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Der Glutamat/Cystin-xCT-Antiporter wirkt dem Glutamin-Stoffwechsel entgegen und verringert die Nährstoffflexibilität

April 29, 2021 by admin

Ein haploider genetischer Screen für Glukoseabhängigkeit

Viele immortalisierte Zelllinien zeigen eine begrenzte Nährstoffflexibilität und sind in hohem Maße von Glukose als primärer Kohlenstoffquelle abhängig. Wir haben festgestellt, dass das Überleben der menschlichen haploiden Hap1-Zelllinie Glukose im Kulturmedium erfordert. Um Faktoren zu identifizieren, die an dieser „Glukosesucht“ beteiligt sind, führten wir einen haploiden genetischen Screen15 durch, um Mutanten zu isolieren, die in völliger Abwesenheit von Glukose überleben. Wir mutierten nach dem Zufallsprinzip 1 × 108 Hap1-Zellen mit niedriger Infektionsrate mit einem retroviralen Genfallenvektor16 und kultivierten die mutierte Population 12 Tage lang in einem Medium mit Glukosemangel. Nachdem die Mehrheit (>99%) der Zellen abgestorben war, wurden Zellen, die gegen den Glukoseentzug resistent waren, wiedergewonnen und in nährstoffreichem Medium vermehrt. Die Genfallen-Insertionsstellen der resistenten Population wurden durch inverse PCR-basierte Illumina-Sequenzierung identifiziert17. In der ausgewählten Population wurden die Gene SLC3A2/4F2hc (399 verschiedene Insertionen) und xCT/SLC7A11 (39 Insertionen) mit hoher Häufigkeit durch retrovirale Integration gestört (Abb. 1a). Bemerkenswert ist, dass die Proteinprodukte dieser Gene bekanntermaßen physisch interagieren, wobei die SLC3A2-Untereinheit als schwere Kette und die SLC7A11-Untereinheit als leichte Kette bezeichnet werden, um den Aminosäure-Antiporter zu bilden, der als System xc- oder xCT-Antiporter18 bekannt ist. Der xCT-Antiporter ist ein Aminosäuretransporter auf der Zelloberfläche, der Glutamat im Austausch gegen Cystin exportiert. Dieser Austausch ist wichtig für die Abwehr zellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), denn Cystin ist das oxidierte Dimer von Cystein, einem entscheidenden Vorläufer für die Synthese von Glutathion (GSH), einem wichtigen Antioxidans19. Der Klarheit halber bezeichnen wir den funktionellen Transporter als „System xc-“ oder „xCT-Antiporter“ und die Untereinheit der leichten Kette als SLC7A11.

Abbildung 1: Identifizierung von SLC3A2 oder SLC7A11 als Faktoren, die die Lebensfähigkeit von Zellen unter Glukose-defizienten Bedingungen begrenzen.

Um die zellulären Folgen dieser Genunterbrechungen zu charakterisieren, isolierten wir Hap1-Klone mit SLC3A2- und SLC7A11-Genfallen-Insertionen. Die SLC3A2-Mutante mit der Bezeichnung AC24 weist eine Genfallen-Insertion im zweiten Intron von SLC3A2 in der für die Genunterbrechung erwarteten Orientierung auf und zeigt keine SLC3A2-Expression. Darüber hinaus ist die Expression von SLC7A11 deutlich geringer, was zu erwarten ist, da SLC3A2 mit SLC7A11 assoziieren muss, um einen stabilen Komplex zu bilden (Abb. 1b). Die SLC7A11-Mutante mit der Bezeichnung AC6 weist eine Genfallen-Insertion in der 5′ untranslatierten Region des ersten Exons von SLC7A11 auf und zeigt eine stark verringerte SLC7A11-Expression auf Protein- (Abb. 1b) und mRNA-Ebene (ergänzende Abb. 1). Die Spiegel von SLC3A2 sind in AC6 weitgehend unbeeinflusst, wahrscheinlich weil die SLC3A2-Untereinheit von mehreren Aminosäuretransportern gemeinsam genutzt wird18. Beide Klone zeigen eine geringere Glutamatfreisetzung in die Medien (Abb. 1c), was bestätigt, dass das System xc- funktionell gestört ist. Wichtig ist, dass beide Klone unter Glukose-Mangelbedingungen eine stark verbesserte Lebensfähigkeit aufweisen (Abb. 1d,e). Nach 24 Stunden Glukoseentzug sind >70 % der Zellen in beiden Klonen lebensfähig, während nur 10 % der elterlichen Hap1-Zellen überleben. In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis verbesserte die Behandlung von Hap1-Zellen mit Sulfasalazin (SASP)20, einem System-xc-Inhibitor, die Lebensfähigkeit von WT-Hap1-Zellen nach Glukoseentzug (Abb. 1d,e).

System xc- reguliert die Lebensfähigkeit der Zellen während des Glukoseentzugs

Um die Ergebnisse des genetischen Screenings unabhängig zu bestätigen, verwendeten wir kurze Haarnadel-RNAs (shRNAs), um System xc- in Hap1-Zellen stabil zu deaktivieren (Abb. 2a). Da SLC3A2 als gemeinsame schwere Kette für mehrere Aminosäuretransporter18 pleiotrope Funktionen hat, konzentrierten wir unsere Knockdown-Bemühungen auf die SLC7A11-Untereinheit. Zellen, die eine von zwei unabhängigen SLC7A11 shRNAs enthielten, gaben deutlich weniger Glutamat in das Medium ab (Abb. 2b). Sie zeigten eine stark verbesserte Lebensfähigkeit nach Glukoseentzug (Abb. 2c). Die Proliferationsrate in glukosehaltigen Medien änderte sich jedoch nicht (ergänzende Abb. 2a).

Abbildung 2: System xc- wirkt sich negativ auf die Lebensfähigkeit von Hap1- und HeLa-Zellen nach Glukoseentzug aus.

Umgekehrt fragten wir uns, ob eine Erhöhung des Spiegels des Systems xc- in einer Zelllinie mit geringem endogenen SLC7A11 die Zellen für den Glukoseentzug sensibilisieren würde. Im Vergleich zu Hap1-Zellen exprimierten HeLa-Zellen fast nicht nachweisbare Mengen der SLC7A11-Untereinheit (Abb. 2a) und wiesen eine geringe Glutamatfreisetzung in das Medium auf (Abb. 2b). Interessanterweise zeigten HeLa-Kontrollzellen eine hohe Lebensfähigkeit, obwohl ihnen Glukose entzogen wurde (Abb. 2d). Die Überexpression der SLC7A11-Untereinheit führte zu einem starken Anstieg der Glutamatfreisetzung (Abb. 2a,b) und zu einem stark erhöhten Zelltod bei Glukoseentzug (Abb. 2d). In glukosehaltigen Medien veränderte sich die Proliferationsrate der SLC7A11-überexprimierenden HeLa-Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe jedoch nicht (ergänzende Abb. 2a). Somit reicht die Überexpression von SLC7A11 aus, um eine Glukosesucht auszulösen. Ähnliche Ergebnisse wurden unter Kulturbedingungen mit niedrigem Glukosegehalt (im Gegensatz zu den obigen Experimenten ohne Glukose) erzielt (ergänzende Abb. 2b). Darüber hinaus veränderte weder die Unterdrückung noch die Überexpression von SLC7A11 die Lebensfähigkeit der Zellen bei Glutaminmangel signifikant (ergänzende Abb. 2c). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass das Niveau der xc-Aktivität des Systems die Empfindlichkeit der Zellen gegenüber dem Glukoseentzug steuert.

Die Vorteile des xCT-Entzugs erfordern einen Glutamin-Stoffwechsel

Beim Glukoseentzug wird Glutamin zur primären Kohlenstoffquelle, und sein Stoffwechsel ist für das Überleben der Zellen entscheidend6,7,8. Einmal importiert, wird intrazelluläres Glutamin in Glutamat und weiter in α-Ketoglutarat, ein Zwischenprodukt des TCA-Zyklus, umgewandelt. Daher spekulierten wir, dass Zellen mit geringer xc-Systemaktivität besser in der Lage sein könnten, den intrazellulären Glutamatspiegel aufrechtzuerhalten und es in den TCA-Zyklus zu überführen. Um diese Idee zu testen, haben wir den intrazellulären Glutamatspiegel 1 Stunde nach Glukoseentzug direkt gemessen. SLC7A11-Knockdown-Zellen (Abb. 3a) und SLC3A2- oder SLC7A11-Genfallen-Mutanten (ergänzende Abb. 3a) behielten ihren intrazellulären Glutamatspiegel nach Glukoseentzug weitaus besser bei als Kontrollzellen. Umgekehrt wiesen SLC7A11-überexprimierende HeLa-Zellen niedrigere intrazelluläre Glutamatspiegel auf als Kontrollzellen (Abb. 3b). Im Einklang mit der bekannten Rolle des Systems xc- für die GSH-Synthese verringerte der SLC7A11-Knockdown den intrazellulären GSH-Spiegel in Hap1-Zellen, während SLC7A11-überexprimierende HeLa-Zellen höhere GSH-Spiegel als Kontrollzellen aufwiesen (ergänzende Abb. 3b).

Abbildung 3: Die überlebensfördernden Effekte des SLC7A11-Abbaus erfordern einen Glutamin-Stoffwechsel.

Als nächstes stellten wir die Frage, ob der Glutamin/Glutamat-Stoffwechsel für das verbesserte Zellüberleben von System xc–defizienten Zellen während des Glukoseentzugs wichtig ist. Wir testeten drei Verbindungen, Aminooxyacetat (AOA, Aminotransferase-Inhibitor) und Epigallocatechingallat (EGCG, Glutamat-Dehydrogenase-Inhibitor)21 , die Enzyme hemmen, die an der Umwandlung von Glutamin in Glutamat und dann in α-Ketoglutarat beteiligt sind (Abb. 3c). Nach der Behandlung mit EGCG zeigen Hap1-Zellen, bei denen SLC7A11 (Abb. 3d; ergänzende Abb. 3c) oder SLC3A2 (ergänzende Abb. 3c) gestört ist, unter Glukoseentzug keine erhöhte Lebensfähigkeit mehr, was darauf hindeutet, dass die Glutamatdehydrogenase (GDH) für diesen Effekt entscheidend ist. Da GDH Glutamat in α-Ketoglutarat umwandelt, fragten wir, ob α-Ketoglutarat die hemmende Wirkung von EGCG umkehren könnte. Tatsächlich wurde die hemmende Wirkung von EGCG durch eine Supplementierung mit Dimethyl-α-Ketoglutarat (dm-αKG), einer zellpermeablen Form von α-Ketoglutarat, vollständig aufgehoben (Abb. 3e; ergänzende Abb. 3d). Darüber hinaus verbesserte die Zugabe von dm-αKG während des Glukoseentzugs die Lebensfähigkeit der Zellen in Wildtyp- (WT) und Kontroll-shRNA-Hap1-Zellen (Abb. 3e; ergänzende Abb. 3d) sowie in SLC7A11-überexprimierenden HeLa-Zellen (Abb. 2d) erheblich, während die zusätzliche Zugabe von Glutamin in das Medium die Lebensfähigkeit der Zellen nicht signifikant verbesserte (ergänzende Abb. 3e). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Umwandlung von Glutamat in α-Ketoglutarat der schützenden Wirkung einer Unterbrechung des xc-Systems unter Glukose-Mangel-Bedingungen zugrunde liegt. Die fehlende Wirkung von BPTES oder AOA deutet darauf hin, dass GLS1 nicht die primäre Glutaminase in Hap1-Zellen ist und dass GDH und nicht die Aminotransferase für die Umwandlung von Glutamat in α-Ketoglutarat wichtig ist.

In Abwesenheit von Glukose wird die mitochondriale OXPHOS (als Hauptquelle der ATP-Synthese) für das Überleben wichtig. Durch Anaplerose füllt das aus Glutamin gewonnene α-Ketoglutarat die Zwischenprodukte des TCA-Zyklus auf, wodurch Substrate für die OXPHOS21 entstehen. Wir haben daher getestet, ob die Menge des Systems xc- die mitochondriale Atmung regulieren kann. In Gegenwart von Glukose ist die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) von SLC7A11-Knockdown-Hap1- oder überexprimierenden HeLa-Zellen vergleichbar mit der von Kontrollzellen (ergänzende Abb. 3f). Allerdings zeigen SLC7A11-Knockdown-Zellen nach 3 Stunden Glukose-Entzug eine höhere mitochondriale Atmung, während die OCR von SLC7A11-überexprimierenden HeLa-Zellen unter Glukose-Entzug niedriger ist als die von Kontrollzellen (Abb. 3f).

Neuere Arbeiten haben ergeben, dass α-Ketoglutarat, das aus verbrauchtem Glutamin gebildet wird, den oxidativen Stoffwechsel über den „Vorwärts“-TCA-Zyklus im Uhrzeigersinn oder die reduktive Carboxylierung über eine „umgekehrte“ TCA-Reaktion gegen den Uhrzeigersinn durchlaufen kann22,23,24. Der relative Fluss durch den vorwärtsgerichteten und den rückwärtsgerichteten TCA-Zyklus kann mit Hilfe der stabilen 13C-Isotopenmarkierung (C5) von extrazellulärem Glutamin und der Messung des Markierungseinbaus in TCA-Zyklus-Zwischenprodukte bestimmt werden22,23,25. Um festzustellen, ob die Modulation des Systems xc- den TCA-Zyklusfluss vorwärts oder rückwärts verändert, wurden SLC7A11-knockdown Hap1- oder überexprimierende HeLa-Zellen in Abwesenheit von Glukose und mit U-13C5-Glutamin kultiviert (siehe Methoden). Die Exposition gegenüber extrazellulärem U-13C5-Glutamin führte zu einer nahezu vollständigen Markierung (M+5) von intrazellulärem Glutamin und Glutamat (ergänzende Abb. 3g). Markiertes Glutamat gelangte über eine anaplerotische Reaktion zu α-Ketoglutarat in die TCA mit M+4-Markierung der vorwärtsgerichteten TCA-Zwischenprodukte Succinat, Fumarat, Malat und Citrat (Abb. 3g). Die M+5-Markierung von Citrat (reduktives TCA-Produkt) wurde in einem viel geringeren Ausmaß beobachtet (∼8:1 M+4:M+5 Citrat), was auf einen geringen Reverse-TCA-Fluss hinweist. Wichtig ist, dass das relative Ausmaß des vorwärtsgerichteten gegenüber dem rückwärtsgerichteten Fluss weder durch Knockdown noch durch Überexpression von SLC7A11 verändert wurde.

xCT reguliert die Abhängigkeit von Brustkrebszellen von Glukose

Um unsere Beobachtungen zu den negativen Auswirkungen des Systems xc- auf den Glutamin-Stoffwechsel und die Atmung zu erweitern, analysierten wir Genexpressionsdaten für 947 Krebszelllinien aus dem Projekt Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)26. Für jeden Krebstyp haben wir 15-20 Krebszelllinien in solche mit hoher und solche mit niedriger SLC7A11-Expression eingeteilt und eine Analyse der Genanreicherung zwischen diesen beiden Gruppen durchgeführt. Wir fanden heraus, dass Gene, die mit der OXPHOS zusammenhängen, in den Gruppen mit geringer SLC7A11-Expression angereichert waren, insbesondere in Lungen- (P-Wert=0,018) und Brustkrebszelllinien (P-Wert=0,039). Darüber hinaus zeigte die Analyse von 59 Brustkrebszellen eine deutliche und selektive negative Korrelation zwischen der Expression von SLC7A11 und mitochondrialen OXPHOS-Genen (ergänzende Abb. 4a,b). Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass die meisten Brustkrebszellen mit niedriger SLC7A11-Expression ein Expressionsprofil aufweisen, das mit einer Hochregulierung der OXPHOS-Maschinerie übereinstimmt, und umgekehrt.

Wir wählten zwei Brustkrebszelllinien, Hs578T und SK-BR-3, als repräsentativ für Zelllinien mit hoher bzw. niedriger SLC7A11-Expression (ergänzende Abb. 4a). In Übereinstimmung mit den CCLE-Expressionsdaten zeigten Hs578T-Zellen eine hohe Expression von SLC7A11 und eine aktive Freisetzung von Glutamat in das Medium, während SK-BR-3-Zellen eine niedrige SLC7A11-Expression und keine nachweisbare Freisetzung von Glutamat aufwiesen (Abb. 4a; ergänzende Abb. 5a). Wir bestimmten auch den Stoffwechselstatus von Hs578T- und SK-BR-3-Zellen, indem wir die Aktivitäten von OCR und Glykolyse (extrazelluläre Ansäuerungsrate (ECAR)) maßen. Hs578T-Zellen zeigten eine niedrigere OCR und ein niedrigeres OCR/ECAR-Verhältnis als SK-BR-3 (Abb. 4b,c), was darauf hindeutet, dass Hs578T-Zellen stärker von der Glykolyse abhängig sind als SK-BR-3. Die meisten Hs578T-Zellen starben, wie auch die Hap1-Zellen, bei Glukoseentzug (Abb. 4d), während SK-BR-3-Zellen resistent waren (Abb. 4e). Hs578T-Zellen, bei denen SLC7A11 abgereichert wurde, wiesen eine geringere Glutamatfreisetzung ins Medium auf (ergänzende Abb. 5a) und hielten den intrazellulären Glutamatspiegel unter Glukoseentzug effektiver aufrecht (ergänzende Abb. 5b). Wichtig ist, dass der Knockdown von SLC7A11 die Lebensfähigkeit von Hs578T-Zellen während des Glukoseentzugs deutlich verbesserte (Abb. 4d). Allerdings wiesen Hs578T-Zellen, denen SLC7A11 fehlte, höhere zelluläre ROS-Werte auf als die Kontrollzellen, was mit seiner Rolle bei der antioxidativen Abwehr in Einklang steht (ergänzende Abb. 5c). Umgekehrt wiesen Zellen, die SLC7A11 überexprimieren, niedrigere ROS-Werte auf (ergänzende Abb. 5c). Das Überleben von Hs578T-Zellen mit SLC7A11-Knockdown während des Glukoseentzugs wurde durch EGCG und BPTES aufgehoben, was wiederum bedeutet, dass die Produktion von α-Ketoglutarat aus Glutamat entscheidend ist (Abb. 4d). Wie erwartet, wurden die schädlichen Auswirkungen der EGCG- oder BPTES-Behandlung durch eine dm-αKG-Supplementierung vollständig rückgängig gemacht (Abb. 4d). Die unterschiedliche Wirkung von BPTES (vgl. Abb. 4d mit Abb. 3d) deutet darauf hin, dass GLS1 die primäre Glutaminase in Hs578T-Zellen ist, nicht aber in Hap1-Zellen.

Abbildung 4: Die Abreicherung von SLC7A11 fördert das Überleben von Brustkrebszellen nach Glukoseentzug.

Die Überexpression von SLC7A11 in SK-BR-3-Zellen erhöhte die Glutamatfreisetzung (ergänzende Abb. 5a) und reduzierte gleichzeitig die Fähigkeit, intrazelluläres Glutamat unter Glukose-defizienten Bedingungen zu erhalten (ergänzende Abb. 5b). Die Überexpression von SLC7A11 führte zu einem erheblichen SK-BR-3-Zelltod nach Glukoseentzug. Der Zelltod wurde durch Zugabe von dm-αKG gerettet, was darauf hindeutet, dass die Überexpression von SLC7A11 zu einem Mangel an α-Ketoglutarat unter Glukosemangel führt (Abb. 4e).

Hs578T-Zellen mit SLC7A11-Knockdown waren in der Lage, ihre Atmungsaktivität nach Glukoseentzug für längere Zeit aufrechtzuerhalten (ergänzende Abb. 5d). Umgekehrt zeigten SK-BR-3-Zellen, die SLC7A11 überexprimieren, unter dem gleichen Regime einen steilen Abfall der OCR. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass das System xc- in Brustkrebszellen den intrazellulären Glutamatfluss in den TCA-Zyklus reguliert und die Empfindlichkeit gegenüber Glukoseentzug erhöht.

Nrf2 wirkt stromaufwärts von SLC7A11

Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-like 2, NFE2L2) ist ein wichtiger Transkriptionsfaktor, der viele zytoprotektive Gene hochreguliert, die an oxidativem Stress beteiligt sind27. Da SLC7A11 ein bekanntes Zielgen von Nrf2 ist (siehe 27), untersuchten wir die Korrelation von Nrf2 und SLC7A11-Expression in Krebszellen. Die Nrf2-Expression korreliert positiv mit der SLC7A11-Expression in 59 Brustkrebszelllinien (R=0,5688) sowie in allen 947 Krebszelllinien (R=0,4306) in den CCLE-Expressionsdaten. Darüber hinaus zeigt die Expression des Zielgens Nrf2 eine hohe Korrelation mit der Expression von SLC7A11 in 947 Krebszelllinien. Die Korrelationskoeffizienten (R) zwischen SLC7A11 und NRF2-Zielgenen sind: NQO1 (+0,4179), GCLC (+0,3283), GCLM (+0,3944) und TXNRD1 (+0,4321).

Diese Korrelationen legen nahe, dass Nrf2 die SLC7A11-Expression in einer Untergruppe von Krebszellen unterstützt. Um diese Idee zu testen, schalteten wir Nrf2 in Hs578T- und MDA-MB-231-Brustkrebszellen aus, zwei Zellen, die SLC7A11 stark exprimieren. Die Ausschaltung von Nrf2 führte zu einem deutlichen Rückgang der SLC7A11-Expression (Abb. 5a,b,e) und zu einer verminderten Glutamatfreisetzung (Abb. 5c,f). Wichtig ist, dass Nrf2-depletierte Zellen eine stark verbesserte Lebensfähigkeit während des Glukoseentzugs aufwiesen (Abb. 5d,g). Auch diese Veränderung der Lebensfähigkeit hängt vom Glutamat-Stoffwechsel ab, da die Behandlung mit EGCG den überlebensfördernden Effekt des Nrf2-Knockdowns aufhob (Abb. 5d). Darüber hinaus reichte eine Supplementierung mit α-Ketoglutarat aus, um das Überleben der Zellen zu fördern, selbst in Gegenwart von EGCG.

Abbildung 5: Nrf2 reguliert die SLC7A11-Expression und das Überleben von Brustkrebszellen nach Glukoseentzug.

Um die Wirkung der Nrf2-Hochregulierung zu untersuchen, behandelten wir die Zellen mit Dimethylfumarat (DMF), einem zellpermeablen Nrf2-Aktivator28. Die Behandlung mit DMF führte bei MDA-MB-231-Zellen zu einer starken Induktion der SLC7A11-Expression und Glutamatfreisetzung (Abb. 5e,f). Darüber hinaus zeigten die mit DMF vorbehandelten Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen eine deutlich verringerte Lebensfähigkeit bei Glukoseentzug (Abb. 5g). Wir konnten Off-Target-Effekte ausschließen, indem wir zeigten, dass diese Ergebnisse der DMF-Behandlung sowohl von SLC7A11 als auch von Nrf2 abhängig waren (Abb. 5f,g). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Achse Nrf2-SLC7A11 den Glutamatstoffwechsel, die Abhängigkeit der Krebszellen von Glukose und ihre Fähigkeit, Glutamin als alternative Kohlenstoffquelle zu nutzen, reguliert. Wichtig ist, dass dies darauf hindeutet, dass die Anpassung an oxidativen Stress in Krebszellen die Nährstoffflexibilität beeinträchtigen kann, insbesondere durch die Verstärkung eines Glukosesucht-Phänotyps.

xCT reguliert die mitochondriale Funktion in mtDNA-mutierten Zellen

Unsere obigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass Zellen mit einer Hochregulierung des xc-Systems aufgrund von oxidativem Stress eine eingeschränkte Nährstoffflexibilität aufgrund eines beeinträchtigten Glutamin-Stoffwechsels aufweisen können. Die Hemmung der mitochondrialen Atmungskette kann reaktive Sauerstoffspezies erhöhen29,30. Wir fanden heraus, dass die Expression von SLC7A11 durch Medikamente induziert wurde, die die mitochondriale Funktion blockieren, insbesondere Rotenon und Oligomycin, die den Komplex I (NADH-Dehydrogenase) bzw. V (ATP-Synthase) der OXPHOS-Maschinerie hemmen (ergänzende Abb. 6a). In Übereinstimmung mit diesen pharmakologischen Ergebnissen wurde SLC7A11 in Cybridzellen mit homoplasmatischen mtDNA-Mutationen in der ND1-Untereinheit von Komplex I oder der Untereinheit ATP6 von Komplex V (NARP) hochreguliert (Abb. 6a)30,31. Die SLC7A11-Induktion war besonders ausgeprägt in der NARP-Zelllinie, die Berichten zufolge hohe ROS-Werte und eine Induktion des mitochondrialen ROS-Fängerenzyms MnSOD30 aufweist. Die SLC7A11-Induktion in den NARP-Zybridzellen war in hohem Maße von den Transkriptionsfaktoren Nrf2 und Atf4 abhängig (ergänzende Abb. 6b) und konnte durch die Behandlung mit dem Antioxidans N-Acetylcystein unterdrückt werden (ergänzende Abb. 6c).

Abbildung 6: Die Hemmung des xc-Systems verbessert die Lebensfähigkeit und die mitochondriale Funktion von Cybrid-Zellen mit mtDNA-Mutationen.

Wir untersuchten, ob diese kompensatorischen Veränderungen in der xc-Expression des Systems den zellulären Stoffwechsel in den Cybrid-Zellen beeinflussen. Im Einklang mit der höheren Expression von SLC7A11 wiesen die ND1- und NARP-Zybride niedrigere intrazelluläre Glutamatspiegel auf (Abb. 6b). Die Hemmung des xc-Systems durch die Ausschaltung von SLC7A11 oder einen starken Inhibitor, Erastin, erhöhte das intrazelluläre Glutamat in ND1- und NARP-Zellen. In ähnlicher Weise wurde das intrazelluläre α-Ketoglutarat, ein Produkt des Glutamatstoffwechsels, durch die SLC7A11-Inhibition ebenfalls erhöht (ergänzende Abb. 6d). Es ist seit langem bekannt, dass Zellen mit OXPHOS-Defekten in galaktosehaltigem Medium schlecht überleben, was einen höheren Bedarf an OXPHOS als Quelle für die ATP-Erzeugung erzwingt32. Die ND1- und NARP-mutierten Zybride waren im Gegensatz zu den isogenen WT 143B-Zellen nicht in der Lage, in galaktosehaltigem Medium zu überleben (Abb. 6c; ergänzende Abb. 6e). Die Lebensfähigkeit der ND1- und NARP-Zybride in galaktosehaltigem Medium wurde jedoch durch die Ausschaltung von SLC7A11 oder die Behandlung mit Erastin stark verbessert. Der Effekt war bei den NARP-Zybriden am stärksten ausgeprägt, die eine viel stärkere Induktion von SLC7A11 aufwiesen (Abb. 6c).

Dieser Anstieg der Lebensfähigkeit der Zellen korrelierte mit einer deutlichen Normalisierung der mitochondrialen Morphologie. Unsere Gruppe hat zuvor berichtet, dass WT-Zellen ihre Mitochondrien unter Medienbedingungen, die eine erhöhte OXPHOS-Aktivität erfordern, verlängern, während Zellen mit mtDNA-Mutationen ihre Mitochondrien stattdessen fragmentieren33. In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis zeigten ND1- und NARP-Zybride nach 24 Stunden Galaktosekultur eine deutliche mitochondriale Fragmentierung. Im Gegensatz dazu zeigten Zybride mit SLC7A11-Knockdown oder Erastin-Behandlung eine deutliche Verlängerung der Mitochondrien, wenn die Kohlenstoffquelle im Medium von Glukose auf Galaktose umgestellt wurde (Abb. 6d; ergänzende Abb. 6f). Die Ausschaltung von SLC7A11 änderte nichts an den Konzentrationen verschiedener mitochondrialer Dynamikproteine, einschließlich Opa1, Mfn1 und Drp1 (ergänzende Abb. 6g). Darüber hinaus zeigten die SLC7A11-Knockdown-Zellen eine höhere Atmungsaktivität als die Zellen mit der Kontrollmutante (Abb. 6e). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Hemmung des Systems xc- in mtDNA-mutierten Zybriden die mitochondriale Morphologie und Atmung verbessert, was zu einem deutlich verbesserten Überleben in Galaktose-Medium führt.

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