3.06.4.1.1.1 Saccharomyces jäst

Förra studier har visat att Saccharomyces jäst kan jäsa xylulosa till etanol, om än inte effektivt. Teoretiskt sett saknar Saccharomyces-jäst alltså bara enzymet/enzymerna för att omvandla xylos till xylulos. Som beskrivits ovan omvandlar bakterier xylos till xylulosa med ett enda enzym som inte kräver kofaktorer (figur 3). Däremot krävde jästens system för omvandling av xylos till xylulosa två enzymer som inte är metaboliskt idealiska enligt beskrivningen ovan. Inledningsvis försökte nästan tio olika laboratorier världen över att klona en bakteriell xylosisomeras-gen till jäst. Ho et al. vid Purdue University var den första gruppen som lyckades klona xylosisomerasgenen från Escherichia coli. Det protein som syntetiserades i jäst av den klonade bakteriella genen hade dock ingen xylosisomerasaktivitet.

En andra metod var att klona XR- och XD-generna från P. stipitis till Saccharomyces-jäst. Dessa enzymers kinetik och reaktionens termodynamiska jämvikt gynnar dock produktionen av xylitol i stället för etanol. I början av 1990-talet rapporterade tre grupper (Kotter, Ciriacy och kollegor vid universitetet i Düsseldorf, Tantirungkij och kollegor vid universitetet i Osaka samt Hahn-Hägerdal och kollegor vid Lunds universitet) att de lyckats klona XR- och XD-gener till Saccharomyces-jäst för att göra den kapabel att jäsa xylos. Den rekombinanta jäst som utvecklades av dessa grupper fermenterade dock xylos extremt långsamt och producerade lite etanol; den viktigaste metaboliska produkten var xylitol.

Ho gruppen antog att överuttryckning av det naturliga xylulokinaset (XK) tillsammans med XR och XD från P. stipitis skulle förbättra flödet av xylos genom ämnesomsättningen till etanol genom att sänka den intracellulära koncentrationen av xylulos. Eftersom xylulokinas katalyserar en irreversibel reaktion mot etanolproduktion (figur 3) kommer hög xylulokinasaktivitet att resultera i låga koncentrationer av xylulosa. Detta är önskvärt eftersom jämvikten i den XD-katalyserade reaktionen gynnar xylitol, och låga koncentrationer av xylulos i stationärt tillstånd behövs för att styra det metaboliska flödet i riktning mot etanolproduktion . Kloning av dessa tre gener gjorde det dessutom möjligt att kontrollera deras uttryck i cellen. Under cellens naturliga uttryckskontrollsystem induceras deras uttryck av närvaron av xylos och hämmas av glukos. Den rekombinanta jäst som blir resultatet skulle kunna samjäsa glukos och xylos samtidigt till etanol utan den långa fördröjningsperioden mellan jäsningen av glukos och xylos, vilket skulle vara ytterst önskvärt för den industriella tillverkningen av etanol.

År 1989 rapporterade Ho-gruppen vid Purdue för första gången om kloningen av xylulokinasegenen från Saccharomyces jäst. Därefter ersatte Ho-gruppen DNA-sekvenserna uppströms från de strukturella XR-, XD- och XK-generna med uppströmssekvenser från glykolytiska gener som innehåller effektiva konstitutiva promotorer. De resulterande XR-, XD- och XK-generna klonades på en plasmid med högt kopieringsnummer 2μ och den resulterande plasmiden, pLNH32, användes för att transformera en stam av industriell Saccharomyces-jäst av vildtyp som är känd för att vara överlägsen för etanolproduktion med användning av stärkelse (glukos) som råvara. År 1993 rapporterade samma grupp om den framgångsrika utvecklingen av den rekombinanta Saccharomycesjästen 1400 (pLNH32) som kunde fermentera höga koncentrationer av xylos nästan fullständigt till etanol med mycket lite xylitol som biprodukt. Dessutom kunde den resulterande jästen samjäsa glukos och xylos till etanol utan någon större fördröjningsperiod mellan jäsningen av dessa två sockerarter, även om jäsningshastigheten för xylos är långsammare än för glukos (figur 4). Därefter rapporterades detaljerna för konstruktion och utveckling av 1400 (pLNH 32) . Sedan dess har Ho-gruppen fortsatt att förbättra jästen med olika nya metoder som beskrivs nedan.

Figur 4. (Till vänster) Saccharomyces jäststam 1400 transformerad med moderplasmidet pLNH32 som antingen inte innehåller några XR-, XD- eller XK-gener eller innehåller endast XR och XD, men inte XK, som används för att fermentera en blandning av glukos och xylos. (Höger) 1400 jäst som transformerats med plasmid pLNH32 som innehåller klonade XR-, XD- och XK-gener. Jästen användes för att fermentera glukos och xylos under identiska förhållanden som de resultat som beskrivs i den vänstra figuren. De klonade generna i dessa plasmider modifierades och konstruerades på samma sätt som beskrivs i referens 9.

Den 2 μ plasmid, pLNH32, som innehåller den klonade XR-XD-XK genen är en bred värdplasmid som är utformad för att kunna transformera alla Saccharomyces jäststammar, inklusive industriell vildtyp Saccharomyces jäst. En sådan plasmid kan användas för att undersöka bättre värdar för produktion av cellulosaetanol. Ho-gruppen har också utvecklat en unik ny teknik för genintegration som gör det möjligt att effektivt integrera flera gener i jästkromosomen i flera kopior. Denna teknik är lätt att utföra och garanterar nästan att de gener som klonats på integrationsplasmiden och transformerats till värdjästcellerna kan integreras i värdgenomet i så många kopior som önskas för att ge den bästa aktiviteten (figur 5). Denna integrationsteknik användes för att utveckla den stabila xylosfermenterande 1400-stammen 1400 (LNH-ST) genom att först integrera XR-XD-XK-generna tillsammans som en kassett i jästkromosomen i tillräckligt många kopior tills den resulterande jästen fermenterade xylos med högsta effektivitet (figur 6). Den för närvarande bästa stam som utvecklats av Ho-gruppen, 424A (LNH-ST), valdes ut bland 10 olika stammar av Saccharomyces-jäst genom att först transformera varje stam med 2 μ-plasmidet pLNH32 för att se till att dessa stammar kunde fermentera xylos samt samfermentera glukos/xylose på ett effektivt sätt i närvaro av pLNH32, och sedan integrera gener i kromosomerna hos de utvalda jäststammarna för att utveckla den ”stabila jästen” med hjälp av denna nya integreringsteknik. Samfermentering av glukos/xylose med 424A (LNH-ST) visas i figur 7.

Figur 5. Demonstration av den stegvisa integrationen av flera kopior av XR-XD-XK-gener i kromosomerna hos Saccharomyces jäststam 259 med den metod som beskrivs i Ho et al. Jäst i olika integrationsstadier användes för att fermentera glukos och xylose under identiska förhållanden för att visa hur integrationen av dessa gener fortskrider: a) I det inledande skedet av integrationen, b) 25 % av slutförandet, c) 50-75 % av slutförandet, d) efter slutförandet av integrationen. Att integrationen är avslutad återspeglas av att celler från integrationsprocessen producerar samma fermenteringsresultat under tillräckligt lång tid.

Figur 6. Samfermentering av glukos och xylos med 1400 (LNH-ST) som innehåller flera kopior av XR-XD-XK-gener integrerade i jästkromosomerna enligt metoden av Ho et al. .

Figur 7. Samfermentering av glukos och xylos med den rekombinanta Saccharomyces-stammen 424A (LNH-ST) som innehåller flera kopior av XR-XD-XK-gener som integrerats i jästkromosomerna i Saccharomyces-stam 424A enligt metoden från Ho et al. Detta är den bästa Ho-Purdue-jäst som utvecklats vid Purdue University före 2007 och som för närvarande tillhandahålls industrin för produktion av cellulosaetanol.

Om en rekombinant mikroorganism används för storskalig industriell produktion, t.ex. för produktion av etanol, är det nödvändigt att integrera de gener som ska klonas i värdkromosomerna av två viktiga skäl. Det ena är att om de klonade generna integreras i värdkromosomerna med en tillförlitlig metod kan de klonade generna bibehållas på värdkromosomen utan att det krävs användning av särskilda kemikalier, medier, antibiotika och tillsatser. Kravet på kemikalier eller antibiotika för att bibehålla egenskaperna ökar inte bara kostnaden för kemikalierna utan också kostnaderna och svårigheterna i samband med den regulatoriska godkännandeprocessen och saneringen av eventuella avloppsvatten. Även i närvaro av ett selektivt medel kan plasmider med högt antal kopior, t.ex. pLNH32, som används för att klona in generna i värdcellerna kanske inte hålla för storskalig industriell verksamhet . Ho-gruppen visade att den stabila jäst som utvecklats med hjälp av det nya integrationssystemet, 1400 (LNH-ST), kunde upprätthålla kontinuerlig jäsning av hydrolyserad majsstubbe till etanol i en pilotanläggning, medan samma jäststam som innehöll plasmidet 1400 (pLNH32) inte kunde göra det.

Stammen 424A (LNH-ST) och andra stabila stammar, 1400 (LNH-ST) och 259 (LNH-ST), som utvecklats med hjälp av den nya integrationstekniken, har alla validerats av andra och visat sig vara hållbara och effektiva för produktion av cellulosaetanol med hydrolyzater från olika lignocellulosalager. Stammen 424A (LNH-ST) har också använts industriellt för produktion av cellulosaetanol från jordbruksrester i en demonstrationsanläggning sedan 2004.

Den rekombinanta jäst som utvecklats av Hahn-Hägerdal har förbättrats avsevärt genom kloning av olika tilläggsgener, bland annat genom kloning av xylulokinasgenen efter att Ho-gruppen vid Purdue University visat att ett ökat uttryck av denna inhemska gen förbättrar avkastningen av etanol från xylos .

Den jäst som utvecklats av Ho-gruppen vid Purdue finns tillgänglig för industriell produktion av cellulosisk etanol. Den kommer förmodligen att ha goda chanser att lyckas, eftersom det är en industriell etanolproducerande jäst och den har testats i stor omfattning. På senare tid har Purduegruppen fortsatt att förbättra stammen genom att få den att samfermentera arabinos med de fyra andra sockerarterna (glukos, xylos, mannos och galaktos) och genom att göra den mer resistent mot etanol och ättiksyra.

Trots att det tidiga försöket att utveckla en xylose isomeras-baserad Saccharomyces xylose-fermenterande jäst inte lyckades och att en effektiv XR/XD-baserad konstruerad xylose-fermenterande jäst hade utvecklats, har intresset för att utveckla en xylose isomeras-baserad xylose-fermenterande jäst fortsatt under årens lopp, delvis på grund av att denna väg inte har en redoxobalans. År 2009 konstruerade Brat et al. xylosefermenterande S. cerevisiae med hjälp av xyloseisomeras från Closteidium phytofermentans. År 2009 rapporterade Cargill också om utvecklingen av en jäststam som inte är Saccharomyces och som uttrycker xylosisomeras och som effektivt kan fermentera en blandning av glukos och xylos vid lågt pH och i närvaro av 1 % ättiksyra.

Även om arabinos endast förekommer i små mängder i biomassa från gräs som en del av GAX hemicellulosa, innehåller ett fåtal speciella biomassakällor, t.ex. majsfibrer, relativt stora mängder arabinos. Trots detta är det idealiskt att de cellulosaetanolproducerande mikroberna kan fermentera alla fem olika sockermolekyler som finns i cellulosabiomassa, eftersom återvinning av processströmmar inom en industriell process kan öka koncentrationen av mindre viktiga komponenter .

Mekanismen för arabinosmetabolismen i mikroorganismer är lika komplicerad som xylosmetabolismen. Även här skiljer sig mekanismen för arabinosmetabolismen i jäst från bakterier . I likhet med xylosmetabolismen gynnar jästmetabolismen inte anaerob metabolism. Nyligen har Hahn-Hägerdal och medarbetare vidareutvecklat sin xylosefermenterande Saccharomyces-gäst för att samfermentera arabinos med xylose och andra sockerarter genom svampens l-arabinosväg . Den resulterande manipulerade jästen kunde dock fortfarande inte jäsa arabinos till en betydande mängd etanol, men kunde omvandla en liten mängd arabinos till arabitol.