B Fotoreceptorer

Fotoreceptordegenerationer är den vanligaste formen av blindhet i västvärlden och innebär att synen går förlorad på grund av att fotoreceptorer i näthinnan dystrofieras och/eller dör. Dessa patologier kan grovt delas in i de tillstånd som initialt påverkar stavfotoreceptorer, t.ex. retinitis pigmentosa (RP), och de som initialt påverkar kottfotoreceptorer, t.ex. makuladegeneration141 . Även om degeneration av fotoreceptorer också kan orsakas indirekt av primära defekter i RPE, som fyller en viktig funktion för fotoreceptorernas hälsa och homeostas, kommer detta ämne att diskuteras i ett senare avsnitt (se avsnitt II.C).

Fotoreceptorer är starkt polariserade sensoriska celler som består av ett inre segment (IS) som är kopplat till ett yttre segment (OS) genom ett starkt modifierat cilium (fig. 5).189 I mogna fotoreceptorer transporteras proteiner som krävs för tillväxt och underhåll av fotoreceptorernas OS, liksom för fototransduktion, längs polariserade mikrotubuli från det basala IS till det apikala OS. Fotoreceptorer liknar epitelceller i det avseendet att deras ytor är uppdelade i apikala och basolaterala domäner genom cellförbindelser. Deras centrosomer är belägna på den apikala ytan, medan deras kärnor ligger basalt.190 En korrekt utveckling och efterföljande underhåll av fotoreceptorer hos ryggradsdjur är beroende av att en korrekt apikal-basal polaritet upprättas, liksom av att transportmaskineriet fungerar. Det är därför inte förvånande att av de mer än 100 genetiska loci som är kända för att orsaka degenerationer av fotoreceptorer hos ryggradsdjur påverkar de flesta strukturen och funktionen hos OS.191

Figur 5. Strukturen hos stav- och kottfotoreceptorer. Fotoreceptorcellerna består av ett yttre segment som innehåller synpigmentbundna membranskivor. Det inre segmentet är fotoreceptorns polariserade cellkropp, där kärnan befinner sig basalt och ciliumet har sitt ursprung apikalt och sträcker sig in i OS. Den synaptiska terminalen bildar synaptiska kopplingar till näthinnans interneuroner och vidarebefordrar visuell input.161,188

Genetiska screeningar i zebrafiskar har kastat ljus över de molekylära grunderna för dessa cellfunktioner genom att isolera mutanter där fotoreceptorutveckling och/eller -underhåll är defekt.24,192,193 En sådan mutant, mosaic eyes (moe), visade sig innehålla expanderade apikala funktioner i fotoreceptorer.20,21 Lokus moe kodar för ett protein som innehåller en FERM-domän och som bildar ett komplex med Crumbs-proteiner, som i sin tur har visat sig vara kritiska för apikal-basal polaritet i Drosophila, liksom hos ryggradsdjur.194-196 Intressant nog är mutationer i den mänskliga ortologen till Crumbs, CRB1, förknippade med retinala dystrofier av fotoreceptorerna, t.ex. RP 12197 och Lebers medfödda amanuens (LCA1; ref. 198,199). Andra zebrafiskmutanter, såsom nagie oko (nok) och heart and soul (has), uppvisar inte bara fenokopiering av moe-mutantfenotypen, utan de proteiner som de kodar för (Pals1 respektive PKCi) interagerar också biokemiskt med Moe.20 Dessutom resulterar morfolino-knockdown av crb2b, en paralog till Crumbs i zebrafisk, i en minskning av IS-storleken.14 Dessa studier har därför börjat avslöja Crumbs-komplexets roll i vertebraternas fotoreceptorutveckling och sjukdom.

Bildandet av korrekt apikal-basal polaritet beror inte bara på korrekt funktion av cellpolaritetsdeterminanter, utan också på deras transport och lokalisering. Fotoreceptorer i ale oko (ako)-mutantens näthinna ackumulerar de apikala bestämningsfaktorerna Pals1 och PKCλ i sina cellkroppar och uppvisar omfattande fotoreceptordöd sent i utvecklingen19 . Lokus ako kodar för dynaktinkomplexets p50-underenhet, som har en viktig roll i transporten av last längs mikrotubuli som en del av dynein-motorkomplexet.200 I en annan mutant, mikre oko (mok), som har en mutation i dynaktin-1, beror näthinnedegenerationen åtminstone delvis på fellokalisering av fotoreceptorernas kärnor. Överraskande nog är till skillnad från ako-mutanter apikala determinanter som Crumbs och aPKCλ inte fellokaliserade, vilket tyder på att degenerationen hos dessa mutanter inte beror på förlust av cellpolaritet. Experimentell fellokalisering av kärnan genom överuttryck av dyneinmotorn resulterade i fotoreceptorcelldöd, vilket stödjer kärnpositionens roll för fotoreceptorernas överlevnad.201 Medan kärnpositioneringsdefekter i mok-fotoreceptorer tycks ha en cellautonom roll, verkar andra icke-cellautonoma komponenter spela en roll i mok-degenerationen. Mosaikanalyser har visat att muterade fotoreceptorer uppvisar en över 2,5-faldig ökning av överlevnaden när de placeras i en vildtyp-miljö.17 Detta fynd tyder på att fotoreceptorernas hälsa och överlevnad beror på miljömässiga signaler från omgivande celler. Dessa fynd stämmer överens med defekter som förknippas med vissa mänskliga degenerationer, t.ex. RP, där en initial defekt i det stavspecifika rhodopsinet i slutändan resulterar i förlust av både stavar och tappar.202

Transport från cellkroppen till OS är också viktig för att ersätta OS-komponenter som går förlorade på grund av den kontinuerliga fagocytos av fotoreceptorernas OS som utförs av det överliggande RPE.203 I fotoreceptorer, liksom i cilier, sker transporten genom en process som kallas Intraflagellar Transport (IFT) och mutationer i IFT-komponentgener som ift57, ift80, ift88 och ift172 resulterar i OS-atrofi och/eller fullständig förlust av OS i zebrafiskar.24-26 Mutationer i elipsa-genen, som kodar för ett protein som tros underlätta IFT,35 resulterar i tidig förlust av fotoreceptorer,22 medan morpholino-knockdown av flera underenheter av den retrograda IFT-motorn dynein-2 har belyst betydelsen av IFT för korrekt förlängning av OS och visuell funktion.204 Degenerationer av fotoreceptorer som är relaterade till defekt IFT är några av de många ciliarelaterade fenotyper som är förknippade med Bardet-Biedl-syndromet (BBS)205 , och ytterligare studier av IFT-komponenternas funktion i zebrafiskar kan visa sig vara avgörande för att få en bättre förståelse för de molekylära orsakerna som ligger till grund för BBS-relaterade okulära patologier.

Men medan de mutanter som hittills beskrivits i det här avsnittet isolerades i genetiska screeningar där man huvudsakligen använde sig av histologiska metoder för att upptäcka defekter i fotoreceptorerna, isolerades andra i beteendemässiga screeningar.15,82,206,207 En sådan screening utnyttjade zebrafiskens förmåga att uppvisa ett synberoende beteende så tidigt som 3 dpf (dagar efter befruktning). Brockerhoff et al.15 använde först den optokinetiska responsanalysen (OKR) på mutageniserade embryon för att upptäcka defekter i synfunktionen. I en andra test användes inspelningar av elektroretinogram (ERG) för att identifiera om isolerade mutationer påverkar den yttre näthinnans funktion. Från denna screening isolerades 18 mutanter som konstaterades ha nedsatt visuell funktion. En av dem, no optokinetic response a (noa), hade inga grova fotoreceptoravvikelser vid 5 dpf (dagar efter befruktning), men visade sig vara blind och slö och dog i förtid. Analysen av noa-mutationen avslöjade en brist i en underenhet av pyruvatdehydrogenaskomplexet (PDH), som reglerar energiproduktionen i cellerna. Noa-mutantlinjen har använts som modell för att studera PDH-brist (OMIM 245348), en mänsklig sjukdom som i likhet med zebrafiskmodellen resulterar i blindhet, neurologiska defekter och tidig död.16 Eftersom nuvarande behandlingar för PDH-brist hos människor har resulterat i begränsad framgång, använde Taylor et al. noa-mutanter för att testa en ketogen kost som har visat sig vara framgångsrik när det gäller att lindra symtom på PDH-brist hos ett begränsat antal mänskliga patienter. Administrering av denna specialdiet återställde normalt beteende hos noa-mutanter, vilket belyser potentialen i att studera PDH-bristbehandlingar i noa-mutantlinjen.

En annan mutant, no optokinetic response f (nof), visade sig ha en mutation i α-underenheten av kottransducin (Tcα), ett G-protein som krävs för fototransduktion. Hos mänskliga patienter som lider av ett tillstånd som kallas akromatopsi (OMIM 139340) ligger mutationer i Tcα till grund för förlust av färgseende. Hos nof-mutanter sker utvecklingen av kottar normalt, men de är dock upp till 1 000 gånger mindre känsliga för ljus, vilket kan påvisas genom inspelning av enskilda fotoreceptorer. En omfattande analys av kottarnas ljusreaktioner visade att den kvarvarande fototransduktionen är ljusberoende, men oberoende av transducin. Ca+ 2-inflödet, som är viktigt för fotoreceptorernas ljusanpassning och som tidigare ansågs vara kontrollerat av transducin, kunde fortfarande påvisas i nof-mutanter. Denna studie avslöjade därför att en del Ca+ 2-influx i kottfotoreceptorer kan vara transducinoberoende.

I en separat screening utfördes dominanta mutationer som orsakar fotoreceptordegeneration hos vuxna zebrafiskar för att isolera genetiska mutanter som senare skulle kunna användas för att studera mänsklig ärftlig nattblindhet, såsom RP.37,38 När det gäller RP ligger många genetiska loci till grund för denna grupp av störningar. Endast ungefär hälften av fallen av dominant RP har dock kopplats till specifika mutationer vid den tidpunkt då screeningen utfördes.38 Li et al. screenade därför mutageniserade vuxna zebrafiskar genom att utnyttja en känd flyktreaktion som fisken uppvisar. En avsaknad av ett sådant svar på en hotfull signal tolkades som en förlust av synen, vilket senare bekräftades med hjälp av ERG-registreringar. Totalt isolerades sju heterozygota mutanter (nightblindness a, b, c, d, e och f), av vilka sex uppvisade fotoreceptordegeneration.38,39,208,209 Fyra av de sex visade sig vara embryonalt dödliga som homozygoter, vilket tyder på att de muterade gener som ligger till grund för fotoreceptorfenotyperna har andra kritiska funktioner under embryonal utveckling. Detta resultat understryker vikten av sådana screeningar för identifiering av dominanta mutationer som kanske inte lätt kan isoleras i traditionell screening på grund av tidig embryonal dödlighet.