Articles

Glutamat/cystin xCT-antiporter antagoniserar glutaminmetabolismen och minskar näringsflexibiliteten

april 29, 2021 by admin

En haploid genetisk screening för glukosberoende

Många odödliga cellinjer uppvisar begränsad näringsflexibilitet och är starkt beroende av glukos som primär kolkälla. Vi fann att överlevnad av den humana haploida cellinjen Hap1 kräver glukos i odlingsmediet. För att identifiera faktorer som är involverade i ett sådant ”glukosberoende” utförde vi en haploid genetisk screening15 för att isolera mutanter som överlever i fullständig avsaknad av glukos. Vi mutade slumpmässigt 1 × 108 Hap1-celler med låg infektionsmultiplicitet med en retroviral genfälla-vektor16 och odlade den mutageniserade populationen i glukosfattigt medium i 12 dagar. Efter att majoriteten (>99 %) av cellerna hade dött återfanns celler som var resistenta mot glukosbrist och expanderades i näringsrikt medium. Insättningsställen med genfälla från den resistenta populationen identifierades med hjälp av invers-PCR-baserad Illumina-sekvensering17. I den utvalda populationen stördes generna SLC3A2/4F2hc (399 distinkta inlagringar) och xCT/SLC7A11 (39 inlagringar) med hög frekvens genom retroviral integration (fig. 1a). Det är anmärkningsvärt att proteinprodukterna från dessa gener är kända för att fysiskt interagera, där SLC3A2-underenheten kallas den tunga kedjan och SLC7A11-underenheten kallas den lätta kedjan, för att bilda den aminosyraantiporter som är känd som system xc- eller xCT-antiporter18. xCT-antiportern är en aminosyratransportör på cellytan som exporterar glutamat i utbyte mot cystin. Detta utbyte är viktigt för försvaret mot cellulära reaktiva syrearter (ROS), eftersom cystin är den oxiderade dimeren av cystein, en kritisk prekursor för syntesen av glutation (GSH), en viktig antioxidant19. För tydlighetens skull hänvisar vi till den funktionella transportören som ”system xc-” eller ”xCT-antiporter” och den lätta kedjans underenhet som SLC7A11.

Figur 1: Identifiering av SLC3A2 eller SLC7A11 som faktorer som begränsar cellens livsduglighet under glukosbristförhållanden.

För att karaktärisera de cellulära konsekvenserna av dessa genstörningar isolerade vi Hap1-kloner med SLC3A2- och SLC7A11-genfällainsatser. SLC3A2-mutanten, som kallas AC24, har en genfälla i det andra intronet av SLC3A2 i den förväntade riktningen för genavbrott och visar inget SLC3A2-uttryck. Dessutom har den ett betydligt lägre SLC7A11-uttryck, vilket är förväntat eftersom SLC3A2 måste associeras med SLC7A11 för att bilda ett stabilt komplex (fig. 1b). SLC7A11-mutanten, som kallas AC6, har en genfälla i den 5′ otranslaterade delen av det första exonet av SLC7A11 och visar ett kraftigt minskat SLC7A11-uttryck på protein- (fig. 1b) och mRNA-nivå (kompletterande fig. 1). SLC3A2-nivåerna är i stort sett opåverkade i AC6, troligen på grund av att SLC3A2-underenheten delas av flera aminosyretransportörer18. Båda klonerna visar lägre glutamatfrisättning i media (fig. 1c), vilket bekräftar att systemet xc- är funktionellt stört. Viktigt är att båda klonerna visar kraftigt förbättrad livskraft under glukosfattiga förhållanden (fig. 1d,e). Efter 24 timmars glukosbrist förblir >70 % av cellerna i båda klonerna livskraftiga, medan endast 10 % av föräldracellerna i Hap1 överlever. I överensstämmelse med detta resultat förbättrade behandling av Hap1-celler med sulfasalazin (SASP)20, en xc-hämmare i systemet, livsdugligheten hos WT Hap1-celler efter glukosuttag (fig. 1d,e).

System xc- reglerar cellens livskraft under glukosuttag

För att oberoende bekräfta resultaten av den genetiska screeningen använde vi korta hårnåls-RNA (shRNA) för att stabilt slå ned system xc- i Hap1-celler (fig. 2a). Eftersom SLC3A2 har pleiotropa funktioner som den gemensamma tunga kedjan för flera aminosyretransportörer18 fokuserade vi våra knockdown-försök på SLC7A11-underenheten. Celler som innehöll något av två oberoende SLC7A11 shRNA:er släppte ut betydligt mindre glutamat i mediet (fig. 2b). De uppvisade kraftigt förbättrad livsduglighet efter glukosuttag (fig. 2c). Det fanns dock ingen förändring av spridningshastigheten i glukosinnehållande medier (kompletterande figur 2a).

Figur 2: System xc- påverkar negativt Hap1- och HeLa-cellernas livskraft efter glukosuttag.

Vi undrade omvänt om en ökning av nivån av system xc- i en cellinje med låg endogen SLC7A11 skulle göra cellerna känsliga för glukosuttag. Jämfört med Hap1-celler uttryckte HeLa-celler nästan odetekterbara nivåer av SLC7A11-underenheten (fig. 2a) och uppvisade låg glutamatfrisättning i mediet (fig. 2b). Intressant nog uppvisade kontroll HeLa-celler hög livsduglighet vid avlägsnande av glukos (fig. 2d). Övexpression av SLC7A11-underenheten orsakade en stor ökning av glutamatfrisättningen (fig. 2a,b) och kraftigt ökad celldöd vid glukosutarmning (fig. 2d). I glukosinnehållande medier fanns det dock ingen förändring i proliferationshastigheten hos SLC7A11-överuttryckande HeLa-celler jämfört med kontrollen (kompletterande fig. 2a). Överexpression av SLC7A11 är således tillräcklig för att framkalla glukosberoende. Liknande resultat erhölls med hjälp av odlingsförhållanden med låg glukoshalt (jämfört med ingen glukos i experimenten ovan) (kompletterande figur 2b). Dessutom förändrade varken knockdown eller överexpression av SLC7A11 signifikant cellens livskraft vid utarmning av glutamin (kompletterande figur 2c). Sammantaget tyder dessa resultat på att nivån på systemets xc-aktivitet kontrollerar cellernas känslighet för glukosuttag.

Fördelarna med xCT-depletion kräver glutaminmetabolism

När glukosuttaget upphör blir glutamin den primära kolkällan och dess metabolism är kritisk för cellens överlevnad6,7,8. Efter import omvandlas intracellulärt glutamin till glutamat och vidare till α-ketoglutarat, en intermediär i TCA-cykeln. Därför spekulerade vi i att celler med låg xc-aktivitet i systemet kan ha bättre förmåga att upprätthålla intracellulära glutamatnivåer och dess metabolism i TCA-cykeln. För att testa denna idé mätte vi direkt de intracellulära glutamatnivåerna 1 timme efter glukosuttag. SLC7A11 knockdown-celler (fig. 3a) och SLC3A2- eller SLC7A11-genfälla-mutanter (kompletterande fig. 3a) bibehöll sin intracellulära glutamatnivå efter glukosuttag mycket bättre än kontrollceller. Omvänt hade SLC7A11-överuttryckande HeLa-celler lägre nivåer av intracellulärt glutamat än kontrollceller (fig. 3b). I överensstämmelse med den kända rollen för system xc- för GSH-syntesen minskade SLC7A11 knockdown nivån av intracellulärt GSH i Hap1-celler, medan SLC7A11-överuttryckande HeLa-celler uppvisade högre GSH-nivåer än kontrollceller (kompletterande fig. 3b).

Figur 3: De proöverlevnadsfrämjande effekterna av SLC7A11-nedbrytning kräver glutaminmetabolism.

Vi frågade oss därefter om glutamin/glutamatmetabolismen är viktig för den förbättrade cellöverlevnaden hos system xc–deficienta celler under glukosuttag. Vi testade tre föreningar , aminooxyacetat (AOA, aminotransferashämmare) och epigallocatechin gallat (EGCG, glutamatdehydrogenashämmare)21 som hämmar enzymer som är involverade i omvandlingen av glutamin till glutamat och sedan α-ketoglutarat (fig. 3c). Vid behandling med EGCG uppvisar Hap1-celler som är störda för SLC7A11 (fig. 3d; kompletterande fig. 3c) eller SLC3A2 (kompletterande fig. 3c) inte längre någon ökad livsduglighet under glukosbrist, vilket tyder på att glutamatdehydrogenas (GDH) är avgörande för effekten. Eftersom GDH omvandlar glutamat till α-ketoglutarat frågade vi om α-ketoglutarat skulle kunna vända den hämmande effekten av EGCG. Den hämmande effekten av EGCG räddades faktiskt helt och hållet genom tillskott av dimetyl α-ketoglutarat (dm-αKG), en cellpermeabel form av α-ketoglutarat, (fig. 3e; kompletterande fig. 3d). Dessutom förbättrade dm-αKG-tillskott under glukosuttag kraftigt cellviabiliteten i Hap1-celler av vildtyp (WT) och kontroll shRNA (fig. 3e; kompletterande fig. 3d) och SLC7A11-överuttryckande HeLa-celler (fig. 2d), medan ytterligare tillskott av glutamin i mediet inte förbättrade cellviabiliteten nämnvärt (kompletterande fig. 3e). Dessa resultat tyder därför på att omvandling av glutamat till α-ketoglutarat ligger till grund för den skyddande effekten av systemets xc-avbrott under glukosfattiga förhållanden. Avsaknaden av effekt av BPTES eller AOA tyder på att GLS1 inte är det primära glutaminaset i Hap1-celler och att GDH, snarare än aminotransferas, är viktigt för omvandlingen av glutamat till α-ketoglutarat.

I avsaknad av glukos blir mitokondriell OXPHOS (som den viktigaste källan till ATP-syntesen) nödvändig för överlevnad. Genom anaplerosering fyller glutaminderivat α-ketoglutarat på intermediärer i TCA-cykeln, som genererar substrat för att driva OXPHOS21. Vi testade därför om nivåerna av systemet xc- kan reglera mitokondriell respiration. I närvaro av glukos är syreförbrukningshastigheten (OCR) hos SLC7A11 knockdown Hap1 eller överuttryckande HeLa-celler jämförbar med kontrollceller (kompletterande figur 3f). SLC7A11 knockdown-celler uppvisar dock högre mitokondriell respiration efter 3 timmars glukosuttag, medan OCR för SLC7A11-överuttryckande HeLa-celler är lägre än för kontrollceller under glukosuttag (fig. 3f).

Nyare arbeten har visat att α-ketoglutarat som genereras från förbrukat glutamin kan genomgå oxidativ metabolism via den ”framåtriktade” TCA-cykeln medurs eller reduktiv karboxylering via en ”omvänd” TCA-reaktion moturs medurs22,23,24. Det relativa flödet genom den främre respektive omvända TCA-cykeln kan bestämmas med hjälp av stabil 13C-isotopmärkning (C5) av extracellulärt glutamin och mätning av märkningens inkorporering i intermediärer i TCA-cykeln22,23,25. För att fastställa om modulering av systemet xc- förändrar flödet i den främre respektive omvända TCA-cykeln odlades SLC7A11-nedslagna Hap1- eller överuttryckande HeLa-celler i frånvaro av glukos och med U-13C5-glutamin (se Metoder). Exponering för extracellulärt U-13C5-glutamin resulterade i nästan fullständig märkning (M+5) av intracellulärt glutamin och glutamat (kompletterande figur 3g). Märkt glutamat gick in i TCA via en anaplerotisk reaktion till α-ketoglutarat med M+4-märkning av de framåtsyftande TCA-intermediaterna succinat, fumarat, malat och citrat (fig. 3g). M+5-märkningen av citrat (reducerande TCA-produkt) observerades i mycket mindre utsträckning (∼8:1 M+4:M+5 citrat), vilket tyder på ett lågt omvänt TCA-flöde. Viktigt är att den relativa graden av framåt- kontra bakåtriktat flöde var oförändrad med antingen knockdown eller överexpression av SLC7A11.

xCT reglerar bröstcancercellers beroende av glukos

För att utvidga våra observationer om den negativa effekten av systemet xc- på glutaminmetabolism och andning analyserade vi genuttrycksdata för 947 cancercellinjer från Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)-projektet26. För varje cancertyp kategoriserade vi 15-20 cancercellinjer som högt och lågt SLC7A11-uttryck och utförde en analys av anrikning av genuppsättningar mellan dessa två grupper. Vi fann att gener relaterade till OXPHOS var anrikade i de grupper med lågt SLC7A11-uttryck, särskilt i cellinjer för lungcancer (P-värde = 0,018) och bröstcancer (P-värde = 0,039). Dessutom visade analysen av 59 bröstcancerceller en tydlig och selektiv negativ korrelation mellan uttrycket av SLC7A11 och mitokondriella OXPHOS-gener (Supplementary Fig. 4a,b). Denna observation tyder på att de flesta bröstcancerceller med lågt SLC7A11-uttryck har en uttrycksprofil som är förenlig med uppreglering av OXPHOS-maskineriet, och vice versa.

Vi valde två bröstcancercellinjer, Hs578T och SK-BR-3, som representativa för cellinjer med högt respektive lågt SLC7A11-uttryck (kompletterande fig. 4a). I överensstämmelse med CCLE-uttrycksdata visade Hs578T-cellerna en hög uttrycksnivå av SLC7A11 och aktiv frisättning av glutamat i mediet, medan SK-BR-3-cellerna visade lågt SLC7A11-uttryck och ingen påvisbar frisättning av glutamat (fig. 4a; kompletterande fig. 5a). Vi bestämde också den metaboliska statusen hos Hs578T- och SK-BR-3-celler genom att mäta aktiviteterna för OCR och glykolys (extracellulär acidifieringshastighet (ECAR)). Hs578T-celler uppvisade lägre OCR och ett lägre OCR/ECAR-förhållande än SK-BR-3 (fig. 4b,c), vilket tyder på att Hs578T-celler är mer beroende av glykolys än SK-BR-3. De flesta Hs578T-celler, liksom Hap1-celler, dog vid glukosuttag (fig. 4d), medan SK-BR-3-cellerna var motståndskraftiga (fig. 4e). Hs578T-celler som är utarmade på SLC7A11 uppvisade minskad glutamatfrisättning i mediet (kompletterande figur 5a) och upprätthöll effektivare intracellulära glutamatnivåer vid glukosutarmning (kompletterande figur 5b). Det är viktigt att SLC7A11 knockdown kraftigt förbättrade Hs578T-cellernas livskraft under glukosuttag (fig. 4d). Hs578T-celler som saknar SLC7A11 hade dock högre cellulära ROS-nivåer än kontrollcellerna, vilket överensstämmer med dess roll i det antioxidativa försvaret (kompletterande fig. 5c). Omvänt hade celler som överuttrycker SLC7A11 lägre ROS-nivåer (kompletterande figur 5c). Överlevnaden hos SLC7A11 knockdown Hs578T-celler under glukosuttag upphävdes av EGCG och BPTES, vilket återigen antyder att produktionen av α-ketoglutarat från glutamat är kritisk (fig. 4d). Som förväntat upphävdes de skadliga effekterna av EGCG- eller BPTES-behandling helt och hållet av dm-αKG-tillskott (fig. 4d). Den differentierade effekten av BPTES (jämför fig. 4d med fig. 3d) innebär att GLS1 är det primära glutaminaset i Hs578T-celler men inte i Hap1-celler.

Figur 4: Utarmning av SLC7A11 främjar bröstcancercellernas överlevnad efter glukosutarmning.

Överexpression av SLC7A11 i SK-BR-3-celler ökade glutamatfrisättningen (kompletterande fig. 5a) och minskade samtidigt förmågan att bibehålla intracellulärt glutamat under glukosfattiga förhållanden (kompletterande fig. 5b). Överuttryck av SLC7A11 orsakade betydande SK-BR-3-celldöd efter glukosuttag. Celldöd räddades genom tillsats av dm-αKG, vilket tyder på att överexpression av SLC7A11 leder till brist på α-ketoglutarat under glukosbristförhållanden (fig. 4e).

Hs578T-celler med SLC7A11-nedbrytning kunde bibehålla sin andningsaktivitet under längre perioder efter glukosuttag (kompletterande fig. 5d). Omvänt visade SK-BR-3-celler som överuttrycker SLC7A11 en brant minskning av OCR under samma regiment. Sammantaget tyder dessa resultat på att system xc- i bröstcancerceller reglerar intracellulärt glutamatflöde till TCA-cykeln och ökar känsligheten för glukosuttag.

Nrf2 verkar uppströms SLC7A11

Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-like 2, NFE2L2) är en viktig transkriptionsfaktor som uppregulerar många cytoprotektiva gener involverade i oxidativ stress27. Eftersom SLC7A11 är en känd målgen för Nrf2 (ref. 27) undersökte vi korrelationen mellan Nrf2- och SLC7A11-uttryck i cancerceller. Nrf2-uttrycket är positivt korrelerat med SLC7A11-uttrycket i 59 bröstcancercellinjer (R=0,5688), liksom i alla 947 cancercellinjer (R=0,4306) i CCLE:s expressionsdata. Dessutom visar uttrycket av Nrf2-målgenen en hög korrelation med SLC7A11-uttrycket i 947 cancercellinjer. Korrelationskoefficienten (R) mellan SLC7A11 och NRF2-målgener är: NQO1 (+0,4179), GCLC (+0,3283), GCLM (+0,3944) och TXNRD1 (+0,4321).

Dessa korrelationer tyder på att Nrf2 stöder SLC7A11-uttrycket i en undergrupp av cancerceller. För att testa denna idé slog vi ner Nrf2 i Hs578T och MDA-MB-231 bröstcancerceller, två höga uttryckare av SLC7A11. Nrf2-nockdown orsakade en markant minskning av SLC7A11-uttrycket (fig. 5a,b,e) och minskad glutamatfrisättning (fig. 5c,f). Viktigt är att Nrf2-depleterade celler uppvisade kraftigt förbättrad livskraft under glukosuttag (fig. 5d,g). Återigen är denna förändring i livskraft beroende av glutamatmetabolismen, eftersom behandling med EGCG upphävde den positiva överlevnadseffekten av Nrf2-nedbrytning (fig. 5d). Dessutom var α-ketoglutarattillskott tillräckligt för att främja cellöverlevnad, även i närvaro av EGCG.

Figur 5: Nrf2 reglerar SLC7A11-uttryck och överlevnad av bröstcancerceller vid glukosuttag.

För att undersöka effekten av Nrf2-uppreglering behandlade vi cellerna med dimetylfumarat (DMF), en cellpermeabel Nrf2-aktivator28. DMF-behandlingen ledde till att MDA-MB-231-celler i hög grad inducerade SLC7A11-uttryck och glutamatfrisättning (fig. 5e,f). Dessutom uppvisade celler som förbehandlats med DMF väsentligt minskad livskraft under glukosdepletion jämfört med kontrollceller (fig. 5g). Vi uteslöt off-target-effekter genom att visa att dessa resultat av DMF-behandling var beroende av både SLC7A11 och Nrf2 (fig. 5f,g). Sammantaget tyder dessa resultat på att Nrf2-SLC7A11-axeln reglerar glutamatmetabolismen, cancercellernas beroende av glukos och deras förmåga att utnyttja glutamin som en alternativ kolkälla. Viktigt är att det tyder på att anpassning till oxidativ stress i cancerceller kan äventyra näringsflexibiliteten, särskilt genom förstärkning av en glukosberoende fenotyp.

xCT reglerar mitokondriell funktion i mtDNA-muterade celler

Våra resultat ovan tyder på att celler med system xc- uppreglering på grund av oxidativ stress kan ha begränsad näringsflexibilitet på grund av försämrad glutaminmetabolism. Hämning av den mitokondriella andningskedjan kan öka reaktiva syrearter29,30. Vi fann att SLC7A11-uttrycket inducerades av läkemedel som blockerar mitokondriefunktionen, särskilt rotenon och oligomycin, som hämmar komplex I (NADH-dehydrogenas) respektive V (ATP-syntas) i OXPHOS-maskineriet (kompletterande figur 6a). I överensstämmelse med dessa farmakologiska resultat uppreglerades SLC7A11 i cybridceller som innehöll homoplasmatiska mtDNA-mutationer i ND1-underenheten i komplex I eller underenheten ATP6 i komplex V (NARP) (Fig. 6a)30,31. Induktionen av SLC7A11 var särskilt tydlig i NARP-cellinjen, som har rapporterats ha höga ROS-nivåer och induktion av det mitokondriella ROS-avskiljande enzymet MnSOD30. SLC7A11-induktionen i NARP-cybridcellerna var starkt beroende av transkriptionsfaktorerna Nrf2 och Atf4 (kompletterande figur 6b) och kunde undertryckas genom behandling med antioxidanten N-acetylcystein (kompletterande figur 6c).

Figur 6: Hämningssystemet xc- ökar livskraften och den mitokondriella funktionen hos cybridceller med mtDNA-mutationer.

Vi undersökte om dessa kompensatoriska förändringar i systemets xc-uttryck påverkar den cellulära metabolismen i cybridcellerna. I överensstämmelse med deras högre uttryck av SLC7A11 hade ND1- och NARP-cybriderna lägre intracellulära glutamatnivåer (fig. 6b). Hämning av system xc- genom knockdown av SLC7A11 eller en potent hämmare, erastin, ökade det intracellulära glutamatet i ND1- och NARP-celler. På samma sätt ökade intracellulärt α-ketoglutarat, en produkt från glutamatmetabolismen, också genom SLC7A11-hämning (kompletterande fig. 6d). Det har länge varit känt att celler med OXPHOS-defekter överlever dåligt på galaktosinnehållande medium, vilket tvingar fram ett högre krav på OXPHOS som källa för ATP-generering32. De ND1- och NARP-muterade cybriderna kunde, till skillnad från de isogena WT 143B-cellerna, inte överleva i galaktosinnehållande medium (fig. 6c; kompletterande fig. 6e). SLC7A11 knockdown eller erastinbehandling räddade dock starkt livskraften hos ND1- och NARP-cybriderna i galaktosmedium. Effekten var tydligast i NARP-cybriderna, som uppvisade en mycket större induktion av SLC7A11 (fig. 6c).

Denna ökning av cellens livskraft korrelerade med en slående normalisering av mitokondriernas morfologi. Vår grupp har tidigare rapporterat att WT-celler förlänger sina mitokondrier under mediumförhållanden som kräver ökad OXPHOS-aktivitet, medan celler med mtDNA-mutationer istället fragmenterar sina mitokondrier33. I överensstämmelse med detta resultat uppvisade ND1- och NARP-cybriderna markant mitokondriefragmentering efter 24 timmars galaktosodling. Cybrider med SLC7A11-nockdown eller erastinbehandling visade däremot en betydande förlängning av mitokondrier när kolkällan i mediet byttes från glukos till galaktos (fig. 6d; kompletterande fig. 6f). SLC7A11 knockdown ändrade inte nivåerna av flera mitokondriella dynamikproteiner, inklusive Opa1, Mfn1 och Drp1 (kompletterande fig. 6g). Dessutom visade SLC7A11 knockdown-cellerna högre respirationsaktivitet än kontrollmuterade celler (fig. 6e). Sammantaget tyder dessa resultat på att hämning av system xc- i mtDNA-muterade cybrider förbättrar mitokondriell morfologi och respiration, vilket resulterar i en markant förbättrad överlevnad i galaktosmedium.

Digital Travel