WOX se localiza en el brazo largo del cromosoma 16 en un sitio frágil conocido. Está compuesto por nueve exones y tiene un tamaño de >1 Mb.1 El transcrito canónico (ENST00000566780.5, NM_016373.3) codifica una proteína ubicua de 414 aminoácidos (aa) altamente expresada en la próstata, las gónadas, la mama, el pulmón, los tejidos endocrinos y el cerebro.21,22 El splicing alternativo de WWOX durante el procesamiento del ARN mensajero precursor (pre-ARNm) genera ocho transcritos que se han observado sólo en cánceres; se desconoce si cada ARNm aberrante de WWOX se traduce en proteína.23 La oxidorreductasa que contiene dominios WW es la única proteína que acopla dos dominios distintos con altas homologías tanto con la familia de dominios WW como con la superfamilia SRD. La WWOX alberga dos dominios WW en el extremo amino, un motivo de señal de localización nuclear (NLS) y un dominio C-terminal de deshidrogenasa de cadena corta (SDR) (Fig. 1b). También se ha mapeado un motivo de secuencia de orientación mitocondrial (MTS) dentro del dominio SDR entre los aa 209 y 273 (ref. 24). WWOX también contiene un sitio de unión de coenzimas, NAD(H) o NADP(h) (GANSGIG, aa 131-137), y un sitio de unión de sustrato potencial (YNRSK, aa 293-297) (ref. 1). El dominio C-terminal de WWOX (aa 125-414) es similar a una región de interacción MAPT (http://www.uniprot.org/uniprot/Q9NZC7).

Variantes patogénicas de la línea germinal de WWOX identificadas en pacientes con trastornos constitucionales relacionados con WWOX (SCAR12, síndrome de WOREE y DSD). a Variaciones del número de copias (n = 12). DSD trastorno del desarrollo sexual, IF en el marco, OOF fuera del marco, WOREE encefalopatía epiléptica relacionada con WWOX. b Variaciones de un solo nucleótido (n = 23). MTS secuencia de orientación mitocondrial, NLS señal de localización nuclear, SRD deshidrogenasa reductasa de cadena corta.

WOX es tolerante a las variaciones de sentido erróneo con una métrica de restricción de sentido erróneo Z = -3,19 (Exome Aggregation Consortium).20 Se observan muchas VNC heterocigotas que afectan a todo o parte de este gen en muestras de control sanas (Database of Genomic Variants).25 El elevado número de variaciones patogénicas/probablemente patogénicas en las bases de datos públicas no es sorprendente si se tiene en cuenta el modo de herencia autosómico recesivo de la encefalopatía relacionada con WWOX.

WOX se expresa en el sistema nervioso en desarrollo de los ratones, incluida la corteza cerebral y el cerebelo, desde el útero hasta la edad adulta.26 Los modelos animales demostraron la epilepsia y la ataxia causadas por la pérdida de WWOX,3,27 lo que sugiere un proceso neurodegenerativo. En una revisión detallada de la literatura, Aldaz y colaboradores demostraron claramente que WWOX está en la encrucijada del cáncer, el síndrome metabólico y la encefalopatía.28

Los datos clínicos y moleculares de todos los pacientes de la literatura con fenotipos SCAR12 o WOREE se describen en la Tabla Suplementaria 3 (refs. 3,4,5,6,7,8,29,30). Dos pacientes adicionales, hermanas de una familia árabe consanguínea con una variante homocigota de WWOX (c.1228G>T; p.Gly410Cys), también fueron reportados por Alkhateeb et al. en 2016 (ref. 9), pero hay dudas sobre la patogenicidad de la variante identificada en estos casos. Ambos presentaron retraso en el habla y uno tuvo epilepsia desde los 2 años de edad. La presentación clínica en esta familia es muy leve en comparación con el síndrome de WOREE observado en pacientes con variantes patogénicas germinales bialélicas en WWOX. Este cambio de glicina a cisteína en la posición 410 afecta a un aminoácido en el extremo del lado del extremo carboxilo de la proteína. Además, este cambio de aminoácido está presente en forma homocigota en dos individuos en el conjunto de datos de gnomAD. Aunque las predicciones in silico están a favor de la patogenicidad de esta variante patogénica con sentido erróneo (posiblemente dañada por PolyPhen-2), su papel causal es cuestionable en esta familia. Por lo tanto, hemos decidido excluir a estos pacientes de nuestra revisión de la literatura.

Informamos aquí sobre la mayor cohorte de individuos con un fenotipo WOREE que consiste en 20 pacientes adicionales con variantes patogénicas bialélicas en WWOX heredadas de padres sanos (Tabla Suplementaria 1). Los diagnósticos moleculares se obtuvieron mediante una combinación de diferentes técnicas (array-CGH, qPCR/MLPA, secuenciación Sanger dirigida, ES y WGS). Agregando nuestros pacientes con todos los casos reportados hasta ahora en la literatura, se conocen 37 pacientes de 27 familias con un síndrome de WOREE y variantes patogénicas bialélicas de WWOX. Se han identificado un total de 29 alelos patógenos/probablemente patógenos diferentes (10 CNVs y 19 SNVs) (Fig. 1a, b). Los intrones 5 y 8 del gen WWOX son muy grandes, con un tamaño de 220 y 780 Kb respectivamente. Cubren el 90% de la secuencia genómica de WWOX y contienen puntos de rotura de translocación para el mieloma múltiple,28 de acuerdo con el hecho de que las grandes regiones intrónicas son a menudo recombinogénicas y propensas a puntos de rotura cromosómica. En consecuencia, la duplicación (un alelo) y la deleción (cinco alelos) que abarcan los exones 6 a 8 son las VNC patogénicas más frecuentes observadas en los pacientes con trastornos relacionados con WWOX (Tablas suplementarias 1 y 3). Todos los pacientes de familias consanguíneas (10/27; 37%) resultaron ser homocigotos para el mismo alelo deletéreo, un hecho común en los trastornos autosómicos recesivos de baja prevalencia. La elevada proporción de familias con un genotipo que comprende una o dos VNC patogénicas (14/27; 52%) pone de manifiesto la necesidad de un enfoque cuantitativo para el cribado del locus WWOX en pacientes con trastornos graves del sistema nervioso central. En los pacientes heterocigotos para una VNC que afecta a varios exones, es importante buscar (1) un posible genotipo heterocigoto compuesto para dos VNC pequeñas y la necesidad de un segundo análisis cuantitativo por MLPA o qPCR en ambos padres y (2) un SNV en el segundo alelo por secuenciación Sanger dirigida. Del mismo modo, cuando se realiza la secuenciación del exoma o del panel de genes dirigidos como investigación de primera línea, la búsqueda de CNVs es esencial en este gran gen propenso a las deleciones y duplicaciones, implicando la totalidad o parte de sus secuencias codificantes.

En este estudio informamos de ocho nuevas variantes patogénicas missense (Tabla Suplementaria 2). Entre los resultados de la secuenciación de alto rendimiento del exoma y del panel de genes dirigidos, las variantes sin sentido de WWOX son numerosas. Su patogenicidad es difícil de establecer porque WWOX tiene numerosas funciones y socios proteicos. Seguimos las directrices del American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG)31 para interpretar y anotar las variaciones sin sentido en los datos de WWOX para clasificarlas como patógenas, probablemente patógenas, variantes de significado desconocido (VUS), probablemente benignas o benignas. Para ayudar a nuestro proceso de interpretación de las variantes, utilizamos una herramienta en línea disponible abiertamente (http://www.medschool.umaryland.edu/Genetic_Variant_Interpretation_Tool1.html/) para clasificar eficazmente las variantes basándonos en las categorías de evidencia indicadas por las directrices del ACMG.31 Cuatro cambios de aa (p., p., p., p.) están asociados en trans con variantes nulas en un gen en el que la pérdida de función es un mecanismo de enfermedad conocido. Todas las variantes sin sentido identificadas en individuos con encefalopatía relacionada con WWOX (11 cambios aa en 12 familias, Tabla Suplementaria 2) son predichas como causantes de la enfermedad por una combinación de softwares basados en la web. Y lo que es más importante, ninguna está presente en estado homocigótico en gnomAD.20 Todas las variantes con sentido erróneo se clasifican como patógenas o probablemente patógenas de acuerdo con las recomendaciones del ACMG. Un paciente (P19) es portador de tres variantes patogénicas missense diferentes: p.; (Tabla Suplementaria 1). La p.(Lys200Glu) y la p.(Thr358Ile) están localizadas en cis; se predice que ambos cambios de aminoácidos son probablemente patogénicos aunque la treonina en la posición 358 no está localizada en un dominio funcional conocido. No es posible determinar si una o ambas variantes son la variante sin sentido causante de la enfermedad en P19. En la mayoría de los casos aquí reportados y publicados en la literatura médica, las variaciones de la secuencia WWOX se describen a nivel del ADN básico. Todas las variantes patogénicas con sentido erróneo excepto una (P3; p.) se interpretan basándose en estudios in silico sin pruebas experimentales (no se ha analizado la secuencia de ARN o proteínas). En P3, el análisis del ARN total mediante la secuenciación de Sanger de los productos de la PCR de transcripción inversa (RT-PCR) no detectó ninguna anomalía de empalme en los leucocitos. No se realizaron estudios de ARN en otros pacientes porque no se disponía de muestras de sangre adecuadas en el momento del diagnóstico molecular. Las SNVs exónicas podrían afectar a los sitios de empalme fisiológicos aceptor/donante, pero también al potenciador de empalme exónico (ESE) y al silenciador de empalme exónico (ESS). Además, la activación de sitios de empalme crípticos por SNVs es un mecanismo patológico bien entendido en muchos trastornos genéticos; un buen ejemplo de esto es el síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford.32 Las variantes sin sentido también podrían tener un impacto en la estabilidad del ARNm.33 Hasta el 10% de las variantes sin sentido asociadas a enfermedades conocidas, pero sólo el 3% de los SNPs comunes, alteran el empalme del pre-ARNm.33 Es probable que una fracción de las variantes sin sentido predichas identificadas en pacientes con encefalopatía relacionada con WWOX resulte en una pérdida de expresión debido a un empalme anormal. Esto es aún más probable en el caso de un gen con alelos patógenos de pérdida de función. En el caso de las variantes patogénicas missense en el dominio SRD, la ausencia de sustratos identificados dificulta la evaluación de su impacto en la actividad catalítica de WWOX. La caracterización de modelos animales knock-in, como el pez cebra, daría pistas sobre la patogenicidad de las variantes missense de WWOX.

En un paciente no incluido en este estudio, se sospechó inicialmente un diagnóstico molecular de encefalopatía relacionada con WWOX ante un genotipo bialélico consistente en dos SNVs en trans: un nonsense (ENST00000566780.5:p.Gln72*) y una variante missense (ENST00000402655:c.600T>A, p.Ser200Arg). El cambio de aa en la posición 200 sólo afecta a una proteína WWOX de 311 residuos que no está en RefSeq. Hasta ahora, todos los cambios de aa patógenos se han descrito según la proteína WWOX canónica (414 aa), que resulta de la traducción de un transcrito de 9 exones (ENST00000566780.5, isoforma 1). Se desconoce si la isoforma de la proteína WWOX compuesta por 311 residuos es relevante para los trastornos relacionados con la WWOX. Además, el fenotipo de este paciente era leve en comparación con el síndrome de WOREE. Por estas razones, decidimos no considerar este genotipo como causante de la encefalopatía en este paciente.

¿WOX, cáncer y enfermedad pulmonar?

WOX es un gen supresor de tumores implicado en la modulación de las vías relacionadas con el cáncer a través de las interacciones proteína-proteína entre los dominios WW y varias proteínas oncogénicas. La pérdida de la proteína WWOX se ha encontrado en múltiples neoplasias.23 Se observan osteosarcomas y carcinomas de pulmón en ratones Wwox-/-22 y la tumorigénesis es una de las consecuencias de un genotipo hipomórfico de Wwox.34 Una pérdida funcional de copia CNV (67048) en WWOX se asoció significativamente con un mayor riesgo de cáncer en poblaciones chinas.35,36,37 Más recientemente, se ha demostrado que la pérdida de expresión de WWOX en el pulmón de ratones provoca una inflamación neutrofílica.38 Sorprendentemente, nunca se informó de un aumento de los casos de cáncer ni en los pacientes con variantes patógenas de la línea germinal de WWOX bialélicas ni en sus padres heterocigotos. La gravedad del síndrome de WOREE, con una alta frecuencia de muerte prematura en los primeros años de vida, podría explicar la ausencia de cánceres. Esta no es una explicación convincente para los pacientes heterocigotos para un alelo nulo de WWOX. La ablación de Wwox no es tumorigénica en todos los modelos animales knockout; es más probable que este supuesto gen supresor de tumores sea relevante en la progresión de los mismos más que en su inicio durante la oncogénesis. Este estudio confirma que las alteraciones de la línea germinal de WWOX no son variantes patogénicas conductoras importantes para el inicio y/o la progresión del cáncer.

WWOX y DSD

WOX se expresa en gran medida en tejidos regulados hormonalmente, como la hipófisis, los testículos y el ovario, y se supone que desempeña un papel en la biosíntesis de gonadotropinas o esteroides sexuales.1,39 Se cree que el dominio enzimático SRD en WWOX tiene un papel en el metabolismo de los esteroides con sustratos aún no identificados. Estas observaciones y la descripción de dos modelos diferentes de ratones knockout de WWOX con anomalías gonadales34,39 apoyan claramente un papel de WWOX en el desarrollo de las gónadas.

El primer reordenamiento de la línea germinal de WWOX en humanos se asoció con un DSD 46, XY.2 El paciente tenía tejido gonadal indiferenciado bilateral y testículos inmaduros. Era heterocigoto para una deleción de los exones 6 a 8 heredada de su madre, que tenía una historia personal de menarquia tardía. Se predice que esta CNV resulta en una deleción dentro del marco, causando un producto acortado con el dominio SRD en gran parte ausente. Más recientemente, tres VUS heterocigotas en el gen WWOX fueron identificadas por ES en pacientes con DSD (Fig. 1) (ref. 40). Hasta donde sabemos, no se ha informado de DSD en padres heterocigotos de pacientes con síndrome de WOREE y creemos que la implicación de SNVs/CNVs heterocigotos en la etiología molecular de DSD es cuestionable. La atrofia testicular, la reducción de la fertilidad, las anomalías gonadales, la disfunción de las células de Leydig y la alteración del desarrollo mamario forman parte de los fenotipos observados en varios modelos animales de ablación de WWOX.28 Hasta donde sabemos, no se ha informado de la DSD en modelos animales de knockout heterocigotos. Sin embargo, sigue existiendo la posibilidad de que se identifique un fenotipo más leve tras una cuidadosa evaluación del desarrollo sexual y la función gonadal en pacientes heterocigotos para una variante patogénica de WWOX.

Fenotipo de SCAR12

En 2014, se identificaron por ES variantes patogénicas homocigotas con sentido erróneo en WWOX en seis pacientes de dos familias consanguíneas con ataxia espinocerebelosa autosómica recesiva (SCAR12). Hasta ahora, esta asociación no se ha confirmado en otras familias. Los pacientes afectados presentaban ataxia cerebelosa de inicio en la infancia, epilepsia tónico-clónica generalizada, discapacidad intelectual y espasticidad prominente.3 En comparación con los pacientes con el síndrome de WOREE, los pacientes con el fenotipo SCAR12 presentan un retraso en el desarrollo menos grave: todos fueron capaces de caminar (4/4; 100%), 3 de 4 fueron capaces de hablar y no se registró ninguna muerte prematura. Cuando se realizó, la resonancia magnética cerebral mostró una hipoplasia cerebelosa leve (2/2; 100%) en los pacientes afectados, una característica no observada en nuestra cohorte. Aunque la epilepsia era una característica constante en los pacientes del SCAR12, las crisis respondían con mayor frecuencia a los fármacos antiepilépticos (2/4; 50%). La afectación ocular también estaba presente, con nistagmo en cuatro pacientes. Esta forma de ataxia cerebelosa autosómica recesiva relacionada con WWOX parece ser una condición genética rara. La gravedad del fenotipo WOREE y la muerte prematura en una parte de los pacientes podrían ocultar problemas de equilibrio relacionados con la disfunción cerebelosa. Se necesitan casos adicionales de ataxia cerebelosa relacionada con WWOX para confirmar su implicación en este trastorno neurológico.

Fenotipo WWEE

Poco después de la descripción del fenotipo SCAR12, WWOX fue implicado en una forma recesiva de encefalopatía epiléptica infantil en 17 pacientes de 9 familias.4,5,6,7,8,9,30 Nosotros duplicamos con creces el número de casos con 20 pacientes afectados en 18 familias adicionales. El fenotipo de nuestros pacientes coincide con el de informes anteriores. Observamos una menor tasa de consanguinidad en nuestra cohorte, de acuerdo con la mayor proporción de genotipos heterocigotos compuestos descritos en este estudio. Estos genotipos podrían haber pasado desapercibidos cuando se realizaron de forma independiente el array-CGH o la secuenciación de alto rendimiento. La implementación de la predicción de la CNV a partir de los datos de la secuencia del exoma facilita la identificación de pacientes con genotipos WWOX compuestos tanto de SNV como de CNV.

En 2015 se informó de un feto con anomalías cerebrales y posibles convulsiones intrauterinas (ref. 7). La disminución de los movimientos fetales se informó ocasionalmente en nuestra serie (3/20) mientras que el aumento de la translucencia nucal fue el signo más frecuente durante el embarazo en informes anteriores (4/17). Las contracturas de manos y pies se registraron en 5 pacientes de nuestra cohorte y en 3 pacientes de la literatura4,5,6 en el período prenatal o neonatal. La disminución de los movimientos fetales, el aumento de la translucencia nucal y las anomalías de las manos o los pies podrían ser signos prenatales de la enfermedad, pero no son características clínicas específicas ni frecuentes.

A diferencia de la literatura, el retraso del crecimiento (6%) y la microcefalia (20%) no fueron características destacadas en nuestros pacientes, que presentaban una estatura media baja normal (-1,1 DE) y una OFC media (-1,4 DE). En más de la mitad de los pacientes se observó un dismorfismo. Los rasgos más llamativos eran una cara redonda con mejillas llenas, un cuello corto y una apariencia facial hipotónica (Fig. 2). En los pacientes P15 y P16, a una edad más avanzada, la hipotonía facial seguía presente pero la cara se volvía más triangular. Otros problemas médicos eran la escoliosis o la cifosis de aparición temprana (65%), que podría orientar el diagnóstico, así como problemas de alimentación que requerían una sonda de alimentación en el 70% de los pacientes y problemas respiratorios (40%), como se observa en otras encefalopatías infantiles.

Todos los pacientes tenían un grave retraso en el desarrollo. Ninguno de ellos era capaz de sentarse, hablar o caminar. El examen neurológico mostró hipotonía axial e hipertonía distal en la mayoría de los pacientes. Ocasionalmente se observaron movimientos distónicos. Como se indica en la literatura, todos los pacientes tenían epilepsia de inicio temprano (100%) con convulsiones diarias y resistencia a los medicamentos observada en la mayoría de los casos (95%). No se observó una susceptibilidad importante a las convulsiones febriles. El síndrome de West, caracterizado por espasmos e hipsarritmia registrados en el EEG, se registró en el 26% de los pacientes. Se observaron convulsiones focales, generalizadas y combinadas. Se describieron crisis tónicas, clónicas, tónico-clónicas y mioclónicas, así como espasmos infantiles y ausencias. Por lo tanto, la epilepsia era muy grave, de inicio precoz y con crisis variables. Como se ha descrito anteriormente, la discapacidad visual parece formar parte del espectro clínico del síndrome de WOREE. La mayoría de los pacientes afectados no tenían contacto visual (75%). Alrededor de la mitad de ellos presentaban un fondo de ojo alterado (47%) y/o pruebas electrodiagnósticas (45%) sugestivas de atrofia óptica y/o distrofia retiniana. Por lo tanto, el examen oftalmológico precoz puede dar pistas diagnósticas en pacientes con convulsiones de inicio temprano y retraso en el desarrollo. La resonancia magnética cerebral (Fig. 3) fue anormal en el 80% de los pacientes, mostrando principalmente hipoplasia del cuerpo calloso (75%) y atrofia cerebral (55%). Hemos confirmado en nuestra cohorte que la muerte prematura es una característica del síndrome de WOREE que se produce en ocho pacientes (40%) con una edad media de muerte de 40 meses. La gravedad de la epilepsia y el deterioro neurológico pueden estar relacionados con la muerte prematura en los pacientes afectados.

Imagen de resonancia magnética (RM) cerebral de individuos con síndrome de encefalopatía epiléptica relacionada con WWOX (WOREE). a-j Cuerpo calloso hipoplásico en planos sagitales. k-q Atrofia cerebral y espacios subaracnoideos agrandados en planos axiales (P4, P6, P14) y coronales (P3, P7, P17). r-t Hiperseñal de sustancia blanca simétrica en T2 axial. u-v Plagiocefalia y ventrículo lateral asimétrico en planos T2 axiales. w P19 lesiones circulares T1 sagitales (hiposeñal) de la parte medial del cuerpo calloso. m mes, P paciente, y año de edad.

Los principales signos clínicos en pacientes con TMEE previamente publicados se resumen en la Tabla Suplementaria 4. A partir de esta revisión podemos concluir que la EMAO es una encefalopatía epiléptica muy grave caracterizada por una escasa movilidad espontánea, ausencia de desarrollo del lenguaje y de adquisición de la marcha, convulsiones resistentes a los fármacos de aparición temprana, afectación oftalmológica y una alta probabilidad de muerte prematura. Los rasgos dismórficos (cara redonda e hipotónica, mejillas llenas y cuello corto) y la deformidad de la columna vertebral pueden ser signos asociados tempranos que pueden apoyar el diagnóstico.

Correlaciones fenotipo/genotipo

Recientemente se sugirieron correlaciones fenotipo/genotipo para los trastornos del neurodesarrollo relacionados con WWOX5,7 con una clasificación de los genotipos de WWOX en tres grupos. Según la clasificación provisional, los pacientes portadores de dos alelos nulos predichos tenían más probabilidades de presentar el fenotipo WOREE más grave, mientras que los genotipos hipomórficos con dos variantes sin sentido darían lugar a la ataxia espinocerebelosa (SCAR12). El fenotipo de los pacientes que portan un alelo nulo y una variante patogénica con sentido erróneo sería intermedio.5 Nuestro amplio estudio proporciona una reevaluación de estas correlaciones preliminares.

La presentación clínica más grave parece estar asociada a los genotipos que consisten en codones de parada prematuros tempranos que corresponden a un knockdown completo de WWOX. Estos genotipos se observan en siete pacientes: deleción homocigótica del exón 1 al 4 en P10, codones de parada homocigóticos p.(Arg54*) y p.(Trp44*),4,30 deleción homocigótica de los seis primeros exones.7 La muerte prematura antes de los 2 años se produjo en 5/7 casos y se detectaron anomalías cerebrales prenatales en una familia. Además, nunca se ha descrito la muerte prematura en pacientes con un genotipo de variante patogénica missense (Tablas suplementarias 1 y 3). La caracterización precisa de las variantes missense y CNVs a nivel proteico con estudios funcionales puede dar algunas pistas sobre cómo los genotipos podrían explicar las diferentes presentaciones clínicas, especialmente en lo que respecta a los fenotipos SCAR12/WOREE.

En conclusión, las variantes patogénicas de la línea germinal en WWOX están claramente asociadas con una encefalopatía epiléptica severa de inicio temprano llamada síndrome WOREE y aquí informamos sobre la mayor cohorte de individuos con este trastorno neurológico. La implicación de las variantes constitucionales de WWOX en el DSD y el SCA todavía necesita estudios de replicación.