seguenti: caseazione macroscopica su FNA/tessuto o tubercolosi confermata microbiologicamente in un sito diverso dal linfonodo (per esempio polmonare) o granulomi su FNA/tessuto). La terza categoria non era la tubercolosi (non soddisfaceva i criteri delle altre due categorie). L’accuratezza diagnostica Ultra è stata anche riportata separatamente usando solo la coltura positiva come standard di riferimento.

La stima della dimensione del campione negli studi di accuratezza diagnostica dipende dalla prevalenza della malattia. Ci aspettavamo un’alta prevalenza di tubercolosi sulla base di uno studio pilota che abbiamo condotto sulla biopsia con ago centrale in pazienti HIV-positivi, il 92% dei quali aveva una linfoadenite tubercolare, ma la proporzione di pazienti con tubercolosi nel nostro studio era inferiore al previsto (40%) in una fase pilota del nostro studio. Abbiamo stimato che la sensibilità e la specificità di Ultra sarebbero entrambe intorno al 90% sulla base della meta-analisi Cochrane. Con una prevalenza del 40% di tubercolosi, una dimensione del campione di 87 è necessaria per un’ampiezza dell’IC al 95% del 10% e con sensibilità e specificità del 90%. Abbiamo gonfiato la dimensione del campione a 100 a causa delle incertezze sull’accuratezza diagnostica di Ultra.

Abbiamo calcolato sensibilità, specificità, valore predittivo negativo (NPV), valore predittivo positivo (PPV) e razioni di probabilità definendo veri o falsi positivi e veri o falsi negativi rispetto allo standard di riferimento composito di tubercolosi probabile o definita per la nostra analisi primaria. Come analisi secondaria abbiamo anche determinato l’accuratezza di Ultra utilizzando la sola coltura micobatterica come standard di riferimento. I dati sono stati inseriti in un database REDCap® e analizzati utilizzando il pacchetto software STATAv14 (StataCorp, College Station, Texas, USA). Le caratteristiche cliniche di base sono state confrontate utilizzando il test chi-quadrato o il test esatto di Fisher per le variabili categoriche e il test di Kruskal-Wallis per le variabili continue. Abbiamo contato i test non validi (cioè Ultra-errore) come risultati negativi. Questo studio è riportato in conformità con gli Standards for Reporting of Diagnostic Accuracy Studies Guidelines.