B Fotoreceptory

Degenerace fotoreceptorů jsou nejčastější formou slepoty v západním světě a zahrnují ztrátu zraku v důsledku dystrofie a/nebo smrti fotoreceptorů sítnice. Tyto patologie lze zhruba rozdělit na stavy, které zpočátku postihují tyčinkové fotoreceptory, jako je retinitis pigmentosa (RP), a na ty, které zpočátku postihují čípkové fotoreceptory, jako je makulární degenerace.141 Degenerace fotoreceptorů může být sice nepřímo způsobena také primárními defekty RPE, který plní důležitou funkci ve zdraví a homeostáze fotoreceptorů, ale tomuto tématu se budeme věnovat v pozdější části (viz oddíl II.C).

Fotoreceptory jsou vysoce polarizované smyslové buňky, které se skládají z vnitřního segmentu (IS), jenž je spojen s vnějším segmentem (OS) vysoce modifikovaným řasinkou (obr. 5).189 Ve zralých fotoreceptorech jsou proteiny, které jsou nezbytné pro růst a udržování OS fotoreceptorů a také pro fototransdukci, transportovány podél polarizovaných mikrotubulů z bazálního IS do apikálního OS. Fotoreceptory jsou podobné epiteliálním buňkám v tom, že jejich povrch je rozdělen buněčnými spoji na apikální a bazolaterální doménu. Jejich centrozomy se nacházejí na apikálním povrchu, zatímco jádra na bazálním.190 Správný vývoj a následné udržení fotoreceptorů obratlovců závisí na vytvoření správné apikálně-bazální polarity a také na funkci transportního mechanismu. Není proto překvapivé, že z více než 100 genetických lokusů, o nichž je známo, že způsobují degenerace fotoreceptorů u obratlovců, jich většina ovlivňuje strukturu a funkci OS.191

Obr. 5. Jaké jsou příčiny degenerace fotoreceptorů? Struktura tyčinkových a čípkových fotoreceptorů. Fotoreceptorové buňky se skládají z vnějšího segmentu, který obsahuje membránové disky vázané na zrakový pigment. Vnitřní segment je polarizované buněčné tělo fotoreceptoru, kde bazálně sídlí jádro a apikálně vzniká řasinka, která zasahuje do OS. Synaptický terminál vytváří synaptická spojení s interneurony sítnice a zprostředkovává zrakový vstup.161,188

Genetické screeningy u zebřiček osvětlily molekulární základy těchto buněčných funkcí izolací mutantů, u nichž je vývoj a/nebo údržba fotoreceptorů defektní.24,192,193 U jednoho takového mutanta, mozaikových očí (moe), bylo zjištěno, že obsahuje rozšířené apikální rysy fotoreceptorů.20,21 Lokus moe kóduje protein obsahující doménu FERM, který tvoří komplex s proteiny Crumbs, u nichž se zase ukázalo, že jsou rozhodující pro apikálně-bazální polaritu u drozofily i obratlovců.194-196 Je zajímavé, že mutace v lidském ortologu Crumbs, CRB1, jsou spojeny s dystrofiemi fotoreceptorů sítnice, jako je RP 12197 a Leberova kongenitální amauróza (LCA1; cit.198,199 ). Jiné mutanty zebřiček, například nagie oko (nok) a heart and soul (has), nejenže fenotypicky kopírují fenotyp mutanta moe, ale proteiny, které kódují (Pals1, resp. PKCi), také biochemicky interagují s Moe.20 Navíc morfolinové vyřazení crb2b, paralogu zebřičky Crumbs, vede ke zmenšení velikosti IS.14 Tyto studie tedy začaly odhalovat roli komplexu Crumbs ve vývoji a onemocnění fotoreceptorů obratlovců.

Tvorba správné apikálně-bazální polarity závisí nejen na správné funkci determinantů buněčné polarity, ale také na jejich transportu a lokalizaci. Fotoreceptory v sítnici mutantní ale oko (ako) hromadí ve svých buněčných tělech apikální determinanty Pals1 a PKCλ a vykazují rozsáhlý zánik fotoreceptorů v pozdní fázi vývoje.19 Lokus ako kóduje podjednotku p50 komplexu dynactin, která plní důležitou úlohu při transportu nákladu podél mikrotubulů jako součást dyneinového motorického komplexu.200 U dalšího mutanta, mikre oko (mok), který má mutaci v dynactinu-1, je degenerace sítnice alespoň částečně způsobena chybnou lokalizací jader fotoreceptorů. Na rozdíl od mutantů ako nejsou překvapivě chybně lokalizovány apikální determinanty, jako jsou Crumbs a aPKCλ, což naznačuje, že degenerace u těchto mutantů není způsobena ztrátou buněčné polarity. Experimentální chybná lokalizace jádra nadměrnou expresí dyneinového motoru vedla k buněčné smrti fotoreceptoru, což podporuje roli jaderné polohy při přežívání fotoreceptoru.201 Zatímco defekty jaderné polohy u mok fotoreceptorů mají zřejmě buněčně autonomní roli, zdá se, že při degeneraci mok hrají roli i jiné nebuněčné komponenty. Mozaikové analýzy odhalily, že mutantní fotoreceptory vykazují více než 2,5násobné zvýšení přežití, pokud jsou umístěny do prostředí divokého typu.17 Toto zjištění naznačuje, že zdraví a přežití fotoreceptorů závisí na environmentálních signálech od okolních buněk. Tato zjištění jsou v souladu s defekty spojenými s některými lidskými degeneracemi, jako je RP, kde počáteční defekt rodopsinu specifického pro tyčinky nakonec vede ke ztrátě tyčinek i čípků.202

Transport z buněčného těla do OS je také důležitý pro nahrazení složek OS, které jsou ztraceny v důsledku neustálé fagocytózy OS fotoreceptorů překrývajícím RPE.203 Ve fotoreceptorech, stejně jako v řasinkách, probíhá transport procesem známým jako intraflagelární transport (IFT) a mutace v genech složek IFT, jako jsou ift57, ift80, ift88 a ift172, vedou u zebřiček k atrofii OS a/nebo úplné ztrátě OS.24-26 Mutace v genu elipsa, který kóduje protein, o němž se předpokládá, že usnadňuje IFT35 , vedou k časné ztrátě fotoreceptorů22 , zatímco morfolinové vyřazení několika podjednotek retrográdního motoru IFT dyneinu-2 zdůraznilo význam IFT pro správné prodlužování OS a zrakovou funkci.204 Fotoreceptorové degenerace související s defektní IFT jsou jedny z mnoha řasinkových fenotypů spojených s Bardet-Biedlovým syndromem (BBS)205 a další studium funkce složek IFT u zebřiček by mohlo být užitečné pro lepší pochopení molekulárních příčin očních patologií souvisejících s BBS.

Zatímco mutanti dosud popsaní v této části byli izolováni v genetických screenech využívajících především histologické metody ke zjištění defektů fotoreceptorů, další byli izolováni v behaviorálních screenech.15,82,206,207 Jeden takový screening využil schopnosti zebřiček projevovat chování závislé na zraku již ve 3 dpf (dnech po oplození). Brockerhoff a spol.15 poprvé použili test optokinetické odpovědi (OKR) na mutagenizovaných embryích ke zjištění defektů zrakových funkcí. Druhý test zahrnoval použití záznamů elektroretinogramu (ERG) ke zjištění, zda izolované mutace ovlivňují funkci vnější sítnice. Na základě tohoto screeningu bylo izolováno 18 mutantů, u nichž bylo zjištěno snížení zrakové funkce. Jeden z nich, no optokinetic response a (noa), neměl v 5 dpf (dnech po oplození) žádné hrubé abnormality fotoreceptorů, ale byl slepý, letargický a předčasně uhynul. Analýza mutace noa odhalila nedostatek podjednotky komplexu pyruvátdehydrogenázy (PDH), která reguluje produkci energie v buňkách. Mutantní linie noa byla použita jako model pro studium deficitu PDH (OMIM 245348), lidské poruchy, která stejně jako u modelu zebřičky vede ke slepotě, neurologickým vadám a předčasné smrti.16 Vzhledem k tomu, že současná léčba deficitu PDH u lidí vedla k omezenému úspěchu, využili Taylor a spol. mutanty noa k testování ketogenní diety, která u omezeného počtu lidských pacientů prokázala určitý úspěch při zmírňování příznaků deficitu PDH. Podávání této speciální diety obnovilo normální chování u mutantů noa, což zdůrazňuje potenciál studia terapie nedostatku PDH u mutantní linie noa.

U jiného mutanta, no optokinetic response f (nof), byla zjištěna mutace v α podjednotce transducinu čípku (Tcα), G-proteinu potřebného pro fototransdukci. U lidských pacientů trpících onemocněním známým jako achromatopsie (OMIM 139340) jsou mutace v Tcα příčinou ztráty barevného vidění. U mutantů nof probíhá vývoj čípků normálně, jsou však až 1000× méně citliví na světlo, jak bylo zjištěno záznamem jednotlivých fotoreceptorů. Rozsáhlá analýza reakcí čípků na světlo odhalila, že zbytková fototransdukce je závislá na světle, ale nezávislá na transducinu. Vliv Ca+ 2, který je důležitý pro adaptaci fotoreceptorů na světlo a o němž se dříve předpokládalo, že je řízen transducinem, byl u mutantů nof stále detekovatelný. Tato studie tedy odhalila, že část influxu Ca+ 2 v čípkových fotoreceptorech může být nezávislá na transducinu.

V samostatném screeningu byly provedeny dominantní mutace, které způsobují degeneraci fotoreceptorů u dospělých zebřiček, s cílem izolovat genetické mutanty, které by mohly být později použity ke studiu lidské dědičné noční slepoty, jako je RP.37,38 V případě RP stojí za touto skupinou poruch mnoho genetických lokusů. V době provádění screeningu však byla pouze asi polovina případů dominantní RP spojena s konkrétními mutacemi.38 Li a spol. proto provedli screening mutagenizovaných dospělých zebřiček s využitím známé únikové reakce, kterou ryby vykazují. Nedostatek takové reakce na ohrožující narážku byl interpretován jako ztráta zraku, což bylo později potvrzeno pomocí záznamů ERG. Celkem bylo izolováno sedm heterozygotních mutantů (noční slepota a, b, c, d, e a f), z nichž šest vykazovalo degeneraci fotoreceptorů.38,39,208,209 Čtyři z těchto šesti mutantů byli jako homozygoti embryonálně letální, což naznačuje, že mutované geny, které jsou základem fenotypů fotoreceptorů, mají jiné kritické funkce během embryonálního vývoje. Toto zjištění zdůrazňuje význam takovýchto screeningů pro identifikaci dominantních mutací, které by nemusely být snadno izolovány při tradičním screeningu kvůli časné embryonální letalitě.

.