A glükózfüggőség haploid genetikai szűrése

Néhány immortalizált sejtvonal korlátozott táplálkozási rugalmasságot mutat és nagymértékben függ a glükóztól mint elsődleges szénforrástól. Megállapítottuk, hogy a humán haploid Hap1 sejtvonal túléléséhez glükózra van szükség a táptalajban. Az ilyen “glükózfüggőségben” szerepet játszó tényezők azonosítása érdekében haploid genetikai szűrést15 végeztünk olyan mutánsok izolálására, amelyek glükóz teljes hiányában is túlélnek. Véletlenszerűen mutagenizáltunk 1 × 108 Hap1 sejtet alacsony fertőzési multiplicitással egy retrovírusos géncsapda-vektorral16 , és a mutagenizált populációt 12 napig glükózhiányos tápfolyadékban tenyésztettük. Miután a sejtek többsége (>99%) elpusztult, a glükózhiánnyal szemben ellenálló sejteket visszanyertük és tápanyagban gazdag táptalajban szaporítottuk. A rezisztens populációból származó géncsapda-beillesztési helyeket inverz-PCR-alapú Illumina-szekvenálással17 azonosítottuk. A kiválasztott populációban az SLC3A2/4F2hc (399 különböző inszerció) és az xCT/SLC7A11 (39 inszerció) géneket nagy gyakorisággal bontották meg retrovírusos integrációval (1a. ábra). Figyelemre méltó, hogy e gének fehérjetermékei fizikailag kölcsönhatásba lépnek egymással, az SLC3A2 alegység nehézláncnak, az SLC7A11 alegység pedig könnyűláncnak nevezett alegységgel, és az xc- vagy xCT-antiporterként ismert aminosav-antiportert alkotják18. Az xCT antiporter egy olyan sejtfelszíni aminosavtranszporter, amely cisztinért cserébe glutamátot exportál. Ez a csere fontos a sejtek reaktív oxigénfajok (ROS) elleni védekezésben, mivel a cisztein a cisztein oxidált dimere, amely a fő antioxidáns, a glutation (GSH) szintézisének kritikus prekurzora19. Az egyértelműség kedvéért a funkcionális transzportert “rendszer xc-“-nek vagy “xCT antiporter”-nek, a könnyű láncú alegységet pedig SLC7A11-nek nevezzük.

(a) Az SLC3A2 és SLC7A11 génekben talált géncsapda-inszerciók ábrázolása glükózhiányt túlélő Hap1 sejtekben. A fekete téglalapok exonokat, a kék jelek pedig inszerciós eseményeket jelölnek. A géncsapda-beillesztések számát a nem szelektált és a szelektált populációkból a P-értékek kiszámításához egyoldalú Fisher-pontos teszttel elemeztük. (b) Az SLC3A2 és SLC7A11 szintjének Western blot analízise WT Hap1 (WT), AC6 (SLC7A11 géncsapda klón) és AC24 (SLC3A2 géncsapda klón) sejtekben. (c) A glutamát felszabadulásának kvantitatív meghatározása a közegbe. Az értékeket a WT-re normalizáltuk. Az adatok az átlagok±s.d. (n=3); **P<0,01; párosítatlan Student’s t-próba. (d,e) Reprezentatív képek (d) és a sejtek életképességének számszerűsítése (e) 24 órával a glükóz megvonása után, vivőanyaggal (DMSO) vagy 500 μM szulfaszalazinnal (SASP). Méretsáv, 200 μm. Az adatok átlagok±s.d. (n=3).

Az említett génmegszakítások sejtes következményeinek jellemzésére SLC3A2 és SLC7A11 géncsapda-beillesztéssel ellátott Hap1 klónokat izoláltunk. Az AC24-nek nevezett SLC3A2 mutáns az SLC3A2 második intronjában géncsapda-beültetéssel rendelkezik a génszakadás várható orientációjában, és nem mutat SLC3A2-expressziót. Ezenkívül lényegesen alacsonyabb az SLC7A11 expressziója, ami azért várható, mert az SLC3A2-nek az SLC7A11-gyel kell társulnia ahhoz, hogy stabil komplexet képezzen (1b. ábra). Az AC6-nak nevezett SLC7A11 mutáns az SLC7A11 első exonjának 5′ nem transzlált régiójában géncsapda-beültetéssel rendelkezik, és jelentősen csökkent SLC7A11-expressziót mutat fehérje- (1b. ábra) és mRNS-szinten (1. kiegészítő ábra). Az SLC3A2 szintje az AC6-ban nagyrészt nem változik, valószínűleg azért, mert az SLC3A2 alegység több aminosavtranszporterrel közös18. Mindkét klón alacsonyabb glutamátfelszabadulást mutat a médiumba (1c. ábra), ami megerősíti, hogy az xc- rendszer funkcionálisan megzavarodott. Fontos, hogy mindkét klón glükózhiányos körülmények között erősen javuló életképességet mutat (1d,e ábra). A 24 órás glükózmegvonás után mindkét klónban a sejtek >70%-a életképes marad, míg a szülői Hap1 sejteknek csak 10%-a marad életképes. Ezzel az eredménnyel összhangban a Hap1 sejtek szulfaszalazinnal (SASP)20 , egy rendszer xc- inhibitorral történő kezelése javította a WT Hap1 sejtek életképességét glükózmegvonás után (1d,e ábra).

A rendszer xc- szabályozza a sejtek életképességét glükózmegvonás alatt

A genetikai szűrés eredményeinek független megerősítésére rövid hajtű RNS-eket (shRNS-eket) használtunk a rendszer xc- stabil kiütésére a Hap1 sejtekben (2a. ábra). Mivel az SLC3A2 pleiotróp funkciókkal rendelkezik, mint több aminosavtranszporter közös nehézlánca18 , a knockdown erőfeszítéseinket az SLC7A11 alegységre összpontosítottuk. A két független SLC7A11 shRNS bármelyikét tartalmazó sejtek lényegesen kevesebb glutamátot bocsátottak ki a közegbe (2b. ábra). Glükózmegvonás után jelentősen javult az életképességük (2c. ábra). A proliferációs ráta azonban nem változott glükóztartalmú közegben (2a. kiegészítő ábra).

(a) Az SLC7A11 fehérjeszintjének Western blot analízise SLC7A11 knockdown Hap1 és SLC7A11-overexpresszáló HeLa sejtekben. (b) A glutamát felszabadulásának számszerűsítése a közegbe. Az adatok az átlagok±s.d. (n=4); **P<0,01; párosítatlan Student’s t-próba; scr, scrambled shRNS. (c,d) A sejtek életképessége 24 órával a glükóz megvonása után. Az SLC7A11 knockdown Hap1 sejteket (c) és az SLC7A11-overexpresszáló HeLa sejteket (d) 24 órán keresztül glükózhiányos tápfolyadékban tenyésztettük hordozóval (DMSO), 500 μM SASP-vel vagy 4 mM dm-αKG-val. Az adatok az átlagokat±s.d. jelentik. (n=3); vektor: üres vektor.

Megfordítva, arra voltunk kíváncsiak, hogy az alacsony endogén SLC7A11-gyel rendelkező sejtvonalban a rendszer xc- szintjének növelése érzékenyíti-e a sejteket a glükózmegvonásra. A Hap1 sejtekhez képest a HeLa sejtek az SLC7A11 alegység szinte kimutathatatlan szintjét expresszálták (2a. ábra), és alacsony glutamátfelszabadulást mutattak a közegbe (2b. ábra). Érdekes módon a kontroll HeLa sejtek magas életképességet mutattak a glükóz eltávolításával szemben (2d. ábra). Az SLC7A11 alegység overexpressziója a glutamátfelszabadulás nagymértékű növekedését okozta (2a,b ábra), és jelentősen megnövelte a sejtpusztulást glükózmegvonás során (2d ábra). Glükóztartalmú közegben azonban az SLC7A11-overexpresszáló HeLa sejtek proliferációs rátája nem változott a kontrollhoz képest (2a. kiegészítő ábra). Így az SLC7A11 túlterjedése elegendő a glükózfüggőség kiváltásához. Hasonló eredményeket kaptunk alacsony glükóz (szemben a fenti kísérletek glükóz nélküli) tenyésztési körülmények között is (2b. kiegészítő ábra). Ezenkívül sem az SLC7A11 knockdownja, sem az overexpressziója nem változtatta meg jelentősen a sejtek életképességét glutamin-hiány esetén (2c. kiegészítő ábra). Ezek az eredmények együttesen azt jelzik, hogy a rendszer xc-aktivitásának szintje szabályozza a sejtek glükózmegvonással szembeni érzékenységét.

Az xCT-hiány előnyeihez glutamin-anyagcserére van szükség

Glükózmegvonáskor a glutamin válik elsődleges szénforrássá, és anyagcseréje kritikus a sejtek túlélése szempontjából6,7,8. A behozott intracelluláris glutamin glutamáttá, majd α-ketoglutaráttá, a TCA-ciklus egyik intermedierjévé alakul át. Ezért feltételeztük, hogy az alacsony xc-rendszeri aktivitású sejtek jobban képesek fenntartani az intracelluláris glutamát szintjét és annak a TCA-ciklusba történő metabolizmusát. Ennek az elképzelésnek a tesztelésére közvetlenül mértük az intracelluláris glutamát szintet 1 órával a glükóz megvonása után. Az SLC7A11 knockdown sejtek (3a. ábra) és az SLC3A2 vagy SLC7A11 géncsapda mutánsok (3a. kiegészítő ábra) sokkal jobban megtartották intracelluláris glutamát szintjüket a glükóz kiürítése után, mint a kontroll sejtek. Ezzel szemben az SLC7A11-overexpresszáló HeLa sejtek intracelluláris glutamát szintje alacsonyabb volt, mint a kontroll sejteké (3b. ábra). Az xc- rendszernek a GSH szintézisében betöltött ismert szerepével összhangban az SLC7A11 kiütése csökkentette az intracelluláris GSH szintjét a Hap1 sejtekben, míg az SLC7A11-overexpresszáló HeLa sejtek magasabb GSH szintet mutattak, mint a kontroll sejtek (3b. kiegészítő ábra).

(a,b) Az intracelluláris glutamát mennyiségi meghatározása SLC7A11 knockdown Hap1 sejtekben (a) és SLC7A11-overexpresszáló HeLa sejtekben (b) glükóz eltávolítása előtt és 1 órával azt követően. Az adatok az átlagok±s.d. (n=3); **P<0,01; párosítatlan Student’s t-próba. (c) A glutamin/glutamát anyagcserében részt vevő enzimek és inhibitorok. (d,e) Hap1 sejtek életképessége 24 órával a glükóz megvonása után. A következő gyógyszereket adtuk hozzá a jelzetteknek megfelelően: 0,5 mM AOA, 50 μM EGCG, 10 μM BPTES vagy 4 mM dm-αKG. Az adatok átlagok±s.d. (n=3). (f) Oxigénfogyasztás glükózhiányos körülmények között. A sejteket 3 órán keresztül glükózhiányos közegben (1 mM glutamin) inkubáltuk, majd megmértük az OCR-t. Az adatok az átlagok±s.d. (n=4); *P<0,05. **P<0,01; párosítatlan Student’s t-próba. (g) A TCA intermedierek izotópjelölési mintázata. A sejteket 8 órán át inkubáltuk U-13C5-glutamint tartalmazó glükózmentes közegben a metabolitok kivonása előtt. Az adatok átlagok±s.d. (n=3).

A következő kérdésünk az volt, hogy a glutamin/glutamát anyagcsere fontos-e a rendszer xc–hiányos sejtjeinek fokozott túlélésében glükózmegvonás során. Három vegyületet , aminooxi-acetátot (AOA, aminotranszferáz inhibitor) és epigallokatechin-gallátot (EGCG, glutamát-dehidrogenáz inhibitor)21 vizsgáltunk, amelyek gátolják a glutamin glutamáttá, majd α-ketoglutaráttá történő átalakításában részt vevő enzimeket (3c. ábra). EGCG-vel történő kezelés hatására az SLC7A11 (3d. ábra; 3c. kiegészítő ábra) vagy SLC3A2 (3c. kiegészítő ábra) tekintetében megzavart Hap1 sejtek már nem mutatnak megnövekedett életképességet glükózmegvonás alatt, ami arra utal, hogy a glutamát-dehidrogenáz (GDH) kritikus a hatás szempontjából. Mivel a GDH a glutamátot α-ketoglutaráttá alakítja, megkérdeztük, hogy az α-ketoglutarát képes-e visszafordítani az EGCG gátló hatását. Valóban, az EGCG gátló hatását teljes mértékben megmentette az α-ketoglutarát sejtáteresztő formájának, a dimetil α-ketoglutarátnak (dm-αKG) a kiegészítése (3e. ábra; 3d. kiegészítő ábra). Továbbá, a dm-αKG kiegészítése a glükózmegvonás során jelentősen javította a sejtek életképességét a vad típusú (WT) és a kontroll shRNS Hap1 sejtekben (3e. ábra; 3d. kiegészítő ábra) és az SLC7A11-overexpresszáló HeLa sejtekben (2d. ábra), míg a glutamin további kiegészítése a közegbe nem javította jelentősen a sejtek életképességét (3e. kiegészítő ábra). Ezek az eredmények tehát arra utalnak, hogy a glutamát α-ketoglutaráttá történő átalakulása áll az xc-rendszer megszakításának védőhatása mögött glükózhiányos körülmények között. A BPTES vagy az AOA hatásának hiánya arra utal, hogy a Hap1 sejtekben nem a GLS1 az elsődleges glutamináz, és hogy nem az aminotranszferáz, hanem a GDH fontos a glutamát α-ketoglutaráttá történő átalakításában.

Glükóz hiányában a mitokondriális OXPHOS (mint az ATP-szintézis fő forrása) nélkülözhetetlenné válik a túléléshez. Az anaplerózis révén a glutaminból származó α-ketoglutarát pótolja a TCA-ciklus intermedierjeit, amely szubsztrátokat generál az OXPHOS21 működtetéséhez. Ezért megvizsgáltuk, hogy a rendszer xc- szintjei szabályozhatják-e a mitokondriális légzést. Glükóz jelenlétében az SLC7A11 knockdown Hap1 vagy overexpresszáló HeLa sejtek oxigénfogyasztási sebessége (OCR) összehasonlítható a kontroll sejtekével (3f. kiegészítő ábra). Az SLC7A11 knockdown sejtek azonban 3 órás glükózmegvonás után magasabb mitokondriális légzést mutatnak, míg az SLC7A11-overexpresszáló HeLa sejtek OCR értéke alacsonyabb, mint a kontroll sejteké glükózmegvonás esetén (3f. ábra).

Újabb munkák szerint az elfogyasztott glutaminból keletkező α-ketoglutarát oxidatív metabolizmuson mehet keresztül az “előremenő”, óramutató járásával megegyező irányú TCA-cikluson keresztül vagy reduktív karboxiláción keresztül egy “fordított”, az óramutató járásával ellentétes irányú TCA-reakción keresztül22,23,24. Az előremenő és a fordított TCA-cikluson keresztüli relatív fluxus meghatározható az extracelluláris glutamin stabil 13C-izotópos jelölésével (C5) és a TCA-ciklus köztitermékeibe való beépülés mérésével22,23,25 . Annak meghatározására, hogy az xc- rendszer modulációja megváltoztatja-e az előremenő versus fordított TCA-ciklus fluxust, SLC7A11 knockdown Hap1 vagy overexpresszáló HeLa sejteket tenyésztettünk glükóz hiányában és U-13C5-glutaminnal (lásd Módszerek). Az extracelluláris U-13C5-glutaminnak való kitettség az intracelluláris glutamin és glutamát közel teljes (M+5) jelölését eredményezte (3g. kiegészítő ábra). A jelzett glutamát a TCA-ba α-ketoglutaráttá történő anaplerotikus reakción keresztül jutott be, a TCA előremenő intermedierjeinek, a szukcinátnak, a fumarátnak, a malátnak és a citrátnak az M+4-es jelölésével (3g. ábra). A citrát (reduktív TCA-termék) M+5 jelölése sokkal kisebb mértékben volt megfigyelhető (∼8:1 M+4:M+5 citrát), ami alacsony fordított TCA-áramlásra utal. Fontos, hogy az SLC7A11 kiütése vagy túlexpressziója nem változtatta meg a forward versus reverse fluxus relatív mértékét.

xCT szabályozza az emlőráksejtek glükózfüggőségét

Az xc- rendszer glutamin-anyagcserére és légzésre gyakorolt negatív hatásával kapcsolatos megfigyeléseink kiterjesztése érdekében elemeztük a Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) projekt26 947 rákos sejtvonalának génexpressziós adatait. Minden egyes ráktípus esetében 15-20 rákos sejtvonalat kategorizáltunk magas és alacsony SLC7A11 expressziójúak közé, és génkészlet-gazdagodási elemzést végeztünk e két csoport között. Azt találtuk, hogy az OXPHOS-szal kapcsolatos gének feldúsultak az alacsony SLC7A11-expresszáló csoportokban, különösen a tüdőrák (P-érték=0,018) és az emlőrák sejtvonalakban (P-érték=0,039). Ezenkívül 59 emlőráksejt elemzése kifejezett és szelektív negatív korrelációt mutatott az SLC7A11 és a mitokondriális OXPHOS gének expressziója között (4a,b. kiegészítő ábra). Ez a megfigyelés arra utal, hogy a legtöbb alacsony SLC7A11-expressziójú emlőráksejt expressziós profilja összhangban van az OXPHOS-gépezet felszabályozásával, és fordítva.

Két emlőráksejtvonalat, a Hs578T-t és az SK-BR-3-at választottuk a magas és alacsony SLC7A11-expressziójú sejtvonalak reprezentatívjaként (4a. kiegészítő ábra). A CCLE-expressziós adatokkal összhangban a Hs578T sejtek magas SLC7A11-expressziós szintet és aktív glutamátfelszabadulást mutattak a közegbe, míg az SK-BR-3 sejtek alacsony SLC7A11-expressziót és nem kimutatható glutamátfelszabadulást mutattak (4a. ábra; 5a. kiegészítő ábra). A Hs578T és SK-BR-3 sejtek metabolikus állapotát is meghatároztuk az OCR és a glikolízis aktivitásának mérésével (extracelluláris savasodási ráta (ECAR)). A Hs578T sejtek alacsonyabb OCR-t és alacsonyabb OCR/ECAR arányt mutattak, mint az SK-BR-3 (4b,c ábra), ami arra utal, hogy a Hs578T sejtek jobban függnek a glikolízistől, mint az SK-BR-3 sejtek. A legtöbb Hs578T sejt a Hap1 sejtekhez hasonlóan elpusztult glükózmegvonásra (4d. ábra), míg az SK-BR-3 sejtek ellenállóak voltak (4e. ábra). Az SLC7A11 szempontjából depletált Hs578T sejtek csökkent glutamátfelszabadulást mutattak a közegbe (5a. kiegészítő ábra), és hatékonyabban tartották fenn az intracelluláris glutamátszintet glükózmegvonás alatt (5b. kiegészítő ábra). Fontos, hogy az SLC7A11 kiütése jelentősen javította a Hs578T sejtek életképességét glükózmegvonás alatt (4d. ábra). Ugyanakkor az SLC7A11-et nélkülöző Hs578T sejtekben magasabb volt a sejtek ROS-szintje, mint a kontroll sejtekben, ami összhangban van az antioxidáns védelemben betöltött szerepével (5c. kiegészítő ábra). Ezzel szemben az SLC7A11-et túlexpresszáló sejtek ROS-szintje alacsonyabb volt (5c. kiegészítő ábra). Az SLC7A11 knockdown Hs578T sejtek túlélését glükózmegvonás során az EGCG és a BPTES megszüntette, ami ismét arra utal, hogy az α-ketoglutarát glutamátból történő termelése kritikus (4d. ábra). A várakozásoknak megfelelően az EGCG vagy a BPTES kezelés káros hatásait a dm-αKG kiegészítés teljesen visszafordította (4d. ábra). A BPTES eltérő hatása (hasonlítsuk össze a 4d. ábrát a 3d. ábrával) arra utal, hogy a GLS1 az elsődleges glutamináz a Hs578T sejtekben, de nem a Hap1 sejtekben.

(a) SLC7A11 fehérjeszintek SLC7A11-knockdown Hs578T és SLC7A11-overexpresszáló SK-BR-3 sejtekben. (b,c) Metabolikus állapot glükózzal teli körülmények között. Az OCR (b) és az OCR/ECAR arány (c) mérése 10 mM glükóz+2 mM glutamin jelenlétében történt. Az adatok átlagok±s.d. (n=3). (d,e) A sejtek életképessége 24 órával a glükóz megvonása után. Az SLC7A11 knockdown Hs578T (d) és SLC7A11-overexpresszáló SK-BR-3 sejteket (e) 24 órán keresztül glükózhiányos tápfolyadékban tenyésztettük. A következő gyógyszereket adtuk a jelzetteknek megfelelően: 500 μM SASP, 0,5 mM AOA, 50 μM EGCG, 10 μM BPTES vagy 4 mM dm-αKG. Az adatok az átlagok±s.d. (n=3).

Az SLC7A11 túltermelése SK-BR-3 sejtekben növelte a glutamát felszabadulását (5a. kiegészítő ábra), és ezzel párhuzamosan csökkentette az intracelluláris glutamát fenntartásának képességét glükózhiányos körülmények között (5b. kiegészítő ábra). Az SLC7A11 túlterjedése jelentős SK-BR-3 sejthalált okozott glükózmegvonás után. A sejthalált dm-αKG hozzáadása megmentette, ami arra utal, hogy az SLC7A11 túlterjedése glükózhiányos körülmények között az α-ketoglutarát hiányához vezet (4e. ábra).

Hs578T sejtek SLC7A11 knockdown-nal képesek voltak hosszabb ideig fenntartani a légzési aktivitásukat glükózmegvonás után (5d. kiegészítő ábra). Ezzel szemben az SLC7A11-et túlreprezentáló SK-BR-3 sejtek ugyanezen rezsim alatt az OCR meredek csökkenését mutatták. Összességében ezek az eredmények arra utalnak, hogy az emlőráksejtekben az xc- rendszer szabályozza az intracelluláris glutamát fluxust a TCA-ciklusba, és növeli a glükózmegvonással szembeni érzékenységet.

A Nrf2 az SLC7A11

A Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-like 2, NFE2L2) egy kulcsfontosságú transzkripciós faktor, amely számos, az oxidatív stresszben részt vevő citoprotektív gént szabályoz felfelé27. Mivel az SLC7A11 az Nrf2 egyik ismert célgénje (hivatkozás 27), megvizsgáltuk az Nrf2 és az SLC7A11 expressziójának összefüggését rákos sejtekben. Az Nrf2 expresszió pozitívan korrelál az SLC7A11 expressziójával 59 emlőrákos sejtvonalon (R=0,5688), valamint a CCLE expressziós adataiban szereplő mind a 947 rákos sejtvonalon (R=0,4306). Ezenkívül az Nrf2 célgén expressziója magas korrelációt mutat az SLC7A11 expressziójával 947 rákos sejtvonalon keresztül. Az SLC7A11 és az NRF2 célgének közötti korrelációs együttható (R) a következő: NQO1 (+0,4179), GCLC (+0,3283), GCLM (+0,3944) és TXNRD1 (+0,4321).

Ezek a korrelációk arra utalnak, hogy az Nrf2 támogatja az SLC7A11 expresszióját a rákos sejtek egy alcsoportjában. Ennek az elképzelésnek a tesztelésére az Nrf2-t leütöttük Hs578T és MDA-MB-231 emlőráksejtekben, amelyek az SLC7A11 két magas expresszorát képezik. Az Nrf2 kiütése az SLC7A11 expressziójának jelentős csökkenését okozta (5a,b,e ábra) és csökkentette a glutamát felszabadulását (5c,f ábra). Fontos, hogy az Nrf2-csökkentett sejtek jelentősen javult életképességet mutattak glükózmegvonás során (5d,g ábra). Ez a változás az életképességben ismét a glutamát-anyagcserétől függ, mivel az EGCG-vel való kezelés megszüntette az Nrf2 lekapcsolásának túlélést elősegítő hatását (5d. ábra). Ezenkívül az α-ketoglutarát kiegészítés elegendő volt a sejtek túlélésének elősegítéséhez, még EGCG jelenlétében is.

(a) Western blot az SLC7A11 fehérjeszintjéről Nrf2 és SLC7A11 knockdown Hs578T sejtekben. (b) Az Nrf2 és SLC7A11 mRNS szintjének valós idejű RT-PCR analízise Nrf2 és SLC7A11 knockdown MDA-MB-231 sejtekben. A méréseket a 18 s rRNS-szintekre normalizáltuk. Az adatok az átlagok±s.d. (n=3); **P<0,01, párosítatlan Student’s t-próba. (c,d) Nrf2 és SLC7A11 knockdown Hs578T sejtek elemzése. (c) Glutamát felszabadulása a közegbe. Az adatok az átlagok±s.d. (n=3); **P<0,01; párosítatlan Student’s t-próba. (d) A sejtek életképessége 24 órával a glükóz megvonása után. EGCG-t (50 μM) és dm-αKG-t (4 mM) adtunk a jelzett módon. Az adatok átlagok±s.d. (n=4). (e-g) Az MDA-MB-231 sejteket 24 órán át kezeltük hordozóval (DMSO) vagy 15 μM DMF-fel glükózzal dúsított közegben. További manipulációk közé tartozott az SLC7A11 vagy az Nrf2 kiütése, valamint az SLC7A11 túlterjedése. (e) Western blot az SLC7A11 szintjéről DMF-kezelés hatására. (f) Glutamát felszabadulása a médiumba. A DMF-előkezelést követően a sejteket DMF nélküli friss glükózhiányos tápfolyadékban inkubáltuk, és a tápfolyadékba felszabaduló glutamátot 2 óra múlva mértük. Az adatok az átlagok±s.d. (n=4). (g) A sejtek életképessége 24 órával a glükózhiány után. A DMF-előkezelést követően a sejteket DMF nélküli friss glükózhiányos közegben inkubáltuk további 24 órán keresztül a sejtek életképességének mérése előtt. Az adatok átlagok±s.d. (n=4); NT, kezelés nélkül.

Az Nrf2-reguláció hatásának vizsgálatához a sejteket dimetilfumaráttal (DMF), egy sejtáteresztő Nrf2-aktivátorral28 kezeltük. A DMF-kezelés hatására az MDA-MB-231 sejtek nagymértékben indukálták az SLC7A11 expresszióját és a glutamát felszabadulását (5e,f ábra). Ezenkívül a DMF-fel előkezelt sejtek a kontrollsejtekhez képest jelentősen csökkent életképességet mutattak glükózhiányos kezelés során (5g. ábra). Kizártuk az off-target hatásokat azzal, hogy kimutattuk, hogy a DMF-kezelés ezen eredményei mind az SLC7A11-től, mind az Nrf2-től függenek (5f,g ábra). Ezek az eredmények együttesen azt jelzik, hogy az Nrf2-SLC7A11 tengely szabályozza a glutamát-anyagcserét, a rákos sejtek glükózfüggőségét és a glutamin alternatív szénforrásként való hasznosításának képességét. Fontos, hogy ez arra utal, hogy a rákos sejtek oxidatív stresszhez való alkalmazkodása veszélyeztetheti a tápanyagrugalmasságot, különösen a glükózfüggőség fenotípusának fokozásán keresztül.

xCT szabályozza a mitokondriális működést mtDNS-mutáns sejtekben

A fenti eredményeink arra utalnak, hogy az oxidatív stressz miatt xc-rendszeri upregulációval rendelkező sejtek tápanyagrugalmassága korlátozott lehet a glutamin-anyagcsere károsodása miatt. A mitokondriális légzési lánc gátlása növelheti a reaktív oxigén specieseket29,30. Azt találtuk, hogy az SLC7A11 expresszióját a mitokondriális működést gátló gyógyszerek indukálják, különösen a rotenon és az oligomicin, amelyek gátolják az OXPHOS-gépezet I. (NADH-dehidrogenáz) és V. (ATP-szintáz) komplexét (6a. kiegészítő ábra). E farmakológiai eredményekkel összhangban az SLC7A11 felszabályozódott olyan hibrid sejtekben, amelyek homoplazmatikus mtDNS-mutációkat tartalmaztak az I. komplex ND1 alegységében vagy az V. komplex ATP6 alegységében (NARP) (6a. ábra)30,31. Az SLC7A11 indukciója különösen kifejezett volt a NARP sejtvonalban, amelyről beszámoltak, hogy magas ROS-szintet és a mitokondriális ROS-mentő enzim, az MnSOD30 indukcióját mutatja. Az SLC7A11 indukciója a NARP hibrid sejtekben nagymértékben függött az Nrf2 és Atf4 transzkripciós faktoroktól (6b. kiegészítő ábra), és elnyomható volt az antioxidáns N-acetilciszteinnel történő kezeléssel (6c. kiegészítő ábra).

(a) Western blot az SLC7A11 szintjéről 143B és izogén mtDNS-mutáns ND1 és NARP sejtekben. (b-e) 10 mM galaktóz és 2 mM glutamin jelenlétében tenyésztett SLC7A11 knockdown vagy erasztin (Era) kezelt (5 μM) ND1 és NARP sejtek elemzése. (b) Az intracelluláris glutamát mennyiségi meghatározása 24 órával a galaktózkultúra után. Az adatok az átlagok±s.d. (n=4); ** P<0,01; párosítatlan Student’s t-próba. (c) A sejtek életképessége galaktózközegben 3 napig. Az adatok az átlagok±s.d. (n=4). (d) Reprezentatív képek és a mitokondriumok morfológiájának számszerűsítése 24 órával a galaktózkultúra után. Az adatok az átlagok±s.d. (n=3). Méretsáv, 10 μm. (e) Az oxigénfogyasztás meghatározása 24 órával a galaktózkultúra után. Az adatok az átlagok±s.d. (n=5); **P<0,01; párosítatlan Student’s t-próba. (f) Az xCT antiporter kettős hatásának modellje. Az xCT antiporter a glutamin metabolizmust a TCA-ciklusból a GSH szintézisbe tereli, ami fontos az antioxidáns funkció szempontjából. Bizonyos sejtkörülmények között a glutamin túlzott eltérítése a TCA-ciklusból káros (középső panel), ezért az antiporter gátlása javítja a túlélést (jobb oldali panel).

Vizsgáltuk, hogy a rendszer xc- expressziójának e kompenzációs változásai befolyásolják-e a sejtanyagcserét a cibrid sejtekben. Az SLC7A11 magasabb expressziójával összhangban az ND1 és NARP cibrideknél alacsonyabb volt az intracelluláris glutamát szintje (6b. ábra). Az xc- rendszer gátlása az SLC7A11 kiütésével vagy egy erős inhibitorral, az erastinnal, növelte az intracelluláris glutamátot az ND1 és NARP sejtekben. Hasonlóképpen az intracelluláris α-ketoglutarátot, a glutamát-metabolizmus egyik termékét is növelte az SLC7A11 gátlása (6d. kiegészítő ábra). Régóta ismert, hogy az OXPHOS-hibás sejtek rosszul élnek túl galaktóz-tartalmú közegben, ami nagyobb igényt támaszt az OXPHOS-ra mint az ATP-termelés forrására32. Az ND1 és NARP-mutáns cikridek, ellentétben az izogén WT 143B sejtekkel, nem voltak képesek galaktóztartalmú közegben túlélni (6c. ábra; 6e. kiegészítő ábra). Az SLC7A11 kiütése vagy az erasztin kezelése azonban erősen megmentette az ND1 és NARP cikridek életképességét galaktózos közegben. A hatás a NARP-cikrideknél volt a legmarkánsabb, amelyeknél az SLC7A11 sokkal nagyobb mértékű indukciót mutatott (6c. ábra).

A sejtek életképességének ez a növekedése a mitokondriális morfológia feltűnő normalizálódásával korrelált. Csoportunk korábban arról számolt be, hogy a WT sejtek megnyújtják mitokondriumaikat olyan közegkörülmények között, amelyek fokozott OXPHOS-aktivitást igényelnek, míg az mtDNS-mutációval rendelkező sejtek ehelyett fragmentálják mitokondriumaikat33. Ezzel az eredménnyel összhangban az ND1 és NARP cikridek 24 órás galaktózos tenyésztés után kifejezett mitokondriális fragmentációt mutattak. Ezzel szemben az SLC7A11 kiütéssel vagy erasztin kezeléssel kezelt cikridek a mitokondriumok jelentős megnyúlását mutatták, amikor a közeg szénforrását glükózról galaktózra váltottuk (6d. ábra; 6f. kiegészítő ábra). Az SLC7A11 knockdown nem változtatta meg több mitokondriális dinamikai fehérje, köztük az Opa1, az Mfn1 és a Drp1 szintjét (6g. kiegészítő ábra). Továbbá az SLC7A11 knockdown sejtek magasabb légzési aktivitást mutattak, mint a kontroll-mutáns sejtek (6e. ábra). Összességében ezek az eredmények arra utalnak, hogy az xc- rendszer gátlása az mtDNS-mutáns cibridekben javítja a mitokondriális morfológiát és a légzést, ami jelentősen javítja a túlélést galaktózos közegben.