Abstract

Wnt5a är involverad i aktivering av flera icke-kanoniska Wnt-signalvägar, som kan hämma eller aktivera den kanoniska Wnt/β-catenin-signalvägen på ett receptorkontextberoende sätt. Wnt5a-signalering är kritisk för att reglera normala utvecklingsprocesser, inklusive stamcellernas självförnyelse, proliferation, differentiering, migration, adhesion och polaritet. Dessutom framstår en felaktig aktivering eller hämning av Wnt5a-signalering som en viktig händelse i cancerutvecklingen, med både onkogena och tumörundertryckande effekter. Nya studier visar att Wnt5a-signalering är involverad i regleringen av normal och cancerstamcellers självförnyelse, cancercellers proliferation, migration och invasion. I den här artikeln går vi igenom de senaste rönen om de molekylära mekanismerna och rollerna för Wnt5a-signalering i stamceller i embryogenesen och i det normala eller neoplastiska bröstet eller ovariet, och belyser att Wnt5a kan ha olika effekter på målcellerna beroende på de ytreceptorer som målcellen uttrycker.

1. Introduktion

Stamceller, inklusive embryonala stamceller och stamceller som identifierats i vuxna vävnader, har en förmåga till självförnyelse och till att generera mer differentierad avkomma. Den embryonala stamcellen härstammar från blastocystens inre cellmassa, är pluripotent och kan därmed generera alla kroppens vävnader . Stamceller i vuxna vävnader befinner sig i specialiserade nischer, där de integrerar olika miljömässiga och inneboende signalinflöden som bestämmer cellens öde och upprätthåller vävnadshomeostasen.

Wnt-faktorer är en grupp av dessa signalmolekyler som agerar på stamceller inom stamcellsnischen för att bidra till att upprätthålla deras förmåga till självförnyelse. Wnt-faktorer är kända för att binda till olika receptorer för att omvandla den kanoniska signalvägen eller icke-kanoniska signalvägar som reglerar olika biologiska aktiviteter . Den kanoniska Wnt-signalvägen inleds när Wnt-faktorer binder till receptorer från Frizzled-familjen (Fzd) och receptorrelaterade proteiner med lågdensitetslipoproteinreceptor 5/6 coreceptorer (LRP5/6) för att bilda komplex. Detta resulterar i rekrytering av Axin och dishevelled (Dvl) till plasmamembranet och störning av β-catenin-nedbrytningskomplexet, vilket leder till ackumulering av β-catenin i cytoplasman, som sedan translokeras till kärnan, där det binder till T-cell factor (TCF)/lymphoid enhancer factor (LEF)-familjen och aktiverar transkriptionen av kanoniska Wnt-målgener . Däremot aktiverar flera Wnt-faktorer β-cateninoberoende vägar (icke-kanoniska Wnt-signalvägar), kända som Wnt-Ca2+-vägen eller planar cellpolarity (PCP)-vägen, som verkar för att styra cellmigrationen under embryogenesen .

Nitton utsöndrade cysteinrika glykoproteiner från Wnt-familjen har identifierats hos möss och människor. Under den tidigare embryogenesen hos däggdjur eller underhållet av den vuxna vävnadshomeostasen uttrycks dessa Wnt-faktorer och deras receptorer dynamiskt för att aktivera lämplig signalering, för att säkerställa den rätta balansen mellan proliferation och differentiering. Störning av Wnt-signalering med avvikande uttryck av Wnt-faktorer, deras receptorer eller nedströms signalmolekyler kan leda till utveckling av flera cancerformer hos människor. Eftersom förmågan att initiera tumörer verkar vara begränsad till en liten population av tumörceller som har förmågan till självförnyelse och differentiering, kallas de ofta cancerstamceller (CSC, eller tumörinitierande celler) . Ännu viktigare är att embryonala stamceller, normala stamceller och CSC:s biologi är starkt sammankopplade. Detta framgår av det faktum att molekylära signaler (t.ex. Wnt-signalering) som definierar och upprätthåller embryonala stamceller eller vuxna normala stamceller ofta aktiveras på ett felaktigt sätt i tumörceller.

Ett huvudfokus i denna översikt är den roll som Wnt5a-signalering via olika ytreceptorer spelar för regleringen av stamceller i embryogenesen och i det normala eller neoplastiska bröstet eller äggstockarna, eftersom det redan finns flera utmärkta översikter som täcker aspekter av Wnt-signalering i koloncancer . Vi har sammanfattat de senaste framstegen när det gäller de signalvägar som aktiveras av Wnt5a och som utgör en gåta för den rationella utformningen av läkemedel som syftar till att utplåna CSC (eller tumörinitierande celler) i tumörer samtidigt som normala vävnaders funktion skonas.

2. Wnt5a-signalvägen

Wnt5a är en icke-kanonisk Wnt-ligand som är evolutionärt konserverad och spelar en viktig roll i utvecklingen. Homozygota Wnt5a knockoutmöss har perinatal dödlighet på grund av utvecklingsdefekter . Tidigare studier visade att Wnt5a kan interagera med Fzd2 och receptortyrosinkinasliknande orphanreceptor 2 (ROR2) för att aktivera Rac1 i en β-cateninoberoende väg. Nyligen visade vi att Wnt5a inducerade heterooligermisering av receptortyrosinkinasliknande orfana receptor 1/2 (ROR1/ROR2), som rekryterade och aktiverade guaninutbytesfaktorer (GEF), som i sin tur aktiverade RhoA respektive Rac1, vilket förbättrade leukemicellers kemotaxis och proliferation . Å andra sidan, som en annan verkan av Wnt5a, konkurrerade den med Wnt3a om att binda till Fzd2, och hämmade därigenom Wnt3a-beroende LRP6-fosforylering och β-catenin-ackumulering in vitro och i intakta celler, vilket hämmar Wnt3as förmåga att inducera ackumulering av β-catenin, och därmed hämmar β-cateninberoende Wnt-signalering .

Wnt5a kunde emellertid också aktivera den β-cateninberoende vägen och inducera sekundär axelbildning i Xenopusembryon som samuttryckte Fzd5-receptorn . Därefter fann en annan studie att Wnt5a kunde hämma den kanoniska Wnt/β-catenin-signaleringen i celler som uttryckte ROR2, men även inducera kanonisk Wnt/β-catenin-signalering i celler som uttryckte Fzd4 och LRP5 . En enda Wnt5a-ligand kan alltså ha olika effekter på celler beroende på receptorns tillgänglighet. Därför dikterar det cellulära sammanhanget effekten av Wnt5a. Detta kan förklara observationen att Wnt5a kan utöva antingen onkogena eller tumörundertryckande effekter i olika cancerformer.

3. Wnt5a-signalering i embryonala stamceller

Wnt-banan (som utlöses antingen av Wnt3a, Wnt5a eller Wnt6) skulle också kunna vara involverad i det kortsiktiga upprätthållandet av pluripotens hos både mus- och humana ES-celler . Det första beviset för detta gavs av en studie av en farmakologisk hämmare av glykogensyntaskinas-3 (GSK3) som kunde modulera GSK3-aktiviteten, vilket ledde till aktivering av den kanoniska β-catenin-signaleringen och ökad stabilitet av c-Myc . Wnt5a och Wnt6 konstaterades senare produceras av embryonala fibroblastmatningsceller, som kunde hämma differentieringen av ES-celler i musen på ett serumberoende sätt. Direkt aktivering av β-catenin, med hjälp av konstitutivt aktivt β-catenin (S33Y) utan att störa uppströmskomponenterna i Wnt/β-catenin, återskapade helt effekten av Wnts på ES-celler. Viktigt är att Wnt5a också är en potent hämmare av β-cateninfosforylering och därmed stabiliserar β-catenin . Dessa data tyder på att Wnt5a signalerar för att stabilisera β-catenin för att ytterligare aktivera Wnt/β-catenin-kanonisk signalering i ES-celler av mus. Slutligen kan Wnt/β-catenin-vägen uppreglera mRNA för STAT3, en känd regulator av ES-cellers självförnyelse , vilket tyder på en molekylär mekanism där Wnt/β-catenin-vägen verkar för att förhindra ES-celldifferentiering genom konvergens med LIF/JAK-STAT-vägen på STAT3-nivå . Vilka ytreceptorer som är inblandade i aktiveringen av Wnt5a/β-catenin-signalering i ES-celler och om icke-kanonisk Wnt-signalering också kan aktiveras av Wnt5a i ES-celler förblir dock oklart.

4. Wnt5a-signalering på stamceller i normala bröstkörtel- och äggstocksvävnader

En rad bevis stöder betydelsen av Wnt för upprätthållandet av bröststamceller i bröstkörteln . Wnt5a inducerar dock inte β-catenin/TCF-transaktiveringsaktivitet i bröstkörtelvävnad. Cellerna i bröstkörteln är hyperproliferativa hos Wnt5a knockout-möss, medan kanalutvidgningen hämmas i närvaro av ektopisk Wnt5a . Dessa fenotyper är motsatsen till aktiveringen av den kanoniska Wnt/β-catenin-signaleringen. Därför kan Wnt5a begränsa och kontrollera bröstkörteltillväxten genom att undertrycka Wnt/β-catenin-signalering. Det är då förbryllande att denna hämning av bröstkörteltillväxten inte observerades i transgena MMTV-Wnt5a-stammar .

I Drosophila germarium sker förändrad Wingless (Wg; flugans Wnt-homolog) signalering i ovariala könsstamceller (GSC) genom avlägsnande av dess regulatorer, t.ex. dishevelled, armadillo, Axin och shaggy; detta orsakar förlust av GSC, påverkar follikelcellsproliferationen och inducerar differentiering . Användning av villkorlig genmålning för Wnt5a i ovariella granulosaceller (GC) resulterar i kvinnlig subfertilitet i samband med ökad follikelatresi och minskad ägglossningsfrekvens. Ytterligare studier visade att Wnt5a reglerar sina målgener inte genom att signalera via Wnt/Ca2+ eller den plana cellpolaritetsvägen, utan snarare genom att hämma den kanoniska vägen, vilket leder till att både β-catenin- och cAMP responsive element binding (CREB)-proteinnivåerna minskar via en glykogensyntaskinas-3β-beroende väg i ovariala granulosaceller (GC). Dessa data tyder på att Wnt5a krävs för normal utveckling av äggstocksfolliklar och kan motverka gonadotropinresponsivitet i granulosaceller genom att undertrycka kanonisk Wnt/β-catenin-signalering .

Sammanfattningsvis är det troligt att Wnt5a mest troligt undertrycker β-catenin-signalering i normala stamceller i bröstkörtlar och äggstocksvävnader, även om Wnt5a kan aktivera β-catenin-signalering i embryonala stamceller. Huruvida denna skillnad beror på receptorer som uttrycks olika i embryonala stamceller jämfört med stamceller i normala bröstkörtlar eller äggstockar måste undersökas ytterligare.

5. Wnt5a-signalering i bröstcancerstamceller

Wnt-faktorer kan påverka olika bröstepitelceller och inducera en expansion av stamceller under tumörutveckling . Dessutom var avvikande β-cateninuttryck förknippat med basal, trippelnegativ bröstcancer och dåligt kliniskt resultat . Förekomsten av avvikande Wnt-signalering i specifika bröstcancer-subtyper dikteras med mindre sannolikhet av aktivering orsakad av somatiska mutationer. Mutationer har inte identifierats i CTNNNB1, som kodar för β-catenin, och mutationer inom APC har identifierats i mindre än 20 % av proverna från bröstcancerpatienter . Ytterligare undersökningar behövs för att fastställa vilka Wnt-ligander och receptorer som orsakar denna avvikande Wnt/β-catenin-signalering.

Nyligen fann man i en studie på MMTV-Wnt1-musens primära celler att både rekombinant Wnt3a och rekombinant Wnt5a kunde öka bildandet av mammosfärer in vitro. Wnt5a-inducerad bildning av mammosfärer orsakades inte av en ökning av kanonisk Wnt/β-catenin-signalering, utan medierades istället av icke-kanonisk Wnt-signalering som kräver receptortyrosinkinas ROR2 och aktiviteten hos Jun N-terminalt kinas, JNK, i musbröstcancerceller . Detta stämmer överens med observationen att patienter med bröstcancer som uttrycker ROR2 hade en betydligt kortare total överlevnad än de med tumörer som saknar uttryck av ROR2 . Att tysta ROR2 i humana bröstcancercellinjer minskade dock både β-cateninberoende och β-cateninoberoende mål , vilket tyder på att ROR2 kan vara involverad i både β-cateninberoende och β-cateninoberoende Wnt-signalvägar. ROR1 verkar övervägande uttryckas av mindre väldifferentierade tumörer som har hög potential för återfall och metastaser och som också uttrycker markörer som är förknippade med epitelial-mesenkymal övergång (EMT) . Omvänt kan tystande av ROR1 i humana bröstcancercellinjer dämpa uttrycket av gener som är associerade med EMT och försämra deras migration/invasionsförmåga in vitro och deras metastatiska potential in vivo . Nyligen rapporterade Chien et al. att uttrycket av ROR1 kan vara en oberoende negativ prognostisk faktor hos patienter med trippelnegativ bröstcancer . Huruvida ROR1 kan ha en liknande effekt som ROR2 på bröstcancerstamceller och vilka signalvägar som aktiveras av ROR1 i bröstcancerstamceller är fortfarande okänt.

I en studie på en musmodell av ErbB2-inducerad bröstcancer fann man motstridiga bevis för effekten av Wnt5a på mänskliga bröstcancerstamceller. Under ErbB2-inducerad brösttumorigenesering förlorade basala tumörinitierande celler (TIC), som uppvisade ökad tumörskapacitet jämfört med motsvarande luminal progenitorer, företrädesvis Wnt5a-uttrycket, vilket fastställdes genom analys av transkriptprofilering. Dessutom främjade Wnt5a-heterozygositet tumörmultiplicitet och lungmetastasering. Som ett TGFβ-substrat inducerade luminalcellsproducerat Wnt5a en feed-forward-slinga som aktiverade SMAD2 på ett RYK- och TGFβR1-beroende sätt för att begränsa expansionen av basala TIC på ett parakrint sätt, vilket är en potentiell förklaring till den undertryckande effekten av Wnt5a på brösttumorigenesen . I denna musmodell är det fortfarande osäkert om den kanoniska Wnt/β-catenin-signalering aktiverades eller om Wnt5a också inhiberade den kanoniska β-catenin-signalering för att undertrycka expansionen av basala TIC.

Vinberglaboratoriet studerade immortaliserade humana bröstepitelceller (mMECs) och fann att både de kanoniska och icke-kanoniska Wnt-vägarna samverkade med TGFβ-signalering inte bara för att bibehålla utan också, vilket är intressant, för att inducera stamcellsegenskaper . Dessutom var det bara de icke-kanoniska Wnt-liganderna Wnt5a och Wnt16 som uppreglerades i stamliknande celler i förhållande till icke-stamliknande celler. Det är därför möjligt att Wnt5a eller Wnt16 kan aktivera antingen den kanoniska eller icke-kanoniska Wnt-signalvägen på ett receptorkontextberoende sätt i mänskliga bröstcancerstamceller.

6. Wnt5a-signalering i stamceller för äggstockscancer

Samma som för bröstcancer är Wnt5as effekt på äggstockscancer också kontroversiell. En tidig studie av primära äggstockstumörer () som visade att låga nivåer av Wnt5a i äggstockscancer i förhållande till normal äggstock är förutsägande för ett dåligt resultat . Ektopiskt uttryck av Wnt5a hämmar proliferationen av den humana ovariecancercellinjen OVCAR5 både in vitro och in vivo i ortotopiska musmodeller för ovariecancer. Mekanistiskt antagoniserar ektopiskt uttryck av Wnt5a i OVCAR5 kanonisk Wnt/β-catenin-signalering och inducerar cellulär senescens genom att aktivera histonrepressor A (HIRA)/promyelocytisk leukemi (PML)-senescensvägen .

I motsats till detta har man i studier som omfattar ett stort antal patienter funnit att uppreglering av Wnt5a var förknippat med en relativt dålig prognos . Jämfört med frekvensen av Wnt1-uttryck i äggstockscancer hittades Wnt5a oftare hos patienter med malign epitelial äggstockscancer (80 % av totalt 38) . Noterbart är att patienter med äggstockscancer som uttrycker höga nivåer av både Wnt1 och Wnt5a hade en betydligt lägre sannolikhet för långtidsöverlevnad än patienter med äggstockscancer som inte uttryckte Wnt1 eller Wnt5a. Dessutom är Wnt5a vanligt förekommande i ascitesvätska som erhållits från kvinnor med äggstockscancer , vilket tyder på att det bidrar till äggstockstumörens mikromiljö. Detta stämmer överens med observationen att höga nivåer av Wnt5a är förknippade med ökad risk för metastasering .

Aktiverande mutationer i den kanoniska Wnt-vägen är sällsynta i äggstockscancer, med undantag för endometrioid äggstockscancer . Bidraget från kanonisk Wnt-signalering till progression av äggstockscancer är fortfarande okänt. Omvänt visar studier om icke-kanonisk Wnt/β-catenin-signalering att Wnt5a kan reglera EMT, migration eller metastasering av äggstockscancer via icke-kanoniska signalvägar . I överensstämmelse med denna föreställning har nyligen genomförda studier visat att uttrycket av ROR1, en receptor för Wnt5a, uttrycktes i hög grad av höggradig och mindre differentierad äggstockscancer och var förknippat med en relativt kort sjukdomsfri överlevnad och total överlevnad jämfört med äggstockscancer som inte uttryckte ROR1 . Äggstockscancer som uttrycker höga nivåer av ROR1 hade genuttryckssignaturer som var förknippade med CSC i äggstockarna . Dessutom verkar tumörcellernas uttryck av ROR1 korrelera med uttrycket av ALDH1 och förmågan att bilda tumörspheroider in vitro (båda markörer för CSC). Behandling av primära ovariala patientavledda xenograft-tumörceller (PDX), som uttrycker höga nivåer av ROR1, med ett anti-ROR1 mAb (UC-961 eller cirmtuzumab), hämmade bildandet av sfäroider och migration in vitro samt graftning och återgraftning i immunbristande möss, vilket tyder på att ROR1 kan påverka självförnyelsen av stamceller från ovarialcancer. Ytterligare studier behövs för att fastställa om Wnt5a är ansvarig för det inflytande som ROR1 uppenbarligen har på ovariecancerstamcellernas biologi.

7. Avslutande anmärkningar

Wnt5a kan spela en viktig roll i embryonala stamceller och organutveckling. Wnt5as roll i cancerstamceller är dock varierande och komplex. Den kan undertrycka eller främja tumörutveckling. För att klarlägga molekylära mekanismer som driver förändrat cellbeteende behövs ytterligare forskning om vävnadsspecifikt uttryck av specifika receptorer och coreceptorer. Särskilt behövs en mer detaljerad förståelse av det komplexa samspelet mellan Wnt5a och specifika receptorer som uttrycks i embryonala stamceller och som kan återuttryckas eller återaktiveras i cancerstamceller, men inte i normala somatiska vävnader (t.ex, ROR1 och ROR2), kan möjliggöra utveckling av specifika hämmare som blockerar avvikande signalering och därmed gynnar patienternas överlevnad.

Intressekonflikter

Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter i samband med publiceringen av denna artikel.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av Breast Cancer Research Foundation (NIH Grant P01-CA081534), California Institute for Regenerative Medicine, National Natural Science Foundation of China (NSFC, Grant no. 2016YFC009159) och Science and Technology Foundation of Shenzhen, China (Shenzhen Peacock Innovation Team Project, Grant no. KQTD20140630100658078).